飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦生長性能、消化酶活性、抗氧化能力和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

田紅艷 楊成聰 張春暖 王愛民* 劉 飛 楊文平 於葉兵 任勝杰 張武肖

(1.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，鹽城 224000；2.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471023)

膽固醇是動物體內(nèi)一種重要的固醇類化合物，不僅是動物細(xì)胞膜的組成成分，還是包括類固醇激素、膽汁酸和維生素D在內(nèi)的眾多功能性生理物質(zhì)的前體[1]。魚類等大多數(shù)脊椎動物能夠利用乙酸通過甲羥戊酸合成、異戊二酸合成、鯊烯合成以及膽固醇生成4個(gè)生理過程合成膽固醇。但蝦蟹等甲殼類動物已被證明不能從頭合成甾醇[2]，必須攝入外源性膽固醇來維持正常生理機(jī)能。因此，對于人工養(yǎng)殖的蝦蟹類動物而言，飼料中的膽固醇是其獲得膽固醇的最主要來源，對于其維持自身良好生長和正常的生理功能具有重要意義。

飼料膽固醇主要由魚油、魚粉等原料提供，常用魚油與魚粉的膽固醇水平通常在0.1%～0.7%[1]，以這些原料來補(bǔ)充配合飼料中的膽固醇會增加魚粉、魚油使用量，大大增加飼料和養(yǎng)殖成本。此外，隨著魚粉等漁業(yè)資源的緊張，配合飼料中魚粉已逐漸被其他蛋白質(zhì)原料替代，導(dǎo)致蝦蟹動物配合飼料的膽固醇水平逐漸下降。因而，確定配合飼料中膽固醇這一基本營養(yǎng)素的需求對制定成本低、效益高的甲殼動物專用飼料變得越來越重要?？耸显r(Procambarusclarkii)是我國近幾年迅速發(fā)展起來的一類水產(chǎn)品，2020年我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量將近240萬t，是繼五大宗淡水魚品種后的第六大淡水養(yǎng)殖品種[3]，因此飼料需求量也隨著養(yǎng)殖規(guī)模的增加而逐年增加。絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為克氏原螯蝦所需配合飼料蛋白質(zhì)水平在26%～32%[4]，而其中魚粉用量低于5%。由于常見蝦蟹類動物的膽固醇需求量一般在0.5%～1.0%[5-6]，因而克氏原螯蝦配合飼料中膽固醇水平可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足自身所需。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦飼料中添加0.50%～0.75%的膽固醇可以有效增加蛻殼次數(shù)，提高生長性能[7]。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦體內(nèi)各組織膽固醇含量及血淋巴液中高密度脂膽固醇含量也隨著飼料膽固醇添加水平的增加而不斷增加。在擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)的研究中也發(fā)現(xiàn)，肝臟中總膽固醇含量隨著飼料膽固醇水平的增加而不斷增加[8]。膽固醇作為感應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂肪細(xì)胞能量儲存狀態(tài)的信號分子，過量的膽固醇很可能會影響機(jī)體正常脂肪代謝。因此，本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究飼料膽固醇對克氏原螯蝦生長性能、體組成、消化酶活性、抗氧化能力和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。本試驗(yàn)所得研究結(jié)果將對膽固醇促進(jìn)蝦蟹類生長的機(jī)理進(jìn)行探討，為今后開發(fā)克氏原螯蝦專用配合飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)用克氏原螯蝦初重(4.4±0.1) g，購自鹽城市大豐區(qū)某小龍蝦養(yǎng)殖場，選擇個(gè)體健康靈活，大小規(guī)格一致。投喂普通商品飼料，馴化1周。

