RP-HPLC-UV法測定半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)中黃芩苷的含量*

閆麗莉，宋小雪，陳忠新，張文娓，田 明

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040）

經(jīng)典名方是中醫(yī)藥上千年沉淀的瑰寶，經(jīng)歷后代的傳承使用證明確有很好的臨床療效，且應(yīng)用廣泛，使用安全，因此，古代經(jīng)典名方的開發(fā)利用成為我輩中醫(yī)藥人的研究之重[1]。半夏瀉心湯出自于東漢時期著名醫(yī)師大家張仲景的《傷寒論》，也是國家下發(fā)的首批100個經(jīng)典名方目錄之一，該方在古代書籍中記載頗多，現(xiàn)代應(yīng)用十分廣泛、療效確切，在治療急慢性胃腸炎方面有很好的療效[2-4]，本文確定半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)中黃芩苷含量的測定方法，為經(jīng)典名方半夏瀉心湯中有效物質(zhì)的傳遞關(guān)系及后續(xù)新制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)[5，6]。

1 實驗部分

1.1 儀器

Thermo-Sciencetific Ultimate3000高效液相色譜儀（Thermo公司）；FA2004電子分析天平（力辰科技有限公司）；MP5200H超聲波清洗機（陜西鵬展科技有限公司）。

1.2 試劑和藥材

甲醇（色譜純 中國Dikma公司）；純化水；H3PO4（AR天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）。

110715-201720黃芩苷（中國藥品生物制品檢定所）；半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)（自制）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件的確定 色譜柱選用反向C18柱，流動相0.22%磷酸水和甲醇（53∶47），流速1mL·min-1，檢測波長280nm[7]。

1.3.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，置于潔凈干燥的10mL容量瓶中，加甲醇制成每1mL含有0.13mg的溶液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品提取方法的考察

2.1.1 提取方法的考察與結(jié)果分析 精密稱取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)0.3g，共3份，分別置于干燥的100mL具塞錐形瓶中，精密量取甲醇50mL加入其中，密塞，置于超聲清洗機中，分別超聲處理10、20、30min后取出，搖勻，定量濾紙濾過，蒸干，將殘渣用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至50mL容量瓶中，即得。結(jié)果見表1。

表1 供試品提取方法結(jié)果Tab.1 Result of extraction methods of samples

由表1可知，當(dāng)超聲時間范圍在10～30min內(nèi)，各提取時間結(jié)果RSD值為1.67%（＜3%），表明黃芩苷的含量在3個提取時間內(nèi)差異不明顯，為確保將物質(zhì)基準(zhǔn)中黃芩苷的含量提取完全，故將超聲提取時間定為20min。

2.1.2 供試品提取方法的確定 精密稱取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)0.3g，置于干燥潔凈的100mL具塞錐形瓶中，精密量取甲醇50mL，密塞，置于超聲清洗機中，超聲處理20min，取出，搖勻，定量濾紙濾過，蒸干，將殘渣用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至50mL容量瓶中，即得。

2.2 專屬性試驗

2.2.1 供試品溶液制備 同2.1.2項下處理方法

2.2.2 對照品溶液制備 同1.3.2項下對照品制備方法

2.2.3 陰性對照溶液制備 稱取處方中除黃芩外的藥材（共計74g），按實驗前期半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)確定的最佳制備工藝，制備出缺黃芩的物質(zhì)基準(zhǔn)，按

2.2.3項下方法制備黃芩陰性對照溶液。

2.2.4 試驗方法 將2.2.1、2.2.2、2.2.3項下的溶液分別用0.45μm有機微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置每次自動進樣10μL，依照1.3.1色譜條件測定，測定并記錄峰面積，專屬性考察結(jié)果見表2，液相色譜圖見圖1。

表2 專屬性考察結(jié)果Tab.2 Result of specificity investigations

圖1 液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram

由表2、圖1可知，黃芩苷的出峰時間約為10min左右，峰形良好且相近保留時間內(nèi)無其它雜質(zhì)峰干擾，表明該黃芩苷測定方法準(zhǔn)確有效。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍的確定

