人工智能在腫瘤組織病理標(biāo)志物分析中的應(yīng)用進(jìn)展*

張艷輝 吳江華 孫保存②

腫瘤靶向治療及免疫治療極大地促進(jìn)了精準(zhǔn)治療的發(fā)展。腫瘤個體化治療有賴于精確的腫瘤伴隨診斷（companion diagnostic，CD）。伴隨診斷能夠為腫瘤患者提供針對治療藥物療效反應(yīng)的信息。在臨床治療決策之前，往往需要對特定腫瘤組織生物標(biāo)記物進(jìn)行檢測，進(jìn)而篩選獲益患者，制定個體化治療方案[1]。傳統(tǒng)的腫瘤病理診斷模式依賴于診斷醫(yī)師的經(jīng)驗，不可避免具有一定的主觀性。隨著數(shù)字化掃描切片在臨床病理中的應(yīng)用，人工智能（artificial intelligence，AI）輔助診斷的計算機(jī)技術(shù)在腫瘤組織圖像分析中快速發(fā)展。本文概述AI在腫瘤病理中的應(yīng)用進(jìn)展，并闡述近年來AI在臨床診療密切相關(guān)的組織病理分子標(biāo)志物定量分析領(lǐng)域的探索及應(yīng)用，從而為腫瘤智能診療模式的發(fā)展提供有益的參考。

1 數(shù)字病理與深度學(xué)習(xí)

全病理切片數(shù)字掃描是一種現(xiàn)代數(shù)字系統(tǒng)與傳統(tǒng)光學(xué)顯微放大裝置有機(jī)結(jié)合的技術(shù)，其通過全自動顯微鏡掃描采集獲得高分辨率的數(shù)字圖像，并應(yīng)用計算機(jī)量化組織切片掃描圖像的形狀、大小和顏色等信息，從而得到虛擬的全切片數(shù)字圖像（whole slide image，WSI）。數(shù)字掃描技術(shù)推動傳統(tǒng)病理圖像的數(shù)據(jù)收集和觀察模式發(fā)生變化，數(shù)字病理（digital pathology，DP）的概念由此產(chǎn)生。DP系統(tǒng)目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、遠(yuǎn)程會診及數(shù)據(jù)分析等病理學(xué)領(lǐng)域[2]。不僅如此，DP圖像包含大量的像素級數(shù)字信息，從而為使用計算機(jī)工具輔助分析腫瘤組織的形態(tài)特征提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。

在過去的幾十年里，圖像處理領(lǐng)域的AI算法已從傳統(tǒng)的機(jī)器學(xué)習(xí)（machine learning，ML）逐漸發(fā)展為深度學(xué)習(xí)（deep learning，DL）。DL是ML的一個重要的分支，起源于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的研究，通過堆疊層結(jié)構(gòu)形成一個深度前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從而將低層特征組合成更加抽象的高層特征[3]。相比其他ML算法，DL對圖像數(shù)據(jù)的特征提取能力更強(qiáng)。其中，深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是組織病理圖像計算機(jī)識別中常用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之一，能夠?qū)呙璜@取的數(shù)字化病理圖像進(jìn)行特征提取及分析，從而將腫瘤病理診斷與計算機(jī)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，進(jìn)行目標(biāo)檢測、分類診斷和定量分析等病理診斷任務(wù)的輸出（圖1）。目前，DL在腫瘤分類、細(xì)胞檢測、突變預(yù)測及預(yù)后分析等方面取得了顯著的進(jìn)展，從而為臨床腫瘤病理提供了新的診斷模式[4]。

2 AI在腫瘤組織標(biāo)志物定量分析中的應(yīng)用

免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色作為檢測腫瘤蛋白表達(dá)水平的最常用技術(shù)方法，常用于確定腫瘤的分類、預(yù)后分級、藥物治療的靶點及預(yù)測藥物治療的反應(yīng)等，從而為臨床的診療策略提供組織病理學(xué)的篩選依據(jù)[1]。在臨床開展治療之前，檢測一些腫瘤分子病理標(biāo)記物的表達(dá)狀態(tài)已成為必要條件。目前AI應(yīng)用研究相對較多且具有代表性的腫瘤組織分子指標(biāo)，如人表皮生長因子受體-2（Her-2）、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原（Ki-67）及細(xì)胞程序性死亡配體-1（PD-L1）的圖像分析。

2.1 Her-2

在乳腺癌中，評估Her-2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增狀態(tài)對乳腺癌的臨床用藥至關(guān)重要。指南推薦采用IHC法檢測Her-2蛋白的表達(dá)水平或應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測Her-2基因的擴(kuò)增水平，兩種檢測方式相互補(bǔ)充。Her-2在IHC染色切片上通常表現(xiàn)為膜著色，病理醫(yī)師通過觀察腫瘤細(xì)胞的陽性比例及著色強(qiáng)度，對Her-2進(jìn)行綜合評分以指導(dǎo)靶向治療。然而，實踐研究表明這種Her-2的人工評分具有主觀性，容易出現(xiàn)診斷醫(yī)生之間的差異。

