組學技術在糖尿病視網膜病變中的研究進展

周 琦，熊 鑫，呂紅彬

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)的發(fā)病機制尚未完全闡明且晚期治療效果不理想。目前研究發(fā)現(xiàn)基因表達異常、表觀遺傳改變、信號通路及代謝產物紊亂等都參與了DR進程。近年來，隨著高通量技術的發(fā)展，DR在基因組學、轉錄組學、表觀遺傳組學、蛋白質組學以及代謝組學的研究，對探索DR病理生理機制、尋找預測和診斷分子標志物以及發(fā)現(xiàn)治療靶點等提供了新思路。本文就DR在不同組學方面的研究進展予以綜述。

1 DR與基因組學

基因組學是多組學的根基，其測序技術主要包括全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)和全外顯子測序(whole exon sequencing, WES)技術。有研究指出，DR的發(fā)生有25%～50%的遺傳可能性[1]。近年來，隨著測序技術的發(fā)展及測序成本的下降，DR的基因組學研究得到蓬勃發(fā)展。

1.1GWAS與DR遺傳風險GWAS指將基因組中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide ploymorphism, SNP)作為分子遺傳標記，再行全基因組水平上的對照或相關性分析，進而找到影響復雜性狀的基因變異并確定疾病遺傳風險。GWAS已應用于識別不同國家DR患者易感基因的研究中。Sheu等[2]使用GWAS比較了中國437例增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)患者及570例病程大于8a的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者，結果共發(fā)現(xiàn)了3個新基因座TBC1D4-COMMD6-UCHL3(rs9565164),LRP2-BBS5(rs1399634)以及ARL4C-SH3BP4(rs2380261)，這些基因與胰島素信號傳導、炎癥、脂質代謝途徑有關，但以上基因改變沒有在患有T2DM的西班牙裔美國人群中發(fā)現(xiàn)。一項日本的研究使用GWAS分析了11 097例T2DM患者(包括5 532例DR患者及5 565例糖尿病腎病患者或無視網膜病變的DM患者對照)的SNP，確定了兩個新的SNP位點以及一個新的DR易感基因EHD3[3]。盡管以上研究已經描述了DR的遺傳風險，但結果的重復性差。還有一項研究發(fā)現(xiàn)了澳大利亞白人染色體17q25.1上GRB2附近的遺傳變異與DR有關，且該研究發(fā)現(xiàn)的遺傳風險位點在同種族人群的1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)及T2DM患者及印度T2DM患者中得到復制[4]。故GWAS存在一定的局限性，首先，GWAS結果較容易呈現(xiàn)假陽性和假陰性，這也是不同研究結果不一致的原因之一。其次，GWAS發(fā)現(xiàn)的是易感位點，而并非致病基因，且多數易感位點位于非編碼區(qū)或內含子上，給研究帶來一定困難。因此，以外顯子組為重點的檢測方法可能為尋找DR遺傳信息提供更好的指導。

1.2WES與DR遺傳風險外顯子組僅占人類基因組的1%，但其涵蓋了人體85%的基因信息。Ung等[5]對57例PDR患者及13例10a以上無糖尿病視網膜病變(no diabetic retinopathy, NDR)的T2DM患者進行WES檢測，共篩選出44個候選基因，進一步在高糖培養(yǎng)的人視網膜血管內皮細胞中進行驗證，發(fā)現(xiàn)VEGFB、VPS13B、PHF21A、NAT1、ZNF600、PKHD1L1表達降低，表明這6個基因可能在PDR的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，基因組學為尋找不同種族DR患者的遺傳易感基因提供了全面及客觀的研究策略，但目前的研究成果尚無法全面闡釋DR的確切遺傳方式和分子機制。

2 DR與轉錄組學

轉錄組學是連接基因組與蛋白質組的紐帶，其原理是利用新一代高通量測序技術，檢測特定組織或器官在某一狀態(tài)下所能轉錄出來的所有RNA的總和。目前轉錄組學已廣泛應用于確定DR生物標志物、探索病理生理機制以及尋找治療靶點中。

