葡萄根際原核生物多樣性及其與土壤因子的相關(guān)性研究

吳志浩，趙鵬麗，陳以杰，夏運(yùn)生，張俊鋒，杞麗紅，張仕穎

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界各地廣泛種植的水果，品種繁多[1-2]。其果實(shí)可作為水果鮮食或制成葡萄干、葡萄酒等[2]；其籽?？墒秤茫ㄈ缙咸炎押龋?，可提煉制成葡萄籽油，可制成化妝品（如葡萄籽潔面乳），還可入藥；葡萄皮渣還可作肥料和飼料[3]。因此，葡萄具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

我國(guó)葡萄種植歷史悠久，擁有豐富的葡萄種質(zhì)資源。云南是我國(guó)葡萄主產(chǎn)地之一[2]，而建水、賓川、彌勒、元謀等地為云南葡萄主要產(chǎn)區(qū)[4]，主栽品種為紅提、夏黑，還有少量的陽(yáng)光玫瑰、克倫森等[5]。研究表明，某些微生物會(huì)影響葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)[6]，例如葡萄根系土壤微生物群落就與其生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。一方面葡萄根系釋放的分泌物將影響根際微生物群落的多樣性；另一方面，根際微生物群落又影響葡萄根系對(duì)養(yǎng)分的吸收利用。研究表明，接種葉桿菌屬（Phyllobacterium）微生物不僅能提高草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)，還能增加草莓果實(shí)中的維生素C含量[7]，并且根際微生物在促進(jìn)植物生長(zhǎng)[8]、增強(qiáng)植物抗病性[9]、降解土壤污染物[10]等方面也發(fā)揮著重要作用。目前，關(guān)于葡萄種植條件的研究主要集中在土壤水分[11]、光照[12]、肥料[13-14]等方面，關(guān)于葡萄根際原核生物多樣性及其對(duì)促進(jìn)葡萄生長(zhǎng)、提高葡萄抗逆性等方面的研究報(bào)道較少。因此，筆者以云南建水、賓川、彌勒和元謀主產(chǎn)區(qū)的葡萄根際土壤為研究對(duì)象，運(yùn)用16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，獲得葡萄根際土壤原核生物信息，進(jìn)而探究云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤主要原核生物種類及其與土壤因子的相關(guān)性，為深入了解葡萄根際土壤原核生物、改善葡萄根際土壤環(huán)境提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

土壤樣品采自云南4個(gè)主要葡萄產(chǎn)區(qū)：建水（JS）、賓川（BC）、彌勒（ML）和元謀（YM），采集了27份不同種植區(qū)的葡萄根際土壤，土壤樣品信息見表1。

表1 云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤樣品基本情況

采用5點(diǎn)取樣法對(duì)土壤樣品進(jìn)行采集。在一塊葡萄地內(nèi)隨機(jī)挑選5棵葡萄植株，在距離葡萄主干 25 cm 左右的位置，用鋤頭挖出0～30 cm深的葡萄根系，將附著于葡萄根際的土壤取下收集，把5棵葡萄的根際土壤混合成一個(gè)樣品，用無(wú)菌袋收集后做相應(yīng)標(biāo)記，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分土壤樣品放置于-80℃冰箱，用于提取土壤總DNA；其余自然風(fēng)干，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1土壤因子測(cè)定土壤因子采用常規(guī)方法測(cè)定。土壤pH值參照NY/T 1377—2007中的方法測(cè)定，電導(dǎo)率參照HJ 802—2016中的方法測(cè)定，土壤全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量參照《土壤農(nóng)化分析》[15]中的方法測(cè)定。

1.2.2土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序用于測(cè)定土壤原核生物的樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提取土壤總DNA，以提取的土壤總DNA為模板，采用引物515F （5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）/907R （5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTT-3'）對(duì)27個(gè)土壤樣品進(jìn)行16S rRNA 基因的V4-V5區(qū)PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010和美吉云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄根際土壤的理化性質(zhì)