AI技術(shù)在Her-2判讀分析中的應(yīng)用較早，目前有不少應(yīng)用于乳腺癌Her-2檢測的數(shù)字分析軟件平臺。Tuominen等[5]提供了一個Her-2在IHC分析軟件-ImmunoMembrane。該研究采用顏色反卷積分離細(xì)胞膜陽性，根據(jù)膜染色強(qiáng)度和完整性生成定量評分。Brugmann等[6]開發(fā)了HER2-CONNECTTM軟件用于乳腺癌Her-2的數(shù)字圖像分析，基于評估細(xì)胞膜連續(xù)性的算法以評估Her-2的IHC染色結(jié)果，在訓(xùn)練集上的總體一致性為92.1%，在驗證集上的總體一致性為92.3%。Saha等[7]提出了一種基于DL的Her2Net，能夠?qū)er-2染色進(jìn)行自動化評估，該模型實現(xiàn)了高準(zhǔn)確率和僅6.84%的假陽性率。2016年舉辦的Path-Soc大會上，針對Her-2評分系統(tǒng)進(jìn)行了算法之間及計算機(jī)與病理專家之間的“人機(jī)比對”競賽。參與競賽的算法模型通過對86例乳腺癌Her-2的數(shù)字掃描圖像進(jìn)行分析進(jìn)而評估表達(dá)結(jié)果，與病理專家具有高度的可比性[8]。

Her-2在腫瘤細(xì)胞中可染色成完整的膜陽性或僅部分膜陽性。針對Her-2染色異質(zhì)性的特點，Tewary等[9]使用校正的白平衡對輸入圖像進(jìn)行預(yù)處理，并使用CMYK和RGB色彩空間提取蘇木素和腫瘤細(xì)胞膜上的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色。對于每個染色通道進(jìn)行分割和后處理生成掩模。隨后使用骨骼化和形態(tài)學(xué)方法對掩模按照完整或不完整膜染色進(jìn)行計數(shù)。此外，在Her-2熒光圖像分析中，Hofener等[10]提出了一種基于密度的方法來量化FISH信號，用于計算和確定Her-2與CEP17信號的比率，從而輸出Her-2熒光染色判讀結(jié)果。該研究表明，AI不僅能夠應(yīng)用于IHC圖像，也可應(yīng)用于熒光染色數(shù)字圖像的自動化分析。

計算機(jī)輔助診斷在Her-2染色評分算法的應(yīng)用表明了AI對分子病理指標(biāo)進(jìn)行精確定量評分方面的巨大潛力。Yue等[11]的多中心應(yīng)用測試表明，使用基于細(xì)胞級分類的Her-2評分算法和顯微鏡實時增強(qiáng)現(xiàn)實系統(tǒng)，可以顯著提高病理醫(yī)生對Her-2評估的準(zhǔn)確性和可靠性。Vandenberghe等[12]的研究顯示，AI輔助診斷可以通過識別誤診風(fēng)險高的病例以及顯著減少人工評分主觀性帶來的偏差，進(jìn)而輔助乳腺癌的臨床診療。除乳腺癌外，Her-2也廣泛使用于胃癌等腫瘤靶向治療獲益患者的篩選，但目前在其他癌種中AI判讀Her-2的研究鮮見報道。

2.2 Ki-67

Ki-67作為腫瘤增殖指數(shù)的指標(biāo)，常應(yīng)用于評估腫瘤的生長活性及腫瘤分級。在胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasm，NEN）中，Ki-67的定量讀數(shù)作為分級標(biāo)準(zhǔn)，對后續(xù)腫瘤的治療及預(yù)后預(yù)測起著關(guān)鍵的指導(dǎo)作用[13]。臨床實踐通過人工讀數(shù)Ki-67陽性的腫瘤細(xì)胞比例進(jìn)行腫瘤的分級，但可重復(fù)性并不理想。

目前，針對Ki-67的IHC檢測結(jié)果判讀方法，包括顯微鏡下視覺評估、人工手動計數(shù)、采集圖像半自動判讀以及數(shù)字圖像全自動判讀。在NEN中的Ki-67數(shù)字圖像與人工對比研究的結(jié)果表明，計算機(jī)輔助診斷效果要優(yōu)于單純的顯微鏡下人工視覺判讀[14]。在乳腺癌中，Voros等[15]通過數(shù)字化計數(shù)方法評估乳腺癌活檢數(shù)字圖像上的Ki-67指數(shù)，然后在相同圖像上疊加網(wǎng)格進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果顯示通過數(shù)字圖像計數(shù)可顯著提高Ki-67 指數(shù)分析的可重復(fù)性。國內(nèi)有研究應(yīng)用Nuclear 9.0軟件對細(xì)胞核的Ki-67染色進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)計算機(jī)輔助閱片與人工閱片一致性較好且具有省時、客觀性好、易質(zhì)控、重復(fù)性好等優(yōu)勢[16]。

