EGCG誘導人視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡作用的研究

邱梅園，丁芝祥，靳 荷，蔣姣姣

0引言

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞和脈絡膜之間的單層上皮細胞層，對視網(wǎng)膜的內在平衡至關重要。它構成了視網(wǎng)膜生物屏障，對神經(jīng)視網(wǎng)膜的光感受器有支持作用，此外也具有運輸營養(yǎng)物質及免疫赦免等功能[1]。因此，RPE的異常變化會引起其功能紊亂，導致光感受器的退化及視力的喪失，最終導致增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy, PVR)或年齡相關性黃斑變性等疾病的發(fā)生。PVR是視網(wǎng)膜脫離的并發(fā)癥之一，其主要原因是由于RPE細胞、巨噬細胞和纖維母細胞等的大量增殖，其中RPE細胞的增殖被認為是PVR發(fā)生發(fā)展最主要的原因，RPE細胞異常增生使其遷移至玻璃體腔和玻璃體視網(wǎng)膜交界處，逐漸形成視網(wǎng)膜前膜，進而牽拉視網(wǎng)膜，最終導致視網(wǎng)膜脫離及視力損害。此外，在PVR發(fā)展之前，RPE細胞異常增殖及遷移的相關表型也難以回到正常狀態(tài)。因此，如何控制PVR的發(fā)展仍是一個難題。近年來，PVR的研究熱點是借助細胞凋亡途徑控制RPE細胞的增殖，或施加凋亡誘導劑，使增殖及遷移的細胞發(fā)生凋亡，進而遏制PVR的進展。綠茶多酚提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是綠茶多酚提取物兒茶素(catechin)的主要成分，約占兒茶素的80%，具有很強的抗氧化能力。同時，研究表明低濃度EGCG對紫外線等因素引起的RPE細胞凋亡具有抵抗作用。而EGCG單獨使用對RPE細胞起到什么作用尚不清楚。本實驗應用不同濃度EGCG作用于體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)，探討EGCG對RPE細胞的促/抗凋亡作用，并觀察其對凋亡相關因子B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白質(Bax)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)等因子的mRNA及蛋白水平的影響，評價EGCG對PVR早期防治的應用價值。

1材料和方法

1.1材料EGCG(中國藥品生物制品檢定所)；ARPE-19株購買于武漢大學細胞庫中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢);青鏈霉素混合液(100×)(含青霉素10U/L，含鏈霉素10μg/L)購自武漢博士德生物公司;DMEM培養(yǎng)基、小牛血清和胰蛋白酶均購自GIBCO公司;鼠抗β-actin單克隆抗體(上海碧云天);兔抗bcl-2、caspase-3、p53多克隆體(abcam公司)；兔抗Bax多克隆抗體(abmart)、ECL試劑盒(美國伯樂公司)。Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，蛋白定量分析試劑盒(上海碧云天生物有限公司)。流式細胞儀(美國BD FACScan)；倒置熒光顯微鏡IX-71(日本Olympus公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國thermo公司)；冷凍高速離心機(美國thermo公司)，蛋白電泳及轉印系統(tǒng)(美國伯樂公司)，酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.2方法

1.2.1EGCG溶液配制將EGCG用PBS配制成16mg/mL的母液，0.22μm的濾膜過濾除菌，用完全培養(yǎng)基稀釋成40、80、160μg/mL三個濃度。

1.2.2ARPE-19細胞株培養(yǎng)調整密度為每毫升5×104個細胞接種到培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.3hoechst33258熒光染色取對數(shù)生長期的ARPE-19，以每孔4×104個細胞種于6孔板內，EGCG干預48h后，將6孔板內的培養(yǎng)基吸出，PBS洗兩遍，4%的多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗兩遍后，加入用PBS(1∶1 000)稀釋hoechst 33258，37℃孵育20min。PBS洗兩遍后，熒光顯微鏡下觀察拍照，注意操作時動作輕柔，以免凋亡細胞被洗掉。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率EGCG處理細胞48h后，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌后離心，轉移到1.5mL EP管內，先將10×結合緩沖液用去離子水稀釋成1×結合緩沖液，每管加100μL稀釋好的結合緩沖液，各加入5μL Annexin V-FITC和PI，室溫避光染色30min，再加入100μL稀釋好的結合緩沖液，篩網(wǎng)過濾，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測細胞Bax和caspase-3及p53的mRNA表達EGCG處理細胞48h后收集細胞，PBS洗滌，加入Trizol試劑，提取總RNA，鑒定RNA純度和濃度，按RNA試劑盒要求依次加入試劑，將總RNA逆轉錄成cDNA，后按熒光定量擴增試劑盒要求依次加入引物和反應試劑，ABI7500fast熒光定量PCR儀上機檢測，反應條件:50℃ 2min，94℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 1min(采集熒光)，40個循環(huán)。將β-actin設為內參，正常組設為1，以p53，Bax，caspase-3的2-ΔΔCt反映目的基因mRNA相對表達水平。

