吡侖帕奈對癲癇大鼠ERK/CREB/BDNF信號通路及認(rèn)知功能的影響

尤華琴 張延英 吳俊曉 劉前

(1南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473000；2南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

癲癇病是世界上最嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，其特征在于無故癲癇的反復(fù)發(fā)作〔1〕。盡管離子通道或神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)療法可有效緩解癲癇患者發(fā)作癥狀，但對約40%患者無效，甚至可能加重認(rèn)知障礙等并發(fā)癥〔2,3〕。因此，明確藥物的作用機(jī)制對改善癲癇臨床治療至關(guān)重要。吡侖帕奈(PER)是于2012年上市的第三代抗癲癇藥物，主要通過作用于α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體發(fā)揮抗癲癇作用，但其具體作用途徑尚未完善〔4〕。研究證實，活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)/腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)信號通路與癲癇大鼠發(fā)作次數(shù)減少及記憶障礙恢復(fù)密切相關(guān)〔5〕，但PER對癲癇的治療作用是否與ERK/CREB/BDNF途徑相關(guān)尚不清楚。本研究通過戊四氮(PTZ)誘導(dǎo)制備大鼠癲癇模型，研究PER在癲癇治療過程中對ERK/CREB/BDNF相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠62只，6周齡，體重(200±20)g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0036，動物使用許可證號：SYXK(滬)2018-0049，動物質(zhì)量合格證號：XP202030674。本研究經(jīng)南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校動物倫理委員會批準(zhǔn)，并遵守3R保護(hù)原則進(jìn)行實驗。實驗前動物均在安靜、清潔的實驗環(huán)境下飼養(yǎng)1 w，給予適宜的溫度(23～25℃)和24 h光照/暗周期，允許自由飲食。

1.2主要藥品與試劑 PER(批號：H20190054，規(guī)格2 mg/片)購自衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司；PTZ(批號：P6500)購自美國Sigma公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：SEKR-0009)、白細(xì)胞介素(IL)-10 ELISA試劑盒(批號：SEKR-0006)、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(批號：BC0025)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(批號：BC0170)、尼氏染色液(批號：G1432)均購自北京Solarbio公司；蛋白抽提試劑盒(批號：G7011)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號：G7134)均購自上海信帆生物科技有限公司；ERK小鼠抗大鼠單克隆抗體(批號：13-6200)、磷酸化(p)-ERK小鼠抗大鼠單克隆抗體(批號：13-6258)、CREB小鼠抗大鼠單克隆抗體(批號：MA1-083)、p-CREB小鼠抗大鼠單克隆抗體(批號：MA5-11192)、BDNF兔抗大鼠單克隆抗體(批號：PA-95183)和β-肌動蛋白(β-actin)兔抗大鼠單克隆抗體(批號：PA1-183)、山羊抗鼠二抗(批號：A32731)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3主要儀器 離心機(jī)(型號：FG-NG003)購自北京佰司特貿(mào)易有限責(zé)任公司；生物顯微鏡(型號：CX41)購自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀(型號：PR4100)和凝膠成像儀(型號：VersaDoc 3000)均購自美國Bio-Rad公司。

1.4動物模型制備及分組 將大鼠編號，采取隨機(jī)數(shù)表法分為對照組(n=12)和實驗組(n=50)，其中實驗組均給予腹腔注射30 mg/kg PTZ，注射后觀察1 h左右，連續(xù)注射4 w。大鼠出現(xiàn)3次以上雙側(cè)前肢抽搐，并伴有身體直立等癥狀，則建模成功〔6〕，其中建模過程中有2只大鼠未出現(xiàn)以上癥狀，建模失敗，成功建模48只大鼠。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為：模型組、PER低、中、高劑量組，每組12只。然后各組按照以下方式處理10 w：對照組和模型組給予生理鹽水灌胃處理，PER低劑量組、PER中劑量組和PER高劑量組分別給予0.3、1.0和3.0 mg/kg〔7〕PER灌胃處理，給藥體積均為10 ml/kg，1次/d。