1.2 試驗(yàn)飼料

在3%魚粉的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)分別添加0(C0組)、0.25%(C0.25組)、0.50%(C0.50組)、0.75%(C0.75組)、1.00%(C1.00組)膽固醇(純度99.99%)的5種等氮試驗(yàn)飼料(飼料中膽固醇實(shí)測水平分別為0.06%、0.29%、0.54%、0.81%、1.05%)。飼料原料購自鹽城某飼料有限公司，原料先經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎然后80目過篩，所有原料稱重后最后逐級放大法均勻混合，膽固醇添加組需要將膽固醇均勻溶于豆油后，再與其他飼料原料混勻，混勻過程中以噴壺均勻噴灑水(按照16%質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加水分)，各原料充分混勻后使用飼料制粒機(jī)生產(chǎn)口徑為2 mm的顆粒飼料，在室溫下飼料風(fēng)干至恒重，密封冷藏備用。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items組別 GroupsC0C0.25C0.50C0.75C1.00面粉 Wheat flour6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 米糠 Rice bran 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 豆油 Soybean oil2.00 1.75 1.501.251.00 磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)22.00 2.00 2.00 2.00 2.00 預(yù)混料 Premix1)0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 粘合劑 Cement0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 食鹽 NaCl1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 烏賊膏 Squid paste0.18 0.18 0.18 0.18 0.18 賴氨酸 Lys1.581.581.581.581.58膨潤土 Bentonite0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 膽固醇 Cholesterol0.25 0.50 0.751.00 合計(jì) Total100.00100.00100.00100.00100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)粗蛋白質(zhì) Crude protein27.17 27.34 27.21 27.44 27.15 粗脂肪 Crud lipid5.97 5.87 6.02 6.04 6.11 總能 GE/(kJ/g)11.4611.5411.5611.4911.61膽固醇 Cholesterol0.06 0.29 0.54 0.811.05

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

將225尾克氏原螯蝦隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾蝦，每只單獨(dú)放置于試驗(yàn)水箱中，每個(gè)水箱長25 cm、寬12 cm、高度15 cm，并且有孔，每個(gè)重復(fù)中的水箱放置于1個(gè)大水箱中使其水質(zhì)相同，大水箱為塑料水箱，內(nèi)尺寸長88.5 cm、寬66.5 cm、高66.0 cm，養(yǎng)殖期間大水箱水位在12～15 cm。試驗(yàn)期間每天投喂2次，分別在07:00和19:00，參照3%～5%的克氏原螯蝦體重進(jìn)行喂食，養(yǎng)殖一共持續(xù)6周。在養(yǎng)殖期間，養(yǎng)殖水體水溫(23.00±1.84) ℃，以增氧泵維持溶氧含量大于6.0 mg/L，每天使用水質(zhì)檢測試劑盒監(jiān)測水質(zhì)，pH保持在7.2～7.8，氨態(tài)氮含量小于0.10 mg/L，硝態(tài)氮含量小于0.06 mg/L，光照周期為自然光照周期。

1.4 樣品采集

采樣前禁食24 h，克氏原螯蝦用酒精消過毒的紗布擦干體表水分然后測其體重，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選3尾解剖采集腹部肌肉樣品并稱重，并取3尾全蝦放到-20 ℃冰箱中保存以待分析。

血淋巴液的采樣：采樣前禁食24 h，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾克氏原螯蝦用酒精消過毒紗布擦干體表水分，心臟采血，放入肝素鈉潤濕過的離心管中，靜置4 h后在4 ℃、3 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液于-80 ℃保存待測。

組織液的采樣：采樣前禁食24 h，每個(gè)重復(fù)取5尾蝦，采肝胰腺、胃、腸道。用0.85%生理鹽水按1∶4(重量∶體積)比例，搗碎后移入勻漿器中制備20%的組織勻漿液。4 ℃低溫離心(2 500 r/min)10 min，取上清液-20 ℃保存待測。

1.5 指標(biāo)測定方法

增重率(weight gain rate，WGR，%)=
100×(Wf-Wi)/Wi;
飼料系數(shù)(feed conversion rate，F(xiàn)CR)=
Gd/(Wf-Wi);
存活率(survival rate，SR，%)=100×Kt/Ko;
肥滿度(condition factor，CF，g/cm3)=
(Wf-Wi)/A3;
含肉率(rate of flesh content，RFC，%)=
100×Mf/Wf；
肝體比(hepatosomatic index，HSI，%)=
100×Gh/Wf。

式中：Gh為克氏原螯蝦肝臟濕重(g)；Wf和Wi分別為克氏原螯蝦的終末體重和初始體重(g)；A為體長(cm)；Gd為攝入飼料干重(g)；Mf為克氏原螯蝦的終末肌肉重(g)；Kt和Ko分別為試驗(yàn)結(jié)束和開始時(shí)試驗(yàn)池中克氏原螯蝦的數(shù)量。