1.2.6Westernblot法檢測細胞蛋白表達收集EGCG處理48h后的細胞，PBS洗2次，加入細胞裂解液，提取總蛋白，離心取上清，BCA方法測定蛋白濃度。SDS-PAGE膠電泳后，將蛋白轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入bcl-2、Bax、caspase-3和p53的一抗(1∶1 000)孵育過夜，加入稀釋合適濃度的二抗，室溫孵育反應后洗膜，膠片發(fā)光顯影后定影掃描。以β-actin作為內參，用目的蛋白灰度值/內參灰度值反映蛋白的相對表達水平，實驗重復3次。

2結果

2.1hoechst33258熒光染色hoechst 33258染色觀察是否有凋亡小體的出現(xiàn)，結果發(fā)現(xiàn)隨著EGCG濃度的升高，凋亡細胞也逐漸增多，熒光染色變高亮濃縮，并可見明顯的凋亡小體，見圖1。

圖1 hoechst 33258熒光染色分析不同濃度EGCG誘導ARPE-19內的凋亡小體 箭頭所示凋亡小體。

2.2流式細胞儀檢測不同濃度EGCG誘導ARPE-19凋亡情況不同濃度EGCG組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=168.409，P<0.01)，見表1。組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，80、160μg/mL組與對照組和40μg/mL組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，80μg/mL組與160μg/mL組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，40μg/mL組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測不同濃度EGCG誘導ARPE-19凋亡情況 bP<0.01 vs對照組; dP<0.01 vs 40μg/mL。

2.3實時熒光定量PCR檢測不同濃度EGCG凋亡相關因子的mRNA表達不同濃度EGCG處理ARPE-19后，能夠顯著上調p53，Bax和caspase-3 mRNA的表達。不同濃度EGCG各組間Bax、caspase-3、p53的mRNA表達比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩兩比較結果見表1，圖3。

圖3 實時熒光定量PCR分析不同濃度EGCG凋亡相關因子的mRNA表達 A:Bax;B:caspase-3;C:p53；aP<0.05, bP<0.01 vs對照組。

2.4Westernblot檢測不同濃度EGCG凋亡相關蛋白的表達EGCG作用ARPE-19 48h后，Western blot檢測bcl-2、Bax、caspase-3和p53的蛋白表達情況，隨著劑量的增加，EGCG可明顯抑制bcl-2的蛋白表達，而顯著增強Bax，caspase-3和p53的蛋白表達，見圖4。不同濃度EGCG各組間bcl-2、Bax、caspase-3和p53的蛋白表達比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，兩兩比較結果見表1。

圖4 Western blot檢測不同濃度EGCG凋亡相關因子蛋白表達 A:bcl-2;B:Bax;C:caspase-3;D:p53。bP<0.01 vs對照組。

