飼喂過瘤胃褪黑素對荷斯坦奶牛乳中褪黑素與其合成前體和代謝產(chǎn)物含量、褪黑素合成酶活性及生產(chǎn)性能的影響

高偉星 馬 慧 楊敏娜 彭述宇 曲嘉晨 曲永利**

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100076)

提高產(chǎn)奶量是節(jié)約飼料成本的主要途徑，同時提高乳品質(zhì)同樣能夠為牧場帶來收益。近年來，奶牛日單產(chǎn)略有所提升，但在產(chǎn)奶量提升的同時，會出現(xiàn)乳脂率、乳蛋白率下降及體細胞數(shù)(SCC)提高等問題[1]。

褪黑素(melatonin,MT)是一種由松果體分泌的來源于色氨酸的胺類神經(jīng)內(nèi)分泌激素[2]，又稱為美拉酮寧、抑黑素、松果胰素等，是動物、植物及微生物體自行產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)[3]，可作用于動物體全身的多個器官、組織和細胞，具有調(diào)節(jié)生物節(jié)律、改善睡眠、調(diào)控生殖活動、抗氧化、抗腫瘤及清除體內(nèi)自由基等多種生理和藥理作用[4-5]。MT作用甚廣，將其科學應用于養(yǎng)牛生產(chǎn)中，不僅能為動物健康提供保障，而且能大大提升牧場效益。有研究表明，MT通過調(diào)節(jié)免疫細胞活性、促進免疫器官的生長[6]，以此調(diào)節(jié)和提高動物體的免疫能力，即MT能夠從多方面改善動物機體自身健康狀態(tài)，增強機體免疫和抗氧化能力。因此，本試驗通過在荷斯坦奶牛飼糧中添加過瘤胃褪黑素(RPMT)，從而測定RPMT對荷斯坦奶牛乳中抗氧化和免疫指標及MT、MT合成前體物和代謝產(chǎn)物含量、MT合成酶活性及生產(chǎn)性能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用RPMT采購于北京某公司，MT純度>99.9%，RPMT包被濃度為5%。

1.2 試驗設(shè)計及飼糧

本試驗開展于北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司北京奶牛中心良種場。試驗選取1～4胎次、泌乳天數(shù)在200 d以內(nèi)的健康荷斯坦奶牛32頭，隨機分為4組，分別為對照組與試驗Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組，每組8頭。各組荷斯坦奶牛平均泌乳天數(shù)如表1所示。對照組飼喂正常全混合日糧(TMR)，試驗組在對照組飼糧的基礎(chǔ)上分別添加140、160、180 mg/(頭·d) RPMT。試驗期32 d，其中第0天為飼喂前1 d，第1～28天為飼喂期，第29～31天為停飼后3 d。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗牛平均泌乳天數(shù)

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗期間,對照組與試驗組動物均在同一圈舍飼養(yǎng)，定時(14:00)飼喂TMR，試驗動物自由采食，自由飲水，在圈舍自由活動，每天定時清糞，保持圈舍的清潔。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 乳樣采集、保存與前處理

試驗組與對照組每日進行3次機械擠奶，擠奶時間分別為06：00、13：00、21：00，用于生產(chǎn)性能測定體系(DHI)檢測的乳樣采集時間分別為第0、14、29天，每次按照DHI采樣標準程序進行乳樣采集后做好標記并置于4 ℃保鮮柜中保存，待全部采集完畢送至北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司進行檢測。

乳中抗氧化與免疫指標、MT、MT合成前體和代謝產(chǎn)物含量及MT合成酶活性檢測的乳樣采集時間分別為第0、3、7、14、28、29、31天，同時記錄24 h總產(chǎn)奶量。每次按照擠奶操作流程進行乳樣采集后做好標記置于-20 ℃冰箱凍存待測。

1.4.2 測定方法

乳成分分析儀器為乳成分SCC聯(lián)機測定儀(YQ1-57)。乳中MT、5-羥色胺(5-HT)、6-羥基-褪黑素(6-OH-MT)含量及5-羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(SNAT)、咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)及N-乙酰基-5-羥色胺-甲基轉(zhuǎn)移酶(ASMT)活性通過酶聯(lián)免疫吸附法進行測定[7]。乳中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)活性通過比色法進行測定。以上指標均為北京金海科隅生物科技發(fā)展有限公司測定，試劑廠家為北京金海科隅生物科技發(fā)展有限公司；儀器廠家為上?？迫A生物工程股份有限公司；儀器型號為ST-360酶標儀。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0中Mixed混合模型統(tǒng)計，固定效應有試驗處理(組別)、采樣時間(時間)及二者之間的交互作用。方差結(jié)構(gòu)采用復合對稱性協(xié)方差(CS)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，采用Duncan氏法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛生產(chǎn)性能的影響