1.5癲癇發(fā)作評估〔8〕PER灌胃處理10 w后，根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)評估觀察每只大鼠癲癇發(fā)作1 h的強(qiáng)度。Racine分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：無任何反應(yīng)；1級：多動和抽搐；2級：肌陣孿性抽搐或點(diǎn)頭；3級：前肢陣孿；4級：站立在其后腿上；5級：陣孿性癲癇發(fā)作且無反射。另外，觀察1 h內(nèi)癲癇發(fā)作頻率和每次癲癇持續(xù)時間。

1.6莫里斯水迷宮(MWM)實驗〔9〕定位航行實驗：將各組大鼠在迷宮水箱中連續(xù)訓(xùn)練5 d，每次進(jìn)行4組平行實驗，間隔120 s。第1天讓大鼠自由游泳1 min后開始實驗，其余4 d在同時段進(jìn)行實驗，但隨機(jī)選擇入水點(diǎn)，并將大鼠面壁放入池水中，記錄大鼠從入水至尋找并爬上平臺花費(fèi)的時間，即為逃避潛伏期(s)，如在120 s內(nèi)未完成，則將潛伏期計為120 s。空間探索試驗：在第6天撤走平臺后，隨機(jī)選擇入水點(diǎn)將大鼠面壁放入池水中，測量大鼠在120 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)及在目標(biāo)象限停留時間。

1.7大腦皮層組織勻漿的制備 在MWM實驗結(jié)束2 h后，處死大鼠，取大腦皮層組織，生理鹽水洗滌后均分成兩半。立即用含三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，50 mmol/L，pH7.4)和蔗糖(300 mmol/L)的溶液對一半大鼠大腦皮層組織充分勻漿，離心(10 000 r/min，10 min)，分離上清，分裝后，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取1.7保存的大腦皮層組織勻漿上清液，按照試劑盒說明書步驟，檢測MDA、TNF-α、IL-10水平和SOD活性。

1.9尼氏染色實驗 取1.7中另一半大鼠大腦皮層組織，在3%甲醛溶液固定24 h，酒精脫水，石蠟包埋，切片(5 μm/片)，置于載玻片，用甲基紫染色液涂片，染色10～20 min，二甲苯中沖洗，封片后，于顯微鏡下觀察。

1.10Western印跡分析實驗 蛋白抽提試劑盒提取1.7中大腦皮層組織勻漿上清液總蛋白，然后采用BCA法檢測蛋白含量，經(jīng)12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，TBST洗3次，依次加入一抗ERK、p-ERK、CREB、p-CREB、BDNF和β-actin(稀釋比均為1∶1 000)，4℃過夜，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，化學(xué)發(fā)光液(ECL)曝光顯影，利用Image-J軟件分析目標(biāo)蛋白條帶灰度相對值。

1.11統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析，SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1PER對癲癇大鼠發(fā)作行為的影響 與對照組相比，模型組癲癇發(fā)作頻率、癲癇持續(xù)時間和Racine分級顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，PER低劑量組、PER中劑量組和PER高劑量組癲癇發(fā)作頻率、癲癇持續(xù)時間和Racine分級依次明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組癲癇發(fā)作行為比較

2.2PER對癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響

2.2.1訓(xùn)練期間大鼠逃避潛伏期變化 與對照組相比，第1、2、3、4和5天模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，第1、2、3、4和5天PER低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期依次明顯降低(P<0.05)；與第1天相比，各組逃避潛伏期隨訓(xùn)練時間的延長呈逐漸縮短趨勢。見表2。

2.2.2訓(xùn)練后的空間記憶能力變化 與對照組相比，模型組大鼠穿越原平臺位置的次數(shù)顯著降低(P<0.05)，目標(biāo)象限停留時間顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，PER低、中、高劑量組大鼠穿越原平臺位置的次數(shù)依次增加(P<0.05)，目標(biāo)象限停留時間依次降低(P<0.05)。見表2。

2.3PER對癲癇大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響 對照組尼氏小體豐富且分布均勻，大腦皮層神經(jīng)元排列整齊；模型組大腦皮層神經(jīng)元胞質(zhì)染色不足，神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂；經(jīng)PER治療后，各組大腦皮層組織神經(jīng)元形態(tài)得以恢復(fù)。見圖1。