27份葡萄根際土壤樣品的理化性質(zhì)如表2所示。從表2可以看出，來(lái)自建水、賓川、彌勒和元謀4個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)的27份葡萄土壤樣品理化性質(zhì)存在差異。各項(xiàng)指標(biāo)的范圍分別是：酸堿度（pH值）4.80～8.30、有機(jī)質(zhì)（OM）11.74～105.56 g/kg、堿解氮（AN）47.74～325.07 mg/kg、有效磷（AP）11.13～133.75 mg/kg、速效鉀（AK）117.89～1227.50 mg/kg、全氮（TN）0.86～3.70 g/kg、全磷（TP）0.50～3.60 g/kg、全鉀（TK）3.64～21.38 g/kg、電導(dǎo)率（EC）135～2 800 μs/cm。其中除BC_RSC3土壤為偏堿性土，JS_GC3、BC_OC2、BC_OC3、BC_RSC2、ML_OC1、YM_GC2和YM_GC3土壤為偏中性土，其他土壤樣品均為偏酸性土。葡萄土壤樣品間EC值差異較大，ML_RSC2的EC值最高達(dá)到了2 800 μs/cm，而BC_RSC3的EC值最低僅有135 μs/cm。ML_OC3的土壤有機(jī)質(zhì)含量達(dá)到105.56 g/kg，JS_GC1、BC_OC2、ML_RSC1、ML_RSC2和YM_GC3的土壤中速效鉀含量高，超過了1 000 mg/kg，表明部分葡萄土壤的有機(jī)質(zhì)和速效鉀投入量很大，可能與葡萄高投入高產(chǎn)出的種植模式有關(guān)。

表2 云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤樣品理化性質(zhì)

2.2 測(cè)序信息統(tǒng)計(jì)和α多樣性分析

通過16S rRNA測(cè)序分析，從27個(gè)樣本中共獲得1 270 251條有效序列，平均有效序列長(zhǎng)度為376 bp。在所有樣品中，以97%的相似度劃分原核生物OUT，其數(shù)量為6 175個(gè)。土壤原核生物多樣性可以通過α多樣性指數(shù)表示。如表3所示，27份云南葡萄土壤樣品原核生物群落多樣性指數(shù)Shannon、Simpson、ACE、ChaoCoverage的變化范圍分別為：3.67～6.51、0.003 7～0.108 8、781～3 140、760～3 172和97.16%～99.50%。其中，27份云南葡萄土壤樣品的覆蓋度（Coverage）均大于97%，表明樣品測(cè)序量滿足分析要求。對(duì)ACE、Chao、Shannon和Simpson值的分析發(fā)現(xiàn)，27個(gè)葡萄土壤樣品中，ML_OC3的原核生物OTU數(shù)目和物種數(shù)最多，BC_OC1原核生物OTU數(shù)目和物種數(shù)最少。BC_RSC2原核生物群落多樣性最高，ML_OC3群落分布最均勻，而JS_RSC2原核生物多樣性和豐富度最低。

表3 27份葡萄土壤樣品原核生物多樣性指數(shù)

2.3 土壤樣品的原核生物群落

圖1和圖2分別為門和屬水平上的葡萄根際土壤原核生物群落結(jié)構(gòu)。27份葡萄根際土壤具有不同的原核生物群落組成。所有葡萄根際土壤樣品都含有變形菌門（Proteobacteria，11.63%～61.78%）、放線菌門（Actinobacteriota，8.73%～33.84%）、綠彎菌門（Chloroflexi，2.68%～37.98%）、酸桿菌門（Acidobacteriota，3.72%～17.80%）、厚壁菌門（Firmicutes，1.83%～30.88%）、浮游菌門（Planctomycetota，1.07%～6.93%）、擬桿菌門（Bacteroidota，0.05%～6.96%）、Gemmatimonadota（0.006%～5.81%）、粘 球 菌 門（Myxococcota，0.06%～2.83%）、Nitrospirota（0.03%～1.42%）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria，0.004%～2.97%）和unclassified_k__norank_d__Bacteria（0.09%～1.83%）的微生物，其中變形菌門和放線菌門是葡萄根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌門。

圖1 云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤原核生物群落結(jié)構(gòu)（門水平）

在27份葡萄根際土壤樣本中，總共有68個(gè)屬的相對(duì)豐度大于2%（圖2）。所有土壤樣本中都檢測(cè)出芽孢桿菌屬（Bacillus，0.89%～21.31%）、酸桿菌屬（Acidibacter，0.15%～7.55%）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter，0.03%～8.55%）、Bryobacter（0.30%～2.15%）、康奈斯氏桿菌屬（Conexibacter，0.007%～6.05%）、Gaiella（0.003%～4.33%）、分枝桿菌屬（Mycobacterium，0.05%～4.08%）、Nitrolancea（0.007%～2.47%）、類諾卡氏屬（Nocardioides，0.03%～2.96%）、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus，0.14%～2.35%）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium，0.003%～2.28%）、Pseudaminobacter（0.003%～2.29%）、Pseudolabrys（0.11%～4.13%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，0.06%～3.64%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces，0.003%～2.22%）、norank_f__67-14 （0.12%～5.05%）、norank_f__Gemmataceae（0.32%～4.36%）、norank_f__JG30-KF-CM45 （0.03%～4.50%）、norank_f__norank_o__Acidobacteriales（0.007%～5.50%）、norank_f__norank_o__Elsterales（0.08%～3.48%）、norank_f__norank_o__Gaiellales（0.19%～10.53%）、norank_f__norank_o__norank_c__Alphaproteobacteria（0.003%～2.65%）、norank_f__norank_o__ norank_c__TK10（0.04%～2.15%）、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales（0.02%～8.42%）、norank_f__Roseiflexaceae（0.003%～2.19%）、norank_f__SC-I-84（0.01%～3.99%） 和unclassified_f__Microbacteriaceae（0.003%～3.73%）。推測(cè)這27個(gè)共有屬可能是云南地區(qū)葡萄根際土壤的核心原核生物。