2.1轉錄組學與DR生物標志物張哲等[6]利用轉錄組學技術測序分析了高糖對視網膜血管內皮細胞的影響，結果共發(fā)現(xiàn)449個差異表達的基因，差異基因主要富集在轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路、補體通路及氨基酸相關代謝通路。劉穎等[7]將轉錄組學技術與生物信息分析相結合，前瞻性比較了DR與DM患者外周血白細胞中差異表達的基因，結果共篩選出103個差異表達的基因，且差異表達的基因在抗原提呈和處理、自然殺傷細胞介導的細胞毒性通路中富集。其中溶血磷脂酸受體3(lysophosphatidic acid receptor 3,LPAR3)和鈣調蛋白(calponin,CNN1)在DR組表達顯著升高，推測其分別通過影響Hippo通路、調節(jié)血管平滑肌細胞的收縮與增生參與DR發(fā)生，故LPAR3和CNN1可能是DR診斷的生物標志物，但血糖血脂水平、合并癥、運動及感染等因素均可能影響結果，故需擴大樣本且聯(lián)合多組學進行關聯(lián)分析。Pan等[8]對20例PDR患者及20例NPDR患者進行血清轉錄組學分析，共發(fā)現(xiàn)了6個基因(CCDC144NL、DYX1C1、KCNH3、LOC100506476、LOC285847和ZNF80)，其預測PDR靈敏度和特異性可達到為91.7%和91.5%，因此，以上基因可作為PDR早期診斷的潛在生物標志物，但尚需在更大規(guī)模人群中驗證。

2.2轉錄組學與DR病理生理機制轉錄組學有助于認識DR病理過程中的基因調控機制。神經退行性病變和神經炎癥是DR的關鍵病理過程，但參與其過程中的膠質細胞、神經元及內皮細胞如何發(fā)揮作用卻未完全研究清楚。12周Akimba(Ins2AkitaVEGF+/-)小鼠可出現(xiàn)類似于DR患者的眼底改變，包括微動脈瘤、毛細血管滲漏、神經變性、視網膜水腫等，一項研究對12周Akimba小鼠視網膜進行單細胞RNA測序，描述了DR模型中神經細胞、神經膠質細胞和免疫細胞中差異表達的基因網絡，結果發(fā)現(xiàn)視桿細胞、視錐細胞、雙極細胞及大膠質細胞差異表達的基因主要在細胞代謝和核糖體基因表達、神經膠質增生、免疫系統(tǒng)激活、金屬離子和氧化還原平衡失調，結果認為大膠質細胞在DR早期神經退行性過程中發(fā)揮關鍵作用，但該研究無法對Müller細胞和星形膠質細胞進行單獨解析[9]。Xiao等[10]對自發(fā)性T2DM的食蟹猴模型的視網膜進行單細胞RNA分析，結果顯示小膠質細胞對高血糖最敏感且差異表達基因最多。高血糖環(huán)境下TNF-α通過自分泌方式介導小膠質細胞的活化，激活的小膠質細胞不僅通過分泌促炎因子影響神經元功能，還可能與視網膜血管內皮細胞相互作用后破壞血-視網膜屏障，從而導致視網膜血管損傷。

2.3轉錄組學與DR治療靶點抗VEGF治療可顯著減少PDR患者視網膜新生血管，但卻促進了纖維化增殖，為探究血管新生和纖維化增殖之間的關鍵調控基因，牛瑞等[11]使用抗VEGF藥物干預恒河猴視網膜血管內皮細胞，并聯(lián)合轉錄組測序及生物信息分析，結果發(fā)現(xiàn)抗VEGF藥物可能導致鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱβ、膠原蛋白Ⅲ型α1鏈、細胞球蛋白及前列腺素E受體2等TGF-β通路相關基因表達異常，進而加劇視網膜纖維化進程，因此該研究為減輕抗VEGF藥物治療后視網膜纖維化提供了治療切入點。Dong等[12]進一步利用轉錄組學分析了高糖對視網膜血管內皮細胞的影響，結果表明TGF-β通路成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)和SMAD家族成員9(SMAD family member 9,SMAD9)表達升高。通過進一步體內外實驗驗證后，研究中認為BMP4可顯著上調SMAD9的表達并促進VEGF和纖維化因子的表達，因此BMP4可能是DR病程中抗VEGF和抗纖維化的雙重治療靶點。