體組成：采用(105±2) ℃烘箱烘至恒重的方法直接測定水分含量(GB/T 5009.3—2016)；采用半微量凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量(GB/T 5009.5—2016)；采用索氏提取法測定粗脂肪含量(GB/T 5009.6—2016)；采用馬弗爐550 ℃灼燒法測定粗灰分含量(GB/T 5009.4—2016)。

消化酶活性：測定克氏原螯蝦腸道、胃、肝胰腺的蛋白酶(protease，PR)、淀粉酶(amylase，AMS)和脂肪酶(lipase，LPS)活性，采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

血淋巴液生化指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性和總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)含量均使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

血清抗氧化指標(biāo)：檢測克氏原螯蝦血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量，采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

飼料膽固醇水平：用三氯甲烷提取試樣中的膽固醇，以氮?dú)庾鳛榱鲃酉?，用氣相色譜法分離測定[9]。

基因表達(dá)量：利用Trizol試劑法來抽提肝胰腺中的總RNA，隨后通過NanoDrop?ND-1000分光光度計(jì)進(jìn)行定量(260 nm吸收峰)。純化后的RNA使用ExScriptTMRT-PCR kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在反轉(zhuǎn)錄完成后，使用SYBR@Premix Ex TaqTM試劑盒，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定肝胰腺中肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(carnitinepalmitoyl-transferase-Ⅰ，CPT-Ⅰ)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(fatty acid transport protein，F(xiàn)ATP)、脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)mRNA相對表達(dá)量。總反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA 2 μL、正和反引物各0.4 μL、SYBR@Premix Ex TaqTM10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL以及二乙基焦碳酸酯(DEPC)處理水6.8 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測定使用7900HT Fast Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystem,美國)，系統(tǒng)溫度達(dá)到95 ℃后，保持95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，隨后65 ℃保持。待測基因的特定引物列于表2，引物由Primer 5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的mRNA相對表達(dá)量，以β-肌動蛋白為內(nèi)參基因。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 19.0軟件的one-way ANOVA程序?qū)Ρ驹囼?yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，顯著性差異水平為P<0.05，所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(mean±SE)表示。以克氏原螯蝦飼料系數(shù)為因變量(Y)，以飼料膽固醇水平為自變量(X)做折線模型，分析克氏原螯蝦飼料膽固醇水平與飼料系數(shù)之間的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦生長性能的影響

由表3可知，隨著飼料膽固醇水平由0增加到0.50%，克氏原螯蝦增重率顯著增加(P<0.05)，但隨著膽固醇水平繼續(xù)增加到1.00%，增重率又顯著下降(P<0.05)。當(dāng)克氏原螯蝦攝食不添加膽固醇的飼料時(shí)，含肉率、肥滿度和肝體指數(shù)顯著低于C0.50、C0.75、C1.00組(P<0.05)。以克氏原螯蝦飼料系數(shù)為Y軸，以飼料中膽固醇水平為X軸，通過折線模型分析得出y=-0.22x+1.221 7(R2=0.935 6)與y=0.4x+0.89(R2=0.787 4)的交點(diǎn)處的X為0.54%，此時(shí)克氏原螯蝦飼料系數(shù)最低，飼料利用率最高(圖1)。

表3 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦生長性能的影響

圖1 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦飼料系數(shù)的影響

2.2 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦體組成的影響

由表4可知，飼料中膽固醇水平對克氏原螯蝦全蝦的水分、粗蛋白質(zhì)、粗灰分和鈣含量并未造成顯著影響(P>0.05)，但是顯著影響了粗脂肪含量(P<0.05)。隨著飼料膽固醇水平從0增加到1.00%，克氏原螯蝦粗脂肪含量顯著增加(P<0.05)，C0.50、C0.75、C1.00組的粗脂肪含量顯著高于C0、C0.25組(P<0.05)。