圖2 云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤原核生物群落結(jié)構(gòu)（屬水平)

2.4 葡萄根際土壤原核生物群落比較

采用主成分分析（PCA）比較云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤原核生物群落結(jié)構(gòu)的相似性，結(jié)果如圖3所示，PC1和PC2軸分別解釋了樣本原核生物群落差異的43.03%和17.18%。其 中，ML_RSC1、BC_OC1、YM_GC1和JS_RSC2與其他樣品距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明這4個(gè)樣品的土壤原核生物群落結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于其他23個(gè)樣品，可能受其環(huán)境因素的影響。其余23個(gè)葡萄根際土壤樣品聚在一起，說(shuō)明除個(gè)別樣品外，大多數(shù)葡萄根際土壤樣品具有相似的原核生物群落結(jié)構(gòu)。

圖3 云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤原核生物多樣性主成分分析（PCA）

2.5 土壤因子相關(guān)性研究

為了解土壤因子相關(guān)性，以屬水平的原核生物群落作為物種數(shù)據(jù)，進(jìn)行冗余分析，結(jié)果如圖4所示，2個(gè)排序軸總共解釋了27個(gè)云南葡萄根際土壤樣本中原核生物群落組成的30.68%，其中第一排序軸解釋了18.84%，第二排序軸解釋了11.84%?；赟pearman相關(guān)性檢驗(yàn)，分析樣本中相對(duì)豐度排名前30的原核生物及其土壤因子相關(guān)性，結(jié)果如圖5所示。在豐度前30的原核生物屬中，有14個(gè)菌屬與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），分別為Conexibacter、norank_f__Chitinophagaceae、Acidipila、Acidothermus、Bryobacter、norank_f__norank_o__Acidobacteriales、Mycobacterium、unclassified_f__Acetobacteraceae、Acidibacter、Pseudolabrys、norank_f__norank_o__Elsterales、norank_f__norank_o__Gaiellales、norank_f__JG30-KF-AS9和Chujaibacter；3個(gè)菌屬與土壤pH值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。僅有1個(gè)菌屬與土壤有機(jī)質(zhì)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。有3個(gè)菌屬與土壤堿解氮呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；2個(gè)菌屬與土壤堿解氮呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。有1個(gè)菌屬與土壤有效磷呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；4個(gè)菌屬與土壤有效磷呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。有2個(gè)菌屬與土壤速效鉀呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；3個(gè)菌屬與土壤速效鉀呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。有1個(gè)菌屬與土壤全氮呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；1個(gè)菌屬與土壤全氮呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。有1個(gè)菌屬與土壤全磷呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；2個(gè)菌屬與土壤全磷呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。有4個(gè)菌屬與土壤全鉀呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；5個(gè)菌屬與土壤全鉀呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。有5個(gè)菌屬與土壤EC值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），1個(gè)菌屬與土壤EC值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。在云南葡萄根際土壤中，土壤pH值（r2=0.343，P＜0.05）是影響土壤原核生物群落的主要因素。

圖4 云南葡萄根際土壤原核生物與土壤因子RDA分析

圖5 云南地區(qū)葡萄土壤原核生物（屬水平）與土壤因子Spearman相關(guān)性分析熱圖

3 討 論

研究結(jié)果顯示，變形菌門和放線菌門是葡萄根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌門，這與高彥婷等[16]關(guān)于葡萄根際微生物群落的研究結(jié)果相似。根際微生物除了受到植物種類影響外，還會(huì)受到土壤理化性質(zhì)、肥料種類和形態(tài)的影響[17-18]。通過葡萄根際原核生物及土壤因子相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)土壤pH值顯著影響葡萄根際土壤原核生物群落構(gòu)成（P＜0.05），這與阿根廷圣胡安省的葡萄根際土壤的結(jié)果類似[19]。因此，pH值是影響葡萄根際原核生物群落的關(guān)鍵因素，對(duì)維持葡萄根際土壤原核生物群落的穩(wěn)定性起到關(guān)鍵作用。