3 DR與表觀遺傳組學

DR發(fā)病與遺傳和環(huán)境因素密切相關，表觀遺傳學是連接基因與環(huán)境因素之間的橋梁，即在不改變DNA序列的前提下，通過影響DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA調控等表觀遺傳因素，改變相關基因表達，進而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。其中，DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳修飾方式，是在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將活化的甲基加在胞嘧啶的5’碳端，將其修飾為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)。5mC多位于啟動子胞嘧啶-鳥嘌呤(cytosinephosphate guanine, CpG)島，該區(qū)域高甲基化通常會導致基因表達的下調。目前，DNA甲基化檢測已應用于DR預測、診斷及發(fā)病機制的探索中。

3.1DNA甲基化與DR預測和診斷Agardh等[13]對T1DM伴PDR患者血液進行了全基因組DNA甲基化檢測，總共鑒定了233個獨特基因的349個CpG位點差異，其中79%呈低甲基化，這些位點代表了與炎癥、氧化應激等相關的基因的高表達，通路分析提示差異性甲基化基因顯著富集于自然殺傷細胞介導的細胞毒性通路。進一步前瞻性隊列研究確定了17個基因的28個CpG位點可以作為預測T1DM患者發(fā)生PDR的表觀遺傳標記。Duraisamy等[14]亦研究證明，與NDR患者相比，PDR患者外周血液DNA甲基化明顯增高，提示DM患者的甲基化檢測結果可以作為診斷PDR的生物標志物。

3.2DNA甲基化與DR發(fā)病機制臨床和實驗研究表明，DR進展并不會隨著高血糖控制而終止，這稱為“代謝記憶”現(xiàn)象，表觀遺傳學可以解釋“代謝記憶”發(fā)生的機制[15]。高血糖導致的線粒體DNA(mtDNA)功能障礙的惡性循環(huán)，是一系列視網膜病變的起端，其原因在于高糖誘導DNMT活性增加，導致mtDNA高甲基化從而損傷轉錄過程，進而產生線粒體功能障礙及毛細血管凋亡，對DNMT進行抑制具有恢復線粒體穩(wěn)態(tài)及延緩DR發(fā)展的潛力[16]。在DR大鼠模型中同樣觀察到，血糖控制差持續(xù)3mo的DM大鼠恢復血糖良好控制3mo后，視網膜DNMT1激活及5mC水平的增加并不能逆轉，但是在誘導DM大鼠后立即進行血糖控制則可抑制視網膜DNMT1激活及5mC水平的增加。該結果表明在早期DM階段進行血糖控制可以通過抑制DNA甲基化，從而維持線粒體穩(wěn)態(tài)以及抑制DR的發(fā)展[17]。因此，對DNA甲基化的干預可能對血糖控制良好，但DR仍持續(xù)進展患者的病情控制產生積極作用。

4 DR與蛋白組學

蛋白組學是指一個細胞或者組織基因組所表達的全部蛋白組，即從整體的角度分析細胞或者組織動態(tài)變化的蛋白質的組成成分、表達水平、翻譯后修飾狀態(tài)以及蛋白質之間的相互規(guī)律，進而了解疾病的發(fā)生發(fā)展。目前蛋白組學已應用于DR篩查、發(fā)病機制以及治療的研究中。

4.1蛋白組學與生物標志物DR患者的玻璃體、房水、淚液以及唾液的蛋白組學研究為DR篩查提供了可能的生物標志物。Balaiya等[18]運用蛋白組學分析了PDR患者與視網膜前膜或黃斑裂孔患者的玻璃體液，在PDR患者玻璃體液中共發(fā)現(xiàn)了16種獨特的蛋白質，這些蛋白質功能與凝血、補體和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)相關，并可能成為PDR的生物標志物。PDR患者房水中與玻璃體中差異表達的蛋白類似，其原因可能在于玻璃體中蛋白突破玻璃體-房水屏障或血-房水屏障滲透至房水中。相關研究進一步比較PDR患者與年齡相關性白內障患者房水中的蛋白表達，共發(fā)現(xiàn)有191個蛋白改變，其中111個表達下調，80個表達上調，差異表達的蛋白主要在補體和凝血級聯(lián)反應、PI3K/Akt信號通路以及膽固醇代謝通路富集[19]。DR患者淚液中脂質運載蛋白1、乳鐵蛋白、催淚蛋白、溶菌酶C、親脂蛋白A和免疫球蛋白λ鏈C區(qū)等具有更高的表達水平[20]。在DR篩查中，將淚液蛋白組學與眼底照相相結合，獲得了較高的敏感性和特異性(0.93/0.78)[21]。唾液的收集更加簡單無創(chuàng)且具可重復性，Chee等[22]比較了T2DM伴PDR、NPDR和NDR患者的唾液蛋白組學結果，共發(fā)現(xiàn)了119種差異表達的蛋白，其中PDR組中增加最多的是與免疫炎性反應相關的防御蛋白和代謝蛋白，這也意味著差異表達的蛋白質可能成為NDPR進展到PDR的生物標志物。

