雷公藤甲素通過(guò)抑制PAK4通路抑制非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)和遷移

楊文平 亓玉心 鄭亮 劉長(zhǎng)江 徐淑娜 周玉法

(濟(jì)南市人民醫(yī)院 1呼吸科，山東 濟(jì)南 271100；2藥劑科)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙、飲食、環(huán)境和遺傳因素等與肺癌發(fā)生密切相關(guān)〔1，2〕。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，NSCLC占所有肺癌80%～85%，是最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型〔3〕。NSCLC惡性程度較高，發(fā)病隱匿，57%的患者在診斷時(shí)即為晚期。目前，手術(shù)切除和化療是NSCLC最常用的臨床治療手段〔4，5〕，然而由于NSCLC轉(zhuǎn)移率較高，患者診斷時(shí)常處于中晚期已無(wú)法接受手術(shù)治療，Ⅳ期NSCLC 5年生存率不到1%〔6，7〕。雷公藤甲素(Tri)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，又稱(chēng)雷公藤內(nèi)酯或雷公藤內(nèi)酯醇。Tri具有多種生物學(xué)活性，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗類(lèi)風(fēng)濕等作用，并且對(duì)老年癡呆也具有改善作用〔8，9〕。研究表明，Tri對(duì)多種癌癥如胃癌、乳腺癌、粒細(xì)胞白血病及胰腺癌等具有良好的抗腫瘤活性〔10〕，宋嵐等〔11〕報(bào)道Tri可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549凋亡，然而其具體機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討Tri通過(guò)抑制P21活化蛋白激酶(PAK)4通路抑制NSCLC的生長(zhǎng)和遷移。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自ATCC，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，CO2濃度5%。DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS)，同時(shí)添加100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉。細(xì)胞按照加入不同濃度Tri分為4組：0.0 μg/L Tri組、0.5 μg/L Tri組、2.0 μg/L Tri組及8.0 μg/L Tri組。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后轉(zhuǎn)移至96孔板，在培養(yǎng)基中分別加入0.0，0.5，2.0和8.0 μg/L Tri培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞重懸浮后接種于96孔板后培養(yǎng)基中加入不同濃度Tri 37℃培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5% MTT)37℃孵育4 h，DESO溶解結(jié)晶，分光光度計(jì)檢測(cè)538 nm處吸光值。

1.3AnnexinV-FITC染色 細(xì)胞外膜上磷脂酰絲氨酸通過(guò)AnnexinV染色研究細(xì)胞凋亡。將細(xì)胞接種于6孔板后用不同濃度Tri處理48 h，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將細(xì)胞重懸于AnnexinV結(jié)合緩沖液中，隨后與AnnexinV-FITC共孵育15min，細(xì)胞轉(zhuǎn)移玻璃皿底部，并由CellR熒光顯微鏡記錄，以綠色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例。

1.4腫瘤成球能力實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以每孔2×103密度接種于24孔板，在添加1%甲基纖維素的DMEM-F12半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)基中添加對(duì)應(yīng)濃度Tri，用相位差顯微鏡測(cè)量球體直徑，并計(jì)算球體直徑平均值。

1.5Western印跡 不同濃度Tri處理后，A549細(xì)胞以放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液裂解取全蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h后加入一抗室溫孵育2 h〔anti-GAPDH 1∶1 000，anti-PAK4 1∶500，anti-p絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)1∶500，anti-p蛋白激酶(RAF)1：1500，anti-p細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1∶500〕后4℃過(guò)夜。第2天，TBST洗滌后室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法化學(xué)發(fā)光顯影，Quantity One 軟件分析條帶灰度值。

1.6遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞處理后轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。Transwell上室加入基質(zhì)膠，含有10%FBS培養(yǎng)基置于下層，上室中加入細(xì)胞懸浮液。37℃培養(yǎng)24 h后4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)選擇8個(gè)視野計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)步驟同上但不加入基質(zhì)膠。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度Tri對(duì)NSCLC活性的影響 與0.0 μg/L Tri組24、48、72 h細(xì)胞活性比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度Tri對(duì)A549 細(xì)胞活性的影響