葡萄根際核心原核生物對(duì)保證葡萄的生長(zhǎng)具有重要作用。該研究從27份葡萄根際土壤樣品中找到27個(gè)核心原核生物屬，其中15個(gè)核心原核生物能明確鑒定到屬。Bacillus中的一些菌株能產(chǎn)生脫落酸、吲哚乙酸、赤霉素[9]；部分菌株對(duì)葡萄白腐病菌[20]、灰霉病菌[21]和霜霉病[22]具有抑制作用。此前有研究證明，Bacillus存在于葡萄根際土壤中[23]，并且Taあner等[24]提出Bacillus是綠葉蔬菜土壤的核心微生物成員。Acidibacter能夠分解蛋白質(zhì)，攝取土壤酸性物質(zhì)，在維持土壤生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用[25]。Arthrobacter的部分菌株具有控制細(xì)菌和真菌病原體的潛力，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)[26]。Bryobacter可與病原菌競(jìng)爭(zhēng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，該菌是促進(jìn)玉米高產(chǎn)的關(guān)鍵類群。Conexibacter能夠?qū)⑾跛猁}還原成亞硝酸鹽，可在土壤-植物系統(tǒng)的氮循環(huán)中發(fā)揮作用，且Conexibacter可以增強(qiáng)土壤微生物群落的穩(wěn)定性[28]。Gaiella可通過提高養(yǎng)分利用率促進(jìn)植物生長(zhǎng)[29]。Mycobacterium的部分菌株可以產(chǎn)生IAA，還能促進(jìn)種子萌發(fā)[30-31]，且此前有研究表明它是水稻根際土壤的核心微生物成員[32]。Nitrolancea是一種亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，可將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，在土壤-植物系統(tǒng)的氮循環(huán)中發(fā)揮作用[33]，另外，Nocardioides的部分物種還可代謝一系列甲硫代三嗪除草劑[34]，加速除草劑的降解。Paenibacillus的一些菌株對(duì)Phaeomoniella chlamydospora（葡萄埃斯卡病的主要病原菌）具有拮抗活性[35]；部分菌株具有固氮能力，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)[36]。Phenylobacterium是一種固氮菌，能增加土壤氮素含量[37]。譚偉等[38]研究表明，使用除草劑會(huì)降低葡萄的果實(shí)品質(zhì)，而Pseudaminobacter是一種廣泛存在于土壤中的細(xì)菌，它的成員能夠利用除草劑作為碳源[39]，從而消除除草劑對(duì)葡萄果實(shí)的影響。Pseudolabrys存在于富含碳?xì)浠衔锏耐寥乐?，已被確定為碳?xì)浠衔锏慕到鈩40]。從葡萄根際土壤篩選出來(lái)的Streptomyces屬部分菌株（如Streptomyces anulatusS37），具有促進(jìn)葡萄藤生長(zhǎng)以及誘導(dǎo)植株產(chǎn)生對(duì)病原體抗性的能力[41]，此前Lee等[42]也提出Streptomyces屬菌株是番茄根際土壤的核心微生物成員。Thermoactinomyces屬的部分菌株能產(chǎn)生IAA促進(jìn)作物生長(zhǎng)[43]。以上相關(guān)報(bào)道，充分說(shuō)明該研究確定的15個(gè)核心原核生物是葡萄生長(zhǎng)的關(guān)鍵原核生物組群。此外，該研究發(fā)現(xiàn)還有12個(gè)屬未能明確鑒定到屬名，但它們卻是云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤中的共有屬，其在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

該研究在云南建水、賓川、彌勒和元謀4個(gè)主要葡萄產(chǎn)區(qū)采集了27份葡萄根際土壤樣本，運(yùn)用16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，獲得葡萄根際土壤原核生物信息，進(jìn)而探究云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤主要原核生物種類及其與土壤因子的相關(guān)性，結(jié)果表明：（1）云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際以變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）為主要優(yōu)勢(shì)菌門；（2） 從葡萄根際鑒定出27個(gè)共有原核生物屬，其中Bacillus、Acidibacter、Arthrobacter、Bryobacter、Conexibacter、Gaiella、Mycobacterium、Nitrolancea、Nocardioides、Paenibacillus、Phenylobacterium、Pseudaminobacter、Pseudolabrys、Streptomyces、Thermoactinomyces這15個(gè)屬是已明確鑒定出屬名的核心原核生物。此外，還有12個(gè)共有屬未能明確鑒定出屬名，但結(jié)果顯示它們共存于云南主產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤中，在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用還有待進(jìn)一步研究證實(shí)；（3）與土壤因子相關(guān)性分析表明，土壤pH值是顯著影響葡萄根際土壤原核生物群落組成的關(guān)鍵因子，其對(duì)維持葡萄根際土壤原核生物群落的穩(wěn)定起到關(guān)鍵作用。