表2 各組逃避潛伏期、空間探索試驗結(jié)果比較

圖1 各組大腦皮層組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(尼氏染色，×400)

2.4PER對癲癇大鼠大腦皮層組織p-ERK/ERK、p-CREB/CREB和BDNF蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組大腦皮層組織p-ERK/ERK、p-CREB/CREB和BDNF蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，PER低劑量組、中、高劑量組大腦皮層組織p-ERK/ERK、p-CREB/CREB和BDNF蛋白表達(dá)依次明顯升高(P<0.05)。見圖2、表3。

2.5PER對癲癇大鼠大腦皮層組織MDA、TNF-α、IL-10水平和SOD活性的影響 與對照組相比，模型組大腦皮層組織MDA和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，IL-10水平和SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，PER低、中和高劑量組大腦皮層組織MDA和TNF-α水平依次顯著降低(P<0.05)，IL-10水平和SOD活性依次明顯升高(P<0.05)。見表3。

1～5：對照組，模型組，PER低劑量組，PER中劑量組，PER高劑量組圖2 各組大腦皮層組織ERK、CREB和BDNF蛋白表達(dá)

表3 各組大腦皮層組織MDA、TNF-α、IL-10水平、SOD活性、ERK、CREB和BDNF蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

癲癇病在全球范圍內(nèi)影響超過5 000萬人，且死亡率呈逐年增加趨勢〔10〕。此外，癲癇可表現(xiàn)為原發(fā)性腦腫瘤、轉(zhuǎn)移性疾病、血管或手術(shù)并發(fā)癥、機(jī)會性感染或繼發(fā)于抗腫瘤治療〔11〕。認(rèn)識功能障礙是癲癇最嚴(yán)重并發(fā)癥之一，在患者治療管理中具有重要作用〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，臨床治療對患者認(rèn)知功能定時監(jiān)測，可有效減少認(rèn)知功能損害和不良預(yù)后〔13〕。因此，提升癲癇患者認(rèn)知功能是改善當(dāng)前藥物藥效的最有效途徑。PTZ誘導(dǎo)動物癲癇發(fā)作，是篩選并研究抗癲癇藥及其作用機(jī)制常見的大鼠癲癇模型〔14〕。

PER是以AMPA受體為靶點(diǎn)、具有高度選擇性的抗癲癇藥物，可用于原發(fā)性全面強(qiáng)直陣孿癲癇的治療〔15,16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，PER治療后能夠減少大鼠癲癇發(fā)作頻率、癲癇持續(xù)時間和Racine分級，初步驗證了PER對癲癇的治療作用。本研究結(jié)果提示PER治療能夠改善PTZ誘發(fā)的癲癇大鼠認(rèn)知功能障礙。癲癇大鼠大腦皮層組織神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生異常。Mohseni-Moghaddam等〔17〕研究證實，抑制癲癇大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，可能與減輕認(rèn)知功能障礙的神經(jīng)元損傷相關(guān)。本研究結(jié)果提示PER可能通過降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對癲癇大鼠神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，從而達(dá)到控制癲癇發(fā)作的療效。

神經(jīng)元突觸的完整性是保障認(rèn)知功能正常的關(guān)鍵，其中BDNF是調(diào)節(jié)突觸形成的中重要因素〔18〕。CREB是一種參與調(diào)節(jié)BDNF轉(zhuǎn)錄的因子，其激活依賴于ERK通路，并與認(rèn)知過程密切相關(guān)〔19〕。本研究結(jié)果表明癲癇導(dǎo)致ERK/CREB/BDNF途徑激活受阻。在精神分裂癥大鼠中，加強(qiáng)CREB/BDNF/酪氨酸激酶受體(Trk)B途徑，能夠促進(jìn)ERK磷酸化水平，預(yù)防大鼠認(rèn)知障礙〔20〕；Liao等〔21〕和Ko等〔22〕證實，激活ERK/CREB信號通路，可以提高海馬組織中BDNF水平，對膽堿阻滯導(dǎo)致的大鼠或小鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙具有治療作用。本研究提示PER可能通過激活ERK/CREB/BDNF途徑，改善癲癇大鼠的認(rèn)知障礙。