超短波對(duì)大鼠急性肺損傷炎癥反應(yīng)及細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)的影響

廖源 屈萌艱 劉靜 鐘培瑞 曾亞華 王婷 張青秀 肖豪 李蘭 劉丹妮 楊璐 周君

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 2康復(fù)醫(yī)學(xué)中心；3康復(fù)醫(yī)學(xué)科；4康復(fù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室)

急性肺損傷(ALI)是指心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭〔1〕。ALI 的實(shí)質(zhì)是一個(gè)炎癥反應(yīng)和毛細(xì)血管通透性增加的綜合征〔2〕，細(xì)胞黏附分子(CAMs)介導(dǎo)的炎性損傷機(jī)制在ALI病理生理過程中的作用越來越受到重視。其家族成員細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷徙及向炎癥部位的積聚過程〔3〕，故對(duì)于ICAM-1研究也越來越多。超短波治療是一種高頻電磁場(chǎng)的物理因子治療，可減輕人體炎癥反應(yīng)。研究報(bào)道〔4〕，聯(lián)合使用超短波治療肺部感染，其療效較單獨(dú)使用抗生素好，尤其在墜積性肺炎、慢性阻塞性肺疾病等方面的抗炎效果明顯〔5～9〕，但鮮見超短波在ALI中應(yīng)用。本研究擬探討超短波對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠ALI炎癥反應(yīng)及ICAM-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 24只3月齡體重為(429.72±44.00)g的清潔級(jí)雄性SD大鼠，從湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購買〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004〕，實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于湖南省衡陽市南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)在溫度20～25℃，濕度50%～60%，12 h間隔照明的環(huán)境中，予以自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。在整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵循中華人民共和國(guó)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2主要實(shí)驗(yàn)物品 LPS(北京Solarbio公司)，白細(xì)胞介素(IL)-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Proteintech公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)，多功能酶標(biāo)分析儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)(中國(guó)湖南湘儀公司)，切片機(jī)(德國(guó)LEICA 公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(中國(guó)北京六一公司)，磁力攪拌器(中國(guó)雷磁公司)，旋渦混合器(中國(guó)江蘇其林貝爾公司)，生物樣品均質(zhì)儀(中國(guó)杭州奧盛)。

1.3主要材料及試劑 1.5 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris HCl)(pH8.8)溶液、1 mol/L Tris HCL溶液(美國(guó)Sigma公司)，10%過硫酸銨溶液(中國(guó)上海國(guó)藥公司)，1.74 mg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(中國(guó)大連美倫公司)、30%亞甲基雙丙烯酰胺(Acr/Bic)液(中國(guó)北京金泰宏達(dá)公司、美國(guó)Sigma公司),10%麗春紅染液(中國(guó)上海國(guó)藥公司),還原型5%上樣緩沖液、電泳液緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液(美國(guó)Sigma公司),三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)緩沖液、磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)緩沖液、封閉液(中國(guó)鹽城賽寶公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 24只大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：對(duì)照組、ALI組、超短波組。

1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模 實(shí)驗(yàn)大鼠稱重后，按3 ml/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，頸部備皮，消毒后沿頸部正中線切開皮膚、剝離皮下組織、暴露氣管，用1 ml注射器刺入氣管內(nèi)按5 mg/kg體重緩慢滴注LPS(濃度為5 mg/ml)，滴注完畢將動(dòng)物直立5 s，逐層縫合傷口，再次絡(luò)合碘消毒。對(duì)照組同樣方法暴露氣管，滴注等量生理鹽水。

1.4.3實(shí)驗(yàn)干預(yù) 對(duì)照組、ALI組不干預(yù)，超短波組在大鼠滴注LPS即刻、4 h、8 h給予超短波干預(yù)，共干預(yù)3次。采用 CDB-1超短波電療機(jī)(上海醫(yī)療器械高技術(shù)公司生產(chǎn))，刺激強(qiáng)度為50 mA，電極板面積為290 mm×200 mm，胸背對(duì)置,兩個(gè)電極板之間距離為11 cm，預(yù)熱5 min，干預(yù)15 min/次。

1.5標(biāo)本檢測(cè)

1.5.1肺組織濕重(W)/干重(D)比值測(cè)定 在氣管內(nèi)滴注LPS或生理鹽水24 h后，麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，取右上肺組織檢測(cè)肺組織W/D比值：肺組織置于干凈錫箔紙上，馬上用干凈濾紙吸干肺組織表面水分，然后將肺組織連同錫箔紙一起置于玻璃瓶中精確稱質(zhì)量后W，再將肺組織連同錫箔紙置于60℃恒溫箱中烘烤48 h后測(cè)定肺組織D，計(jì)算出肺組織 W/D比值評(píng)估肺組織水腫程度。

1.5.2用蘇木素-伊紅(HE)染色進(jìn)行病理學(xué)觀察和肺組織損傷評(píng)分 在氣管內(nèi)滴注LPS或生理鹽水24 h后，麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取左下肺組織進(jìn)行HE染色、病理評(píng)估。肺組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔4〕：①肺泡充血,②出血,③肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集,④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4 項(xiàng)指標(biāo)，分別依病變輕重評(píng)為0～4分(0分指無病變或非常輕微病變；1分為輕度病變；2分為中度病變；3分為重度病變；4 分為極重度病變)，總分16分。4 項(xiàng)評(píng)定分?jǐn)?shù)總和為肺組織病理半定量的總評(píng)分。