表1 各組凋亡率和各因子mRNA及蛋白表達比較

3討論

PVR是孔源性視網(wǎng)膜脫離最嚴重的并發(fā)癥之一，易造成視網(wǎng)膜結構的變形以及視網(wǎng)膜復位手術的失敗，嚴重的可以導致視功能喪失或失明[2]。RPE細胞是PVR發(fā)生發(fā)展中公認的最重要的細胞成分，RPE是視網(wǎng)膜10層結構的最外層，構成了視網(wǎng)膜的外屏障。正常情況下，RPE細胞是靜止的，但是若在受損傷的情況下可發(fā)生增殖和遷移，是PVR惡化的原因之一，因此早期抑制RPE細胞的增殖成為近年來PVR防治研究的主流趨勢和熱點。目前，臨床上尚沒有療效確切的藥物用于PVR的治療，各種抗增殖、抗代謝的藥物因毒性大、副作用多等問題限制了其進一步的臨床應用[3-4]，目前這類藥物尚處于實驗研究階段[5]，因此，尋求新的治療PVR的途徑提上日程，成為當前研究的熱點。EGCG是綠茶多酚提取物兒茶素的主要成分，約占兒茶素的80%，具有特殊的立體化學結構[6]。大量研究表明茶多酚具有很強的抗氧化能力，一直作為天然的食品抗氧化添加劑，具有抗氧化、抗腫瘤[7-8]、清除氧自由基等多種生物活性作用，有良好的應用前景[9]。誘導RPE細胞凋亡能夠很好的抑制細胞的增殖及轉移[10]，Cao等[11]利用50μmol/L(約23μg/mL)濃度的EGCG作用于受到紫外線處理的RPE細胞，結果表明該濃度的EGCG對紫外線引起的RPE細胞凋亡具有保護作用，該實驗中僅用了一個濃度。但其他濃度或更高濃度的EGCG單獨使用對RPE細胞是否具有不同的作用尚不清楚。本文利用40、80、160μg/mL的EGCG單獨作用于體外培養(yǎng)的ARPE-19[12]，檢測了細胞凋亡相關的指標，目的是全面了解EGCG對ARPE-19的作用。

EGCG作用ARPE-19 48h，普通顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)隨著藥物溶度的增高，ARPE-19數(shù)量逐漸減少，并且變圓，乃至細胞從培養(yǎng)皿上脫落下來，為了證實細胞是壞死還是凋亡，我們利用hoechst 33258進行染色，發(fā)現(xiàn)使用的160μg/mL的EGCG能誘導ARPE-19的凋亡小體出現(xiàn)，說明160μg/mL的EGCG能夠誘導ARPE-19發(fā)生凋亡，流式細胞儀進一步分析表明，160μg/mL EGCG能夠誘導21%左右的ARPE-19發(fā)生凋亡。細胞凋亡的發(fā)生，往往伴隨著促凋亡因子表達的增多以及抑制凋亡因子表達的減少[13-15]。caspase-3、Bax和p53是屬于促凋亡細胞因子，當?shù)蛲霭l(fā)生時，常常伴隨著這些因子表達的升高[16-18]。Bcl-2細胞因子是屬于bcl-2家族的一員，與細胞凋亡密切相關，是一種非常重要的抑制凋亡的細胞因子[16, 19]。本研究發(fā)現(xiàn)，80和160μg/mL的EGCG干預ARPE-19后，也伴隨著caspase-3、Bax、p53和Bcl-2的表達改變。實時熒光定量PCR及Western blot實驗結果顯示，隨著EGCG濃度的增高，促凋亡因子caspase-3、Bax和p53的表達增多，而抑制凋亡因子bcl-2的表達減少，這說明80和160μg/mL的EGCG在誘導ARPE-19發(fā)生凋亡的同時，上調caspase-3、Bax和p53的表達，下調bcl-2的表達，EGCG誘導ARPE-19凋亡的機制與caspase-3、Bax，p53和bcl-2等細胞因子的表達改變有關。

上述結果表明80和160μg/mL的EGCG具有促進ARPE-19凋亡作用，有望用于抑制因RPE細胞異常增殖引起的PVR病變。但仍然有諸多問題需要進一步研究。比如，該濃度EGCG對其他細胞，尤其是視網(wǎng)膜內的其他細胞是否具有促凋亡作用。如果EGCG對其他細胞也具有促凋亡作用，其應用就受到極大的限制。需要進一步檢測恰當?shù)臐舛?，使得該濃度EGCG只引起RPE細胞凋亡，而對其他細胞沒有影響，這樣才具有臨床應用價值。由于EGCG是一種多靶點的抑制劑，其對RPE細胞的作用機制及靶點還遠未完全闡明，這些細胞因子之間的上下游關系以及相互聯(lián)系如何尚需進行更深入的研究。