取2.2.2項下黃芩苷對照品溶液適量，經(jīng)0.45μm有機微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，按照表3所示體積分別進樣，分別記錄峰面積，結(jié)果見表3，線性圖見圖2。

表3 黃芩苷線性關(guān)系考察表Tab.3 Investigation Table of Linear Relations of Baicalin

圖2 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品線性圖Fig.2 Linear diagram of standard Baicalin

由表3、圖2可知，將含量及峰面積為橫縱坐標(biāo)進行線性回歸，結(jié)果表明，黃芩苷含量在0.26～1.56μg之間線性關(guān)系良好，得回歸方程為∶Y=60.999X-1.3235，R2=0.9998。

2.4 精密度試驗

取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)0.3g，精密稱定，按照2.2.1項下的方法制備供試品溶液，設(shè)置每次自動進樣10μL，連續(xù)進樣6次，記錄6次黃芩苷峰面積，計算RSD值。結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗結(jié)果Tab.4 Precision test results

由表4可知，精密度6次進樣RSD值為0.74%（RSD＜3%），表明本臺高效液相色譜儀精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗

精密稱取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)各0.3g，共6份，按2.2.1項下方法處理得到供試品溶液，分別用0.45μm有機微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置每次自動進樣10μL，依照1.3.1色譜條件測定其含量及RSD值，結(jié)果見表5。

表5 黃芩苷重復(fù)性試驗結(jié)果Tab.5 Repeatability test results of Baicalin

由表5可知，重復(fù)性測定6批樣品含量RSD值為1.05%（RSD＜5%），表明此測定方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)0.3g，按2.2.1項下方法處理得到供試品溶液，分別用0.45μm有機微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置序列及儀器方法，每間隔2h自動進樣10μL，連續(xù)監(jiān)測12h內(nèi)黃芩苷含量情況，計算RSD值。結(jié)果見表6。

表6 黃芩苷穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.6 Stability test results of Baicalin

由表6可知，12h內(nèi)，所測定黃芩苷含量較穩(wěn)定，RSD值為0.51%（＜3%），說明此處理方法得到的供試品溶液在12h內(nèi)測定均穩(wěn)定。

2.7 加樣回收試驗

精密稱取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)各0.15g，共6份，分別加入提前配制完成的2.3mg·mL-1的黃芩苷對照品溶液1mL，按2.2.1項下方法處理得到供試品溶液，分別用0.45μm有機微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置每次自動進樣10μL，依照1.3.1色譜條件測定，測定回收率及RSD值，結(jié)果見表7。

表7 黃芩苷加樣回收試驗結(jié)果Tab.7 Test result of Baicalin sampling recovery

由表7可知，6批次的供試品回收率均在95%～105%之間，表明供試品處理方法加樣回收率符合要求，準(zhǔn)確穩(wěn)定。

2.8 15批樣品含量測定

精密稱取15批次半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)各0.3g，按2.2.1項下方法處理得到供試品溶液，分別用0.45μm有機微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置每次自動進樣10μL，依照1.3.1色譜條件測定，測定其含量及RSD值，結(jié)果見表8。

表8 15批樣品含量測定結(jié)果Tab.8 Content determination result of 15 batches of samples

由表8可知，15批次物質(zhì)基準(zhǔn)所測得黃芩苷每劑含量范圍在389.84～482.35mg之間，波動原因可能是由于不同批次和產(chǎn)地之間藥材含量不同，考慮到不同因素的影響，最終確定半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)黃芩苷含量為309.23～574.28mg·劑-1，此結(jié)果的確定也符合《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報資料要求》的要求（含量測定的波動范圍一般不超過均值的70%～130%，合理確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)質(zhì)控項目質(zhì)量要求上下限）。

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜儀連用紫外檢測器方法對經(jīng)典名方半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)中黃芩苷含量測定方法進行確定，并通過方法學(xué)考察確定該測定方法穩(wěn)定、高效、準(zhǔn)確、重復(fù)率高，此項研究為經(jīng)典名方的開發(fā)與利用提供實驗基礎(chǔ)，為中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展及弘揚添磚加瓦[8]。