2.1.1 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳品質(zhì)的影響

由表3可知，在06：00時，試驗Ⅰ組乳脂率與對照組、試驗Ⅲ組相比分別提高了22.19%(P<0.05)和14.11%(P<0.05)，與試驗Ⅱ組差異不顯著(P>0.05)，試驗Ⅱ組與對照組相比提高了19.94%(P<0.05)；試驗Ⅱ、Ⅲ組乳中SCC與試驗Ⅰ組相比分別降低了88.73%(P<0.05)和84.36%(P<0.05)；各試驗組與對照組間乳蛋白率、乳糖率均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳脂率、乳蛋白率、SCC均無顯著影響(P>0.05)，但對乳糖率具有極顯著影響(P<0.01)。同時組別與時間對乳脂率、乳蛋白率、乳糖率及SCC均無顯著交互效應(P>0.05)。

在13：00時，試驗Ⅱ、Ⅲ組乳脂率與對照組相比分別提高22.56%(P<0.05)和15.32%(P<0.05)，乳糖率與對照組相比分別提高8.79%(P<0.05)和9.42%(P<0.05)，SCC與對照組相比分別降低了86.29%(P<0.05)和83.40%(P<0.05)，而試驗Ⅰ組乳脂率、乳蛋白率、乳糖率及SCC與對照組及試驗Ⅱ、Ⅲ組相比均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳脂率具有顯著影響(P<0.05)，但對乳蛋白率、乳糖率及SCC均無顯著影響(P>0.05)。組別與時間對乳糖率具有顯著交互效應(P<0.05)，而對乳脂率、乳蛋白率及SCC無顯著交互效應(P>0.05)。

在21：00時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組乳糖率與對照組相比，分別提高了6.38%(P<0.05)、7.45%(P<0.05)和9.15%(P<0.05)；試驗Ⅱ、Ⅲ組乳中SCC與試驗Ⅰ組相比分別降低了79.15%(P<0.05)和74.49%(P<0.05)，各試驗組與對照組間乳脂率、乳蛋白率均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳脂率、乳蛋白率、乳糖率及SCC均無顯著影響(P>0.05)。同時組別與時間對上述指標也均無顯著交互效應(P>0.05)。

2.1.2 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量的影響

由表4可知，在06：00時，試驗Ⅲ組產(chǎn)奶量與對照組及試驗Ⅰ、Ⅱ組相比分別提高了27.59%(P<0.01)、10.54%(P<0.05)和19.02%(P<0.01)，試驗Ⅰ組產(chǎn)奶量與對照組相比提高了15.42%(P<0.01)。時間對產(chǎn)奶量無顯著影響(P>0.05)，組別與時間也無顯著交互效應(P>0.05)。

在13：00時，試驗Ⅲ組產(chǎn)奶量對照組及試驗Ⅰ、Ⅱ組相比分別提高了23.69%(P<0.01)、17.31%(P<0.01)和22.91%(P<0.01)，試驗Ⅰ、Ⅱ組與對照組間產(chǎn)奶量均無顯著差異(P>0.05)。時間對產(chǎn)奶量無顯著影響(P>0.05)，組別與時間也無顯著交互效應(P>0.05)。

在21：00時，試驗Ⅲ組產(chǎn)奶量與對照組及試驗Ⅰ、Ⅱ組相比分別提高了22.44%(P<0.01)、16.24%(P<0.01)和20.34%(P<0.01)，同時，試驗Ⅰ、Ⅱ組與對照組間產(chǎn)奶量也均無顯著差異(P>0.05)。時間對產(chǎn)奶量無顯著影響(P>0.05)，組別與時間也無顯著交互效應(P>0.05)。

2.2 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中GSH-Px、SOD、IDO活性的影響

由表5可知，在06：00時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組乳中GSH-Px活性與對照組相比分別提高了7.58%(P<0.01)、6.12%(P<0.01)和6.41%(P<0.01)，乳中SOD活性與對照組相比分別提高了17.08%(P<0.01)、17.00%(P<0.01)和16.84%(P<0.01)；各試驗組間乳中GSH-Px、SOD活性均無顯著差異(P>0.05)，且各試驗組與對照組乳中IDO活性均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳中GSH-Px、SOD活性均具有極顯著影響(P<0.01)，但對乳中IDO活性無顯著影響(P>0.05)。組別與時間對乳中GSH-Px、SOD、IDO活性均無顯著交互效應(P>0.05)。