2.2Tri對(duì)NSCLC細(xì)胞凋亡和腫瘤成球能力的影響 DAPI染色結(jié)果顯示，隨著Tri處理濃度升高可見(jiàn)染色質(zhì)固縮逐漸增多，說(shuō)明凋亡細(xì)胞逐漸增多。見(jiàn)圖1。與0.0 μg/L Tri組細(xì)胞凋亡率比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著上升，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)；與0.0 μg/L Tri組細(xì)胞成球直徑比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著下降，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖1 不同濃度Tri對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響(DAPI和Annexin V-FITC染色，×50)

圖2 不同濃度Tri對(duì)A549 細(xì)胞成球直徑的影響(×200)

表2 不同濃度 Tri 對(duì) A549 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞成球直徑的影響

2.3Tri對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 與0.0 μg/L Tri組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

2.4PAK4信號(hào)通路在Tri抑制NSCLC中的作用 與0.0 μg/L Tri組PAK4、p-MEK、p-RAF、p-ERK比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表4、圖4。

表3 不同濃度Tri對(duì)A549 細(xì)胞侵襲和遷移的影響個(gè),n=6)

圖3 不同濃度Tri對(duì)A549 細(xì)胞侵襲和遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×400)

表4 不同濃度Tri對(duì)A549 細(xì)胞PAK4信號(hào)通路的影響

1～4：0.0 μg/L Tri組、0.5 μg/L Tri組、2.0 μg/L Tri組、8.0 μg/L Tri組圖4 不同濃度Tri對(duì)A549 細(xì)胞PAK4信號(hào)通路的影響

3 討 論

NSCLC主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌，是主要的肺癌類(lèi)型，65%以上NSCLC患者診斷時(shí)已處于晚期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移〔3，12〕。Tri是提取自傳統(tǒng)中藥雷公藤的活性成分，研究發(fā)現(xiàn)Tri具有較好的抗腫瘤活性〔13，14〕。

宋嵐等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，Tri可顯著抑制體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。磷脂酰絲氨酸是細(xì)胞膜的主要組分之一，在正常情況下位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞壞死或凋亡時(shí)，則遷移至細(xì)胞膜外側(cè)。Annexin V是一種鈣依賴(lài)性的磷脂結(jié)合蛋白，它與磷脂酰絲氨酸具有高度結(jié)合力。FITC標(biāo)記的Annexin V可以作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸，標(biāo)記壞死或凋亡細(xì)胞〔15〕。同樣AnnexinV-FITC染色結(jié)果顯示，隨Tri處理濃度升高磷脂酰絲氨酸熒光強(qiáng)度逐漸升高，說(shuō)明細(xì)胞凋亡逐漸增多。腫瘤細(xì)胞由于沒(méi)有接觸抑制，在體外培養(yǎng)易形成腫瘤細(xì)胞球體，可作為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的指標(biāo)。研究報(bào)道Tri可抑制肺癌細(xì)胞Spc-A1侵襲〔16〕。

宋嵐等〔11〕對(duì)Tri抑制A549增殖的研究認(rèn)為，Tri通過(guò)降低Survivin和B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2表達(dá)并升高Fas表達(dá)是Tri誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制。PAK是一類(lèi)進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PAK4是其中的代表性分子。PAK4被細(xì)胞外信號(hào)活化后，通過(guò)下游結(jié)合蛋白或激酶底物啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄并調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程〔17〕。肖琴等〔18〕報(bào)道，PAK4在 NSCLC腫瘤組織中表達(dá)明顯升高，且NSCLC患者血漿中PAK4濃度明顯升高。

綜上，Tri可通過(guò)抑制PAK4信號(hào)通路抑制NSCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)其凋亡。