4.2蛋白組學與DR發(fā)病機制2007年，首次有研究采用蛋白組學技術比較了正常大鼠及DM大鼠視網膜差異性蛋白譜[23]。在DR體外研究中，Chen等[24]在高糖培養(yǎng)的視網膜色素上皮細胞中鑒定出多種參與細胞代謝、細胞凋亡、信號轉導、基因調控和轉運的蛋白，并通過進一步在DR患者血漿中進行驗證后得出結論，DR體外模型中存在完整的蛋白質網絡并可能在DR發(fā)展中發(fā)揮作用。DR體內體外實驗僅能用于早期DR的研究，目前仍缺乏晚期DR動物模型。隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，越來越多的研究集中于玻璃體液的蛋白組學研究，原因在于玻璃體液作為一種能通過手術獲得的視網膜近端生物流體，可用以識別視網膜疾病的蛋白質和通路改變。李志琛等[25]比較了14例DR患者與6例NDR患者的血漿蛋白組學，共篩選出41個差異表達蛋白，其可能通過促進新生血管形成、影響凝血系統(tǒng)和血小板活性等多種機制參與DR發(fā)病。Weber等[26]應用蛋白組學分析了PDR患者與黃斑裂孔或視網膜前膜患者玻璃體液的蛋白質改變并進行通路分析，結果證實PDR患者玻璃體液中表現(xiàn)出顯著的代謝通路的激活及神經保護通路的抑制。另有研究首先通過比較PDR與孔源性視網膜脫離患者玻璃體液蛋白組學，發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體液中組織蛋白酶B、D和L顯著下調，進一步在高糖誘導的視網膜血管內皮細胞模型中進行驗證后證實，下調的組織蛋白酶B、D和L會通過降低自噬從而增加細胞凋亡[27]。

4.3蛋白組學與治療蛋白組學用于DR藥物療效評估及治療指導。Ly等[28]研究發(fā)現(xiàn)使用二甲雙胍治療與未治療的T2DM(db/db)小鼠視網膜有63種差異表達的蛋白質，通路富集分析表明二甲雙胍能使部分參與電子傳遞和細胞信號傳導的蛋白質正?；?。激光是DR的有效治療方法，研究通過比較DR大鼠激光治療前后的視網膜蛋白組學，證實33種蛋白質及2條生物學通路可能發(fā)揮作用[29]?？筕EGF治療已成為中晚期DR主要方式，但仍存在療效有限、需反復注射以及注射后纖維化反應增加等不足。有研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體液中補體因子及凝血調節(jié)因子的富集程度明顯增高，其可能通過誘發(fā)血栓形成、白細胞停滯和炎癥反應，從而參與DR病理過程。而貝伐單抗玻璃體腔注射后，并未對補體因子及凝血調節(jié)因子表達水平產生影響，這也意味著類固醇、非甾體抗炎藥以及他汀類等藥物可能對PDR的治療產生積極療效[30]。近年來，越來越多的研究表明抗VEGF增加了PDR患者發(fā)生牽拉性視網膜脫離的風險，但其分子機制尚未完全清楚。通過對行抗VEGF及PRP治療的PDR患者玻璃體液進行蛋白組學比較，發(fā)現(xiàn)抗VEGF誘導的纖連蛋白及纖維蛋白原a、b、c鏈在玻璃體內表達增加，因此，PDR患者接受抗VEGF治療后應及時進行玻璃體切割手術[31]。

5 DR與代謝組學

代謝組學是對氨基酸、脂肪酸、碳水化合物或其他細胞代謝產物的定量收集，代謝產物水平可反映機體代謝功能。代謝組學分析具有較高的靈敏度及特異度，且方法相對經濟簡單并更易應用于臨床，其提供的生物標志物在疾病早期診斷中具有巨大潛力。代謝組學分析分為非靶向和靶向檢測，非靶向是將樣本中所有的代謝物進行識別，范圍廣，可全面尋找差異的代謝物，主要用于初步篩查，但缺點在于準確性不高。靶向是對既定代謝物進行定量定性分析。代謝組學已應用于DR篩查及發(fā)病機制的研究中。