1.5.3ELISA檢測(cè)血清IL-6、TGF-β水平 在氣管內(nèi)滴注LPS或生理鹽水24 h后，麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，眼眶取血后，處死動(dòng)物。全血標(biāo)本于室溫放置2 h，于4℃ 2 000 g離心15 min，取上清液，-80℃保存，以備ELISA檢測(cè)。ICAM-1正義鏈：5′-CTGCCTCTGC TCCTGGTCCTG-3′，反義鏈：5′-CATCCAGTTAGTCT CCAACCCC-3′，171 bp；β-actin正義鏈：5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，反義鏈：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′，223 bp。

1.5.4Western印跡檢測(cè)ICAM-1蛋白的表達(dá) 在氣管內(nèi)滴注LPS或生理鹽水24 h后，麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取右下肺組織放入凍存管，迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中低溫保存，用于Western印跡檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1肺組織HE染色及肺組織損傷評(píng)分 肺組織HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；ALI組肺組織可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集，有少量紅細(xì)胞滲出，肺泡壁變厚斷裂，肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯；超短波組肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)急性肺損傷組完整，肺組織間中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，紅細(xì)胞滲出減少。見圖1。肺組織損傷評(píng)分：ALI組較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；超短波組較ALI組明顯減低(P<0.01)。見表1。

2.2肺組織W/D比值比較 ALI組W/D比值較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，超短波組與ALI組相比，比值有減低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3血清IL-6、TGF-β水平 ALI組IL-6較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，超短波組較ALI組明顯減低(P<0.05)；ALI組TGF-β較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，超短波組較ALI組明顯升高(P<0.05)。見表1。

圖1 ALI大鼠肺組織病理切片(HE染色，×200)

表1 各組W/D比值、IL-6及TGF-β水平、ICAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)、肺組織損傷評(píng)分比較

2.4ICAM-1 mRNA的表達(dá) ALI組ICAM-1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，超短波組較ALI組明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.5Western印跡檢測(cè)ICAM-1蛋白的表達(dá) 急性肺損傷組的肺組織ICAM-1蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，超短波組較急性肺損傷組明顯降低(P<0.01)。見表1、圖2。

圖2 肺組織ICAM-1蛋白的表達(dá)

3 討 論

ALI是臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一〔10〕，臨床以氣道及肺實(shí)質(zhì)內(nèi)的急性炎癥反應(yīng)為主要特點(diǎn)，重者可轉(zhuǎn)為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，從而直接導(dǎo)致死亡的發(fā)生。ALI和ARDS的重要病理變化是過度炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重?fù)p傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮〔11,12〕。

ALI目前比較公認(rèn)的機(jī)制是各種病因誘導(dǎo)肺內(nèi)促炎因子生成增加，由多種炎性介質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與，并呈瀑布樣炎性繼發(fā)性損傷與繼發(fā)性彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷〔13〕。由此可見如何處理炎癥反應(yīng)是治療ALI的關(guān)鍵。超短波治療具有擴(kuò)張血管，使血管壁通透性增高，改善血液循環(huán)，促進(jìn)炎癥吸收，減輕水腫，增強(qiáng)組織營(yíng)養(yǎng)，加強(qiáng)局部組織代謝的生理效應(yīng)〔14〕，常常運(yùn)用到臨床各種炎癥的治療方案中，尤其是用于肺部的炎癥的對(duì)癥處理〔5～9〕。

IL在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過程中均發(fā)揮重要作用。IL-6是炎癥急性期合成的重要介質(zhì)，參與肺部炎癥病理過程〔15,16〕，并且能反映肺炎嚴(yán)重程度〔17～19〕。TGF-β屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族成員之一，以其能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化而得名〔20〕，是一種多功能細(xì)胞因子，具有促進(jìn)血管生成、組織修復(fù)，調(diào)控免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控炎癥反應(yīng)等多種生理功能〔21,22〕。TGF-β主要通過抑制促炎因子的表達(dá)、抑制炎癥細(xì)胞的增殖、促進(jìn)免疫抑制因子的表達(dá)、抑制白細(xì)胞的生成，從而達(dá)到抗炎的作用〔23～26〕。本研究結(jié)果反映ALI發(fā)生了明顯的炎癥反應(yīng)，超短波可以抑制ALI大鼠的炎癥反應(yīng)；超短波能上調(diào)TGF-β水平發(fā)揮抗炎作用。

ICAM-1是一種具有多種生物功能的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員〔27〕，能介導(dǎo)細(xì)胞黏附、趨化、淋巴細(xì)胞歸巢等作用，參與炎癥和免疫反應(yīng)，通常以配體和受體相結(jié)合的方式發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)白細(xì)胞的功能活性和免疫反應(yīng)。ICAM-1還參與傳遞胞外-胞內(nèi)信號(hào)，使胞內(nèi)蛋白磷酸化、誘導(dǎo)蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子活化，從而產(chǎn)生大量的生物學(xué)活性〔28,29〕。正常時(shí)ICAM-1呈現(xiàn)較低的表達(dá),而在細(xì)胞因子如IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)的作用下表達(dá)增強(qiáng)〔30〕。本研究結(jié)果提示ICAM-1參與ALI的發(fā)生過程，經(jīng)過超短波治療后ICAM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均有明顯下降。ICAM-1升高與下降的趨勢(shì)與血清IL-6水平、病理結(jié)果和肺組織損傷評(píng)分的變化是一致的。綜上，超短波可通過下調(diào)ICAM-1的表達(dá)，抑制ALI大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。