2.3 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦各組織消化酶活性的影響

由表5可知，飼料中膽固醇水平對克氏原螯蝦的肝胰腺、胃、腸道的脂肪酶、蛋白酶活性有顯著影響(P<0.05)，而對各組織的淀粉酶活性無顯著差異(P>0.05)。隨著飼料膽固醇水平從0增加到0.50%，肝胰腺、胃以及腸道的脂肪酶活性顯著上升(P<0.05)，但隨著飼料膽固醇水平的繼續(xù)增加而顯著下降(P<0.05)，C0.50組肝胰腺、胃肪酶活性均顯著高于其他各組(P<0.05)。胃和腸道蛋白酶活性隨著飼料膽固醇水平從0增加到0.50%而顯著上升(P<0.05)，但隨后顯著下降(P<0.05)。肝胰腺蛋白酶活性則在C0.75組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

2.4 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦血淋巴液抗氧化能力的影響

由表6可知，與血淋巴液MDA含量相反，克氏原螯蝦血淋巴液中SOD活性隨著飼料膽固醇水平由0增加到0.50%而顯著上升(P<0.05)，但隨著飼料膽固醇水平繼續(xù)增加而顯著下降(P<0.05)?？耸显r血淋巴液CAT活性在C0組顯著低于除C0.25組外的其他各組(P<0.05)。C0.25組血淋巴液GSH含量顯著高于其他各組(P<0.05)。

表4 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦體組成的影響(鮮重基礎(chǔ))

表5 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦組織消化酶活性的影響

表6 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦血淋巴液抗氧化能力的影響

2.5 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦肝胰腺脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可知，肝胰腺CPT-Ⅰ mRNA相對表達(dá)量隨著飼料膽固醇水平增加而不斷下降，C0組顯著高于其他各組(P<0.05)(圖2-A)。C0.25組肝胰腺FASmRNA相對表達(dá)量顯著低于C0.75、C1.00組(P<0.05)(圖2-B)。肝胰腺FABP與FATPmRNA相對表達(dá)量隨著飼料膽固醇水平的增加先上升，隨后又下降。肝胰腺FATPmRNA相對表達(dá)量在C0.75組最高顯著高于C0組(P<0.05)，而FABPmRNA相對表達(dá)量在C0.50組最高，顯著高于C0組(P<0.05)(圖2-C和圖2-D)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Value bars with different letters mean significant difference (P<0.05).

3 討 論

3.1 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦生長性能的影響

飼料中添加適宜水平的膽固醇能顯著提高甲殼類動物的生長性能[10-11]。通過折線模型分析發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)膽固醇的最適需要量為0.16%[12]；在日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)飼料中添加0.9%的膽固醇，能夠得到較高的生長性能和較低餌料系數(shù)[13]。在紅鰲鰲蝦(Cheraxquadricarinatus)的研究中也發(fā)現(xiàn)飼料中過低或過高的膽固醇水平均不利于其生長[14]。蝦、蟹等甲殼動物已被證明不能從頭合成膽固醇[2]，必須攝入外源性膽固醇來維持正常生理機(jī)能。因此，飼料中合理補(bǔ)充膽固醇對甲殼動物的生存和生長至關(guān)重要，過低或者過高的膽固醇添加水平都會影響甲殼動物的生長。為了節(jié)約魚粉等資源，水產(chǎn)飼料中植物性飼料原料越來越受到廣泛使用。相比于以魚粉等動物蛋白質(zhì)源為主的飼料，以植物性蛋白質(zhì)源為主的飼料導(dǎo)致了蝦蟹等甲殼動物機(jī)體內(nèi)膽固醇水平的缺乏[12]。膽固醇是脂蛋白的重要組成部分，體內(nèi)過低的膽固醇水平不利于脂質(zhì)在動物體內(nèi)的吸收和運(yùn)輸[15]。作為類脂的一種，膽固醇還是動物細(xì)胞膜的組成成分，為細(xì)胞膜提供結(jié)構(gòu)的完整性，以抵抗環(huán)境壓力，如高溫和鹽脅迫[16]。過低的膽固醇水平使得甲殼動物抵抗外界環(huán)境條件變化的能力減弱。此外，膽固醇是蛻皮激素的前體，過低的膽固醇水平使得甲殼動物無法合成蛻皮激素，影響正常的蛻皮，進(jìn)而影響生長性能甚至造成死亡。但是過量的膽固醇不僅對生長性能沒有促進(jìn)作用，還會增加飼料成本。