在13：00時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組乳中GSH-Px活性與對照組相比分別提高了7.82%(P<0.01)、3.21%(P<0.05)和5.27%(P<0.01)，同時試驗Ⅰ組與試驗Ⅱ組相比提高了4.48%(P<0.01)，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組乳中SOD活性與對照組相比分別提高了23.62%(P<0.01)、17.56%(P<0.01)和21.20%(P<0.01)，各試驗組間乳中SOD活性均無顯著差異(P>0.05)，同時，各試驗組與對照組乳中IDO活性均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳中GSH-Px、SOD活性均具有極顯著影響(P<0.01)，但對乳中IDO活性無顯著影響(P>0.05)。組別與時間對乳中SOD、GSH-Px、IDO活性均無顯著交互效應(P>0.05)。

在21：00時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組乳中GSH-Px活性與對照組相比分別提高了9.47%(P<0.01)、5.51%(P<0.01)和7.79%(P<0.01)，同時，試驗Ⅰ組與試驗Ⅱ組相比提高了3.75%(P<0.05)，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組乳中SOD活性與對照組相比分別提高了23.98%(P<0.01)、18.30%(P<0.01)和20.60%(P<0.01)，試驗組間乳中SOD活性均無顯著差異(P>0.05)，試驗Ⅲ組乳中IDO活性與對照組、試驗Ⅰ組相比，分別提高了5.13%(P<0.05)和6.04%(P<0.01)，其他各組間均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳中GSH-Px、SOD及IDO活性均具有極顯著影響(P<0.01)。組別與時間對乳中IDO活性也具有極顯著交互效應(P<0.01)，但對乳中GSH-Px、SOD活性無顯著交互效應(P>0.05)。

表4 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量的影響

表5 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中GSH-Px、SOD、IDO活性的影響

2.3 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中MT、5-HT、6-OH-MT含量的影響

由表6可知，在06：00時與13：00時，除06：00時試驗Ⅰ組乳中5-HT含量與對照組相比提高6.96%(P<0.05)外，對照組與各試驗組間乳中MT、5-HT、6-OH-MT含量均無顯著差異(P>0.05)。在06：00時，時間對乳中6-OH-MT含量具有極顯著影響(P<0.01)，而乳中MT、5-HT含量在06：00與13：00時均無顯著影響(P>0.05)，且組別與時間對乳中MT、5-HT、6-OH-MT含量均無顯著交互效應(P>0.05)。

在21：00時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組乳中MT含量與對照組相比分別提高了34.69%(P<0.01)、35.70%(P<0.01)和36.70%(P<0.01)，乳中5-HT含量與對照組相比分別提高了21.64%(P<0.01)、23.57%(P<0.01)和19.82%(P<0.01)，乳中6-OH-MT含量與對照組相比分別提高了25.50%(P<0.01)、20.98%(P<0.01)和23.69%(P<0.01)，各試驗組間乳中MT、5-HT、6-OH-MT含量均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳中MT、5-HT、6-OH-MT含量均具有極顯著影響(P<0.01)。組別與時間對乳中MT、5-HT含量同樣具有極顯著交互效應(P<0.01)，對乳中6-OH-MT含量具有顯著交互效應(P<0.05)。

2.4 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中MT合成酶活性的影響

由表7可知，在06：00與13：00時，各試驗組與對照組乳中SNAT、COMT、ASMT活性均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳中SNAT活性具有顯著影響(P<0.05)，對乳中COMT、ASMT活性影響不顯著(P>0.05)。組別與時間對乳中SNAT、COMT、ASMT活性均無顯著交互效應(P>0.05)。

在21：00時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組乳中SNAT活性與對照組相比分別提高了31.15%(P<0.01)、28.42%(P<0.01)和30.33%(P<0.01)，乳中COMT活性與對照組相比分別提高了28.04%(P<0.01)、28.35%(P<0.01)和28.82%(P<0.01)，乳中ASMT活性與對照組相比分別提高了28.19%(P<0.01)、28.19%(P<0.01)和32.16%(P<0.01)，各試驗組間乳中SNAT、COMT、ASMT活性均無顯著差異(P>0.05)。時間對乳中SNAT、COMT、ASMT活性具有極顯著影響(P<0.01)。組別與時間對乳中SNAT、COMT、ASMT活性均具有顯著交互效應(P<0.05)。