通過計算機(jī)輔助圖像定量分析Ki-67可用于預(yù)后相關(guān)研究。Dirican等[17]使用ML方法對Ki-67評分及預(yù)后因素進(jìn)行聚類分析，表明Ki-67評分是一種與乳腺癌預(yù)后及其對新輔助化療反應(yīng)相關(guān)的實體腫瘤增殖標(biāo)志物。Wang等[18]采用人工常規(guī)方法和計算機(jī)輔助圖像分析方法計算159例肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤手術(shù)標(biāo)本Ki-67增殖指數(shù)，揭示區(qū)分低級別與高級別肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的Ki-67指數(shù)臨界值，用于預(yù)后預(yù)測。

由于Ki-67在腫瘤細(xì)胞及淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞中均可顯示陽性。因此，計算機(jī)識別Ki-67陽性細(xì)胞類別的準(zhǔn)確性和陽性標(biāo)記自動計數(shù)是全自動判讀的關(guān)鍵步驟。Niazi等[19]采用遷移學(xué)習(xí)方法，通過在Ki-67染色切片圖像中識別腫瘤邊界，對Ki-67指數(shù)的自動判讀具有較高的敏感性和特異性。Valkonen等[20]利用細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）-Ki-67雙重染色切片作為訓(xùn)練圖像，開發(fā)了一種基于深度學(xué)習(xí)的數(shù)字掩模，用于自動檢測和區(qū)分上皮細(xì)胞，具有良好的效果。計算機(jī)輔助Ki-67指數(shù)判讀顯示了定量分析結(jié)果和可重復(fù)性好等優(yōu)勢，但實現(xiàn)全自動分析，需要建立在良好的腫瘤細(xì)胞識別模型的基礎(chǔ)上。

2.3 PD-L1

近年來，基于免疫檢查點抑制劑的免疫治療為腫瘤精準(zhǔn)治療帶來了新的突破。IHC檢測PD-L1的表達(dá)作為預(yù)測標(biāo)志物已在國內(nèi)外許多醫(yī)院病理科中開展。染色結(jié)果通過病理醫(yī)師半定量判讀方式進(jìn)行評估，以指導(dǎo)腫瘤患者免疫治療獲益人群篩選。由于PD-L1可在腫瘤細(xì)胞及多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，陽性表達(dá)模式復(fù)雜，因此對PD-L1染色結(jié)果的判讀具有較大的挑戰(zhàn)性。多項實踐研究表明，臨床病理醫(yī)師對PD-L1判讀的一致性和可重復(fù)性均不足[21-22]。同時，人工估算的方式常無法獲取精確的PD-L1表達(dá)數(shù)值，在治療過程中可能存在療效的異質(zhì)性差異，上述問題給目前臨床免疫治療帶來了新的挑戰(zhàn)。

相對于病理醫(yī)生在光學(xué)顯微鏡下的視覺判讀，有多項研究嘗試建立一種基于數(shù)字切片和AI技術(shù)定量評估 PD-L1 表達(dá)評分的方法（表1）。Koelzer等[23]使用隨機(jī)森林樹的監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，在黑色素瘤的PD-L1染色數(shù)字圖像中定量分析腫瘤細(xì)胞的PD-L1評分，其結(jié)果與病理醫(yī)生在顯微鏡下對PD-L1的評分具有高度一致性（r=0.97，P＜0.000 1），同時數(shù)字圖像分析能夠降低PD-L1人工分析的差異。Kapil等[24]使用生成對抗網(wǎng)絡(luò)的半監(jiān)督方法通過整合人工標(biāo)注以及多位病理專家評測結(jié)果構(gòu)建定量評估PD-L1腫瘤細(xì)胞表達(dá)評分的模型，對270例晚期非小細(xì)胞肺癌針吸活檢標(biāo)本進(jìn)行PD-L1表達(dá)的自動化評分，結(jié)果顯示該模型與人工評分具有良好的一致性。Taylor等[25]使用帶反饋回路的監(jiān)督學(xué)習(xí)在230例非小細(xì)胞肺癌中構(gòu)建了腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞評分的模型，該模型在腫瘤細(xì)胞/免疫細(xì)胞評分與病理專家的評測結(jié)果方面一致性良好。腫瘤細(xì)胞評分：Lin's相關(guān)系數(shù)0.68～0.81；免疫細(xì)胞評分：Lin's相關(guān)系數(shù)0.53～0.88。Wu等[26]通過基于U-ResNet結(jié)構(gòu)的全卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行腫瘤細(xì)胞分割，建立良好的腫瘤細(xì)胞自動識別模型并進(jìn)行膜陽性評估和計算，從而輸出具體腫瘤細(xì)胞陽性比例評分（TPS）數(shù)值。該結(jié)果在PD-L1抗體22c3和SP263測試集中，AI系統(tǒng)的TPS評分結(jié)果與受培訓(xùn)病理醫(yī)生之間具有良好一致性（22c3：r=0.942 9～0.945 8；SP263：r=0.978 7）。同時，AI輔助診斷測試顯示，在AI系統(tǒng)的輔助下未培訓(xùn)普通病理醫(yī)生的組內(nèi)一致性和診斷效率顯著提高。