3.2 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦各組織消化酶活性的影響

甲殼動物消化酶活性反映其對飼料營養(yǎng)成分的吸收能力，活性越高吸收能力越強(qiáng)，對飼料的利用率越高，而不同消化酶活性受到其攝食的飼料不同營養(yǎng)成分的水平及來源的影響[17]。本試驗(yàn)中，飼料中膽固醇水平對克氏原螯蝦各組織的淀粉酶活性無顯著差異，且淀粉酶活性維持在較低的水平，表明克氏原螯蝦對糖的吸收利用能力較弱。隨著飼料膽固醇水平從0增加到0.50%，肝胰腺、胃以及腸道的脂肪酶和蛋白酶活性顯著上升，但隨著膽固醇水平的繼續(xù)增加而顯著下降。這不僅表明克氏原螯蝦對飼料中蛋白質(zhì)和脂肪的利用水平較高，也表明飼料中適宜的膽固醇水平能夠提高克氏原螯蝦各組織中脂肪酶和蛋白酶的活性。這與甘信輝[18]在雄性紅鰲鰲蝦和韓冰[19]在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)上的研究結(jié)果一致。飼料中0.54%的膽固醇水平有助于提高脂肪酶與蛋白酶的活性，而過量的膽固醇則會影響克氏原螯蝦體內(nèi)正常的營養(yǎng)物質(zhì)代謝，影響其消化酶的活性，進(jìn)而對其生長有一定的影響。此外，在肝胰腺和胃中蛋白酶活性達(dá)到1 000 U/mg prot，而在腸道中則小于900 U/mg prot，表明克氏原螯蝦對飼料蛋白質(zhì)的消化主要在胃部組織及肝胰腺中。

3.3 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦體組成的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料中膽固醇水平對克氏原螯蝦的水分、粗蛋白質(zhì)、粗灰分和鈣含量并未造成顯著影響，但隨著膽固醇水平不斷增加，克氏原螯蝦粗脂肪含量顯著增加，表明飼料中適當(dāng)?shù)哪懝檀寄軌虼龠M(jìn)脂肪的吸收，增加脂肪沉積。Thongrod等[20]在墨吉對蝦(Penaeusmerguiensis)的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)飼料膽固醇水平增加時(shí)，全蝦粗脂肪含量呈上升趨勢，而粗蛋白質(zhì)、粗灰分含量無顯著變化，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。在對斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[21]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[22]的研究中也有關(guān)于飼料中添加膽固醇促進(jìn)水產(chǎn)動物體內(nèi)粗脂肪含量增加的報(bào)道。張武財(cái)?shù)萚21]對斜帶石斑魚的研究發(fā)現(xiàn)，添加膽固醇組的試驗(yàn)魚肝臟中CPT-Ⅰ活性顯著低于對照組(未添加膽固醇)，并且試驗(yàn)組肝臟蘋果酸酶(malic enzyme，ME)活性有升高的趨勢。肝臟CPT-Ⅰ的作用是催化脂酰輔酶A轉(zhuǎn)化為脂酰肉堿，并將脂酰肉堿運(yùn)送到線粒體基質(zhì)進(jìn)行β-氧化，是體內(nèi)脂肪酸β-氧化分解的關(guān)鍵酶[23]。肝臟ME的作用是在脂肪酸合成中提供煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)，是脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶。由此推測，斜帶石斑魚體內(nèi)脂肪含量隨著飼料膽固醇水平的增加而增加是因?yàn)槟懝檀即龠M(jìn)了魚體肝臟脂肪酸的合成，并降低了肝臟脂肪酸的分解。本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了隨著飼料膽固醇水平的升高，CPT-Ⅰ mRNA相對表達(dá)量顯著下降，因此推測克氏原螯蝦粗脂肪含量的上升可能也與此有關(guān)。