3 討 論

3.1 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛生產(chǎn)性能的影響

有研究表明，MT作為一種抗氧化和抗炎分子[8]，具有應激誘導作用，從單細胞生物到哺乳動物均已得到了證實[9]。MT對促炎因子具有良好的抑制效果[10]，乳房炎患病率增加，隨之會造成乳中SCC增高。研究顯示，飼喂MT能夠顯著降低SCC[11]。Yao等[12]研究結(jié)果顯示，飼喂MT第7天，乳中SCC開始下降且14 d后乳中SCC極顯著降低，飼喂21 d后，結(jié)果與飼喂14 d相同，在停飼后，SCC持續(xù)下降5～7 d，同時40 mg MT組乳中乳脂率、乳蛋白率均顯著增加且乳糖率在飼喂14 d后40 mg MT組顯著低于對照組。

Wu等[13]挑選3個不同牧場且分別在不同季節(jié)及各個年齡段及不同泌乳時期的健康荷斯坦奶牛進行試驗，于10:00將MT稀釋液皮下注射9.3 mg/d，連續(xù)4 d并在MT注射前和注射后15 d，收集鮮牛奶進行DHI分析，結(jié)果表明，MT通過顯著抑制牛奶體細胞評分，增加乳糖和乳蛋白含量來提高牛奶的營養(yǎng)價值。

本試驗結(jié)果顯示，試驗組乳中乳糖率、乳脂率增加，SCC降低，乳蛋白率并未有所增加，且與對照組并無顯著差異，探究其可能原因是動物體內(nèi)可自行合成MT[14]，外源MT的補充導致荷斯坦奶牛機體內(nèi)MT過剩，僅有少量MT通過瘤胃而被小腸吸收，從而未能對乳中乳蛋白率產(chǎn)生積極促進效果。本試驗中，隨著RPMT飼喂量增加，產(chǎn)奶量顯著高于對照組，該結(jié)果與Avilés等[15]的研究結(jié)果相同，即飼喂RPMT能夠顯著增加荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量，但對于乳糖率和乳脂率來說，添加適量RPMT且在飼喂有效時間內(nèi)能夠具有顯著改善效果。

表6 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中MT、5-HT、6-OH-MT含量的影響

表7 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中SNAT、COMT、ASM活性的影響

3.2 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中抗氧化與免疫指標的影響

MT是一種生物抗氧化劑、自由基清除劑[6,16]，已被廣泛用于預防妊娠并發(fā)癥，同時，MT能夠使血清和胎盤MT含量、母胎氧化還原狀態(tài)和胎盤炎癥反應升高[17]。有研究表明，MT具有多種生物學效應，除了抗氧化活性，MT還具有許多功能，包括晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、增強免疫、生殖調(diào)節(jié)、促進睡眠和抗炎功能等[18-20]。MT可以安全地用于熱應激母羊，以提高母羊在妊娠期間的生育率和氧化還原狀態(tài)[21]。此外，MT可能在產(chǎn)前應激的后代中發(fā)揮作用，可能是通過氧化還原相關(guān)機制調(diào)節(jié)促炎細胞因子[22]。作為一種抗氧化分子，MT有2種作用方式：第1種，當它在血液中發(fā)現(xiàn)低含量時，它是活性氧(ROS)的清除劑；第2種，當它的含量升高時，它誘導GSH-Px等抗氧化基因的表達，從而導致高水平的GSH-Px[23]。SOD作為機體抗氧化酶系統(tǒng)最重要的酶之一，可以有效清除氧自由基，降低氧化作用[24]，與此同時，SOD與IDO同樣作為機體免疫調(diào)節(jié)酶，是體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)劑，其活性表達在機體免疫調(diào)控方面仍發(fā)揮著重要作用[25]。IDO是肝臟外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，可用于調(diào)節(jié)自身免疫性[26]，還具有增強炎癥組織自我修復作用，同時對組織破壞也有限制作用[27]。

本試驗結(jié)果表明，飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中GSH-Px、SOD和IDO活性均有促進作用。同時，飼喂RPMT對于生鮮乳抗氧化性(GSH-Px、SOD活性)的影響會隨著RPMT飼喂量和飼喂時長的增加而增加，在飼喂第7天效果最為顯著，且能夠持續(xù)至停飼后一定時長，但對于機體免疫調(diào)節(jié)指標IDO活性，僅在21：00時表現(xiàn)出差異性，探究其可能原因；IDO活性與機體MT合成表現(xiàn)出同步性，同樣在飼喂第7天乳中MT含量升至最大值，而乳中IDO活性與MT合成是否有關(guān)，具體原因還需進一步探究。