5.1代謝組學與生物標志物DR相關代謝組學檢測樣本多來源于患者的血漿、血清、玻璃體液或房水。2021年一篇系統(tǒng)評價納入了9項DR患者的非靶向代謝組學研究，結果總結了包括L-谷氨酰胺、L-乳酸、丙酮酸、乙酸、L-谷氨酸、D-葡萄糖、L-丙氨酸、L-蘇氨酸、瓜氨酸、L-賴氨酸和琥珀酸在內9種DR潛在生物標志物，提示DR患者與正常人在氨基酸代謝和能量代謝方面存在差異[32]。Curovic等[33]對不同分級的DR患者的血清脂代謝產物進行檢測，發(fā)現(xiàn)血清3,4二羥基丁酸(3,4 dihydroxybutyric acid, 3,4-DHBA)是DR進展的獨立風險標志物。

5.2代謝組學與DR發(fā)病機制DR的代謝組學研究證實多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)及肌酸等參與DR啟動與發(fā)展過程[34]。PUFA在血管生成、炎癥調節(jié)等方面具有關鍵作用，DR患者血清PUFA降低可能是視網膜病變進展的重要原因[35]。Peng等[36]亦證實血漿不飽和脂肪酸PGF2α降低是NPDR進展的危險因素，予以STZ誘導的DM小鼠PGF2α類似物，可減輕視網膜毛細血管損傷。脂質代謝組學結合多元分析及靶點預測認為，渴絡欣膠囊可通過逆轉db/db小鼠22個關鍵脂質分子的表達從而延遲DR，其過程涉及MAPK/NF-κB、PI3K/Akt以及MAPK/Erk通路[37]。Tomita等[38]分析了日本43例PDR患者及21例視網膜前膜患者玻璃體液代謝物，發(fā)現(xiàn)PDR患者肌酸水平明顯降低。進一步建立氧誘導小鼠視網膜病變模型，并在小鼠出生后12～16d予以肌酸治療，發(fā)現(xiàn)視網膜新生血管出現(xiàn)閉塞，此結果證實了肌酸降低與PDR新生血管形成之間的密切關系。代謝組學可反應機體的生理或病理狀態(tài)，但其結果可能隨年齡、性別、飲食、疾病狀態(tài)、環(huán)境變化或者治療干預等因素變化而變化。

6 DR與多組學結合

盡管以上不同組學的研究在探索DR發(fā)病機制、提供分子標志物及尋找治療靶點等方面提供了極大的幫助，但DR發(fā)生發(fā)展涉及多系統(tǒng)、多層次的改變，從單一角度無法很好地解釋疾病的發(fā)展過程，故多組學聯(lián)合分析能從多水平、多角度地描述DR特征。Skol等[39]聯(lián)合基因組學和轉錄組學研究證實促卵泡激素基因(folliculin,FLCN)是DR的易感基因。視網膜激光光凝已廣泛應用于DR的治療中，Tababat-Khani等[40]對體外培養(yǎng)的人視網膜色素上皮細胞進行激光光凝，聯(lián)合轉錄組學和蛋白組學進行分析表明，激光可誘導細胞保護性熱休克蛋白Hsp70表達，抑制血管通透性因子碳酸酐酶9的表達，從而通過參與細胞更新、修復和炎癥過程，最終改善視網膜缺血及血管滲漏。

7小結與展望

通過對不同組學研究結果的整合，能幫助我們全面認識DR的病理生理機制及生物標志物，為尋找治療靶點提供新思路。然而，目前的研究仍存在局限性:(1)多組學之間相互調控的機制十分復雜，尚需進一步深入研究。(2)盡管生物標志物表現(xiàn)出較好的DR診斷和預測功能，但因不同研究對象的基因表型、治療方案、血糖控制情況及隨訪時間等因素存在異質性，生物標志物還無法廣泛應用于臨床。我們還需進行多中心的臨床研究，建立豐富的生物樣本庫并進行多組學檢測。相信隨著組學技術的發(fā)展和多組學的聯(lián)合應用，DR的診治水平將得到重大提高。