3.4 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦血淋巴液抗氧化能力的影響

SOD、CAT能夠清除體內(nèi)多余的自由基，減少細(xì)胞的氧化損傷[24]。MDA被認(rèn)為是過氧化作用的分解產(chǎn)物，其水平可反映肝臟損傷的程度[25]。GSH能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化和解毒作用[26]。Tao等[27]在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的研究中發(fā)現(xiàn)隨著飼料膽固醇添加水平的上升，除去胃腸組織后的機(jī)體內(nèi)SOD活性呈先上升后下降的趨勢。而Han等[28]在研究飼糧膽固醇添加水平對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)幼體生長、蛻皮和抗氧化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著飼料膽固醇添加水平的上升，血清SOD活性也隨之上升。Gu等[13]在研究膽固醇對日本沼蝦幼蝦生長、飼料系數(shù)、體組成及抗氧化指標(biāo)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)肝臟CAT活性、MDA和GSH含量的變化也有類似的結(jié)果。本試驗(yàn)中，克氏原螯蝦血淋巴液中SOD活性隨著飼料膽固醇水平由0增加到0.50%而顯著上升，但隨著飼料膽固醇水平繼續(xù)增加而顯著下降。血淋巴液中MDA含量則與SOD活性呈現(xiàn)相反的趨勢?？耸显r血淋巴液中CAT活性在未添加膽固醇組顯著下降。這表明飼料中適量的膽固醇能夠提高克氏原螯蝦的血淋巴液中抗氧化能力，而過量的膽固醇則可能降低機(jī)體的抗氧化性能。因此，飼料中添加膽固醇不僅可以為甲殼動物提供機(jī)體必要的膽固醇來源，還可以作為甲殼動物一種抗氧化劑[29]。

3.5 飼料膽固醇水平對克氏原螯蝦肝胰腺脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

機(jī)體脂肪含量受到脂肪合成和脂肪分解2個(gè)代謝過程的影響[30]。當(dāng)機(jī)體需能時(shí)，儲存的脂肪首先被分解為甘油和脂肪酸，隨后脂肪酸在CPT-Ⅰ的催化下進(jìn)行β-氧化分解為機(jī)體提供能量。CPT-Ⅰ是在脂肪酸氧化過程中關(guān)鍵酶，調(diào)控脂肪的分解[31]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與C0組相比，C0.50組～C1.00組中肝胰腺CPT-Ⅰ mRNA相對表達(dá)量下降，該結(jié)果與蝦體的粗脂肪含量結(jié)果正好相反。這表明飼料膽固醇水平能夠影響機(jī)體脂肪代謝過程，膽固醇含量升高會下調(diào)CPT-Ⅰ的mRNA相對表達(dá)量，導(dǎo)致脂肪酸β-氧化水平的下降，這可能就是導(dǎo)致膽固醇水平為0.50%、0.75%和1.00%這3組克氏原螯蝦體內(nèi)粗脂肪含量顯著增加的原因之一。

FAS是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，在肝臟中以復(fù)雜的七步反應(yīng)將乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成長鏈脂肪酸[32]。FABP屬于脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族，是分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，可與游離脂肪酸結(jié)合，特別是與長鏈脂肪酸有很高的結(jié)合能力[33]。FATP參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，與FATP結(jié)合的脂肪酸能夠從細(xì)胞膜被運(yùn)送到下一位置進(jìn)行代謝[34]。本試驗(yàn)中，膽固醇高水平組肝胰腺FAS、FABP與FATP的mRNA相對表達(dá)量高于膽固醇低水平組，表明高膽固醇水平會增加克氏原螯蝦脂肪酸的合成，提高脂肪酸尤其是長鏈脂肪酸的結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而促進(jìn)脂肪的沉積，因此，F(xiàn)AS、FABP與FATP的mRNA相對表達(dá)量的升高可能也是0.50%、0.75%和1.00%這3組克氏原螯蝦體內(nèi)粗脂肪含量顯著增加的原因之一。

4 結(jié) 論

① 飼料中添加膽固醇能夠促進(jìn)克氏原螯蝦的生長，提高消化組織的脂肪酶活性。

② 過量的膽固醇會通過抑制脂肪的β-氧化，導(dǎo)致克氏原螯蝦的脂肪分解水平下降，并通過增加長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)脂肪沉積，最終引起機(jī)體脂肪含量的增加。

③ 過低或過量的膽固醇均會降低克氏原螯蝦血淋巴液抗氧化能力。

④ 本試驗(yàn)中克氏原螯蝦飼料的膽固醇適宜添加水平為0.50%，此時(shí)飼料膽固醇實(shí)測水平為0.54%。