3.3 飼喂RPMT對荷斯坦奶牛乳中MT、MT合成前體、MT代謝產(chǎn)物含量及MT合成酶活性的影響

MT的合成途徑在不同的物種中是相當復雜的。例如，細菌、真菌、植物和動物都有一些共同的合成反應，但也有其他完全不同的反應發(fā)生在MT的合成途徑中[28]，這些差異包括起始材料、所涉及的酶、調(diào)節(jié)因子和速率限制等，在動物合成途徑中，色氨酸是MT起始物質(zhì)[29]，因此，色氨酸的可用性限制了動物體內(nèi)MT的生理水平[30]。色氨酸首先被羥基化形成5-羥色氨酸。這一步驟是由色氨酸羥化酶(TPH)催化的，動物中存在2個TPH基因(TPH1和TPH2)并產(chǎn)生相同的產(chǎn)物[30]，TPH1和TPH2具有相似的功能，然而，它們在不同的組織中的表達水平不同，TPH2主要表達于腦干中，而TPH1廣泛表達于松果體等器官和組織中。盡管TPH1的表達表現(xiàn)出與MT的產(chǎn)生有一定對應關(guān)系的晝夜節(jié)律，但它并不被認為是動物MT合成的限速酶[31]。其次是5-羥色氨酸脫羧形成5-羥色氨胺，以SNAT或芳酰烷基胺N-乙酰羥色胺(N-乙酰羥色胺)以及乙酰輔酶A(ANAT)作為輔助因子進行催化形成N-乙酰5-羥色胺，SNAT/ANAT/ASMT被認為是MT合成的限速酶[32-33]，因為它在松果體中的表達或活動的晝夜節(jié)律與大多數(shù)被測試動物的血清MT含量的晝夜節(jié)律完全匹配[33]，最后則是N-乙酰5-羥色胺O甲基化，由ASMT催化形成MT[29,34]，并在動物體內(nèi)代謝形成6-OH-MT[35]，與此同時，有研究證明，COMT能夠參與后2步MT的合成[35]，且COMT在參與MT的合成與ASMT有同樣重要的作用[36-37]。

本試驗研究結(jié)果顯示，乳中MT含量會隨著RPMT飼喂時間增加而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，同時，在飼喂第7天時乳中MT含量呈現(xiàn)最大值，該結(jié)果與楊明輝等[38]的研究結(jié)果相同。5-HT含量在飼喂第3天時呈現(xiàn)最大值，而6-OH-MT含量在飼喂第7天時呈現(xiàn)出最大值。隨著RPMT飼喂量的增加，乳中MT、5-HT與6-OH-MT含量同樣增加，且試驗組在21：00時乳中MT、5-HT與6-OH-MT含量極顯著高于對照組，其原因可能在于采樣時間距離投喂時間(14：00)最近，有研究顯示，不同外源MT(肌肉注射與皮下埋值)能夠使機體內(nèi)MT含量在短時間內(nèi)達到最大值[38]，因此本試驗結(jié)果可能與此原因有關(guān)；本試驗中對照組在21：00時乳中MT含量同樣高于06：00時，因此，原因也可能是MT合成與奶?；顒拥臅円构?jié)律性有關(guān)[39]。

本試驗乳中MT合成酶活性隨時間變化均與MT含量隨時間變化趨勢相同，有研究報道，在機體內(nèi)合成MT時，ASMT比SNAT發(fā)揮更加重要的作用[40]，認為5-HT可能首先被ASMT甲基化形成5-甲氧基色胺(5-甲氧基羥色胺)，因為ASMT對5-HT的親和力高于SNAT的親和力[34]，而該試驗結(jié)果顯示，在21：00時乳中MT含量與對照組表現(xiàn)出差異性時，ASMT活性同樣表現(xiàn)出差異性，因此，該試驗結(jié)果同樣表明，在參與MT合成時，隨著MT含量增加，乳中ASMT活性同樣增強，預示ASMT發(fā)揮著更重要的作用。同時，飼喂RPMT能夠顯著提高21：00時乳中MT含量，且MT合成前體物和代謝產(chǎn)物含量會隨著MT合成量變化而變化。

4 結(jié) 論

① 飼喂RPMT能夠顯著增加荷斯坦奶牛乳中乳脂率、乳糖率與產(chǎn)奶量，降低SCC，同時增強生鮮乳的抗氧化性能。

② 飼喂RPMT能夠增加MT合成前體及代謝物含量，且MT合成量增加，代謝量同樣增加，即MT合成與代謝呈現(xiàn)同步性。與此同時，在參與MT合成過程中，ASMT相比SNAT和COMT作用效果更加顯著。