表1 PD-L1評分AI判讀模型的相關(guān)研究

上述研究表明，DP分析及利用ML方法可以精準(zhǔn)地獲取PD-L1的染色評分，同時在可重復(fù)性和診斷效率方面顯示出了優(yōu)勢，這或許是克服免疫治療時代免疫病理指標(biāo)判讀困難的有力工具[27]。

3 AI在腫瘤組織標(biāo)志物診斷中的優(yōu)勢及挑戰(zhàn)

隨著腫瘤組織染色技術(shù)和DP的快速發(fā)展，AI在處理高通量、多維度圖像信息方面的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，為腫瘤診治帶來新的機(jī)遇[28-29]。腫瘤伴隨診斷標(biāo)志物與治療決策緊密相關(guān)，臨床實踐對這些標(biāo)志物的判讀標(biāo)準(zhǔn)通常較為嚴(yán)格，判讀醫(yī)生通常需要多次培訓(xùn)。盡管人為制定了一系列人工判讀的閾值標(biāo)準(zhǔn)，然而傳統(tǒng)診斷模式仍依賴于診斷醫(yī)師的經(jīng)驗，不可避免具有一定的主觀性。同時，組織標(biāo)志物的判讀通常比較耗時費力，極大地增加了腫瘤診斷負(fù)荷，也對診斷醫(yī)師提出了較高的挑戰(zhàn)。AI輔助的腫瘤病理診斷具有自動化、效率高和可重復(fù)性高等特點，尤其對組織病理標(biāo)志物能夠?qū)崿F(xiàn)定量化判讀，進(jìn)而提升腫瘤伴隨診斷的客觀性及精確性[30]。同時，AI圖像分析結(jié)果在不同醫(yī)院和檢測中心更容易共享和重復(fù)，進(jìn)而協(xié)助診斷醫(yī)師在病理指標(biāo)檢測和判讀方面進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的制定，并減輕日常診斷負(fù)荷。因臨床精準(zhǔn)治療的迫切需求，對組織標(biāo)志物的AI輔助定量分析可能是臨床執(zhí)行應(yīng)用的一個重要方面，很可能在不久的將來成為臨床診斷輔助工具中的一部分。

AI在組織病理標(biāo)記物定量分析領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)臨床應(yīng)用，仍然需要解決許多問題，如模型構(gòu)建過程中標(biāo)注的數(shù)據(jù)量、腫瘤染色和掃描圖像數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制、細(xì)胞精確分割等。DL有多種學(xué)習(xí)模式，通常包括監(jiān)督學(xué)習(xí)、無監(jiān)督學(xué)習(xí)和半監(jiān)督學(xué)習(xí)等。目前，通過病理醫(yī)生的人工標(biāo)注進(jìn)行有監(jiān)督的ML是比較常用的方法，但這種方法需要大量高質(zhì)量的專業(yè)注釋圖像，研究實踐中有一定的困難。一些ML模式如主動學(xué)習(xí)和弱監(jiān)督學(xué)習(xí)算法在減少病理圖像數(shù)據(jù)對人工標(biāo)注的需求方面同樣取得了較大的進(jìn)展[31-32]。

由于DL算法模型具有“黑盒子”性質(zhì)及臨床疾病的復(fù)雜性，計算機(jī)模型系統(tǒng)目前仍不能完全代替實際臨床實踐[33]。大部分現(xiàn)有AI模型僅限于小樣本集的訓(xùn)練和測試。盡管這些模型在有限的數(shù)據(jù)集顯示出與專家評估良好的一致性，但臨床實踐中，這些AI算法和診斷系統(tǒng)是否可行，仍有待真實世界的臨床觀察。針對臨床應(yīng)用級圖像開發(fā)的計算機(jī)模型需要確切的臨床流程進(jìn)行驗證[34]。

4 結(jié)語與展望

腫瘤病理標(biāo)志物評估的準(zhǔn)確性及客觀性對于腫瘤診斷及臨床治療決策至關(guān)重要。目前基于DL的AI技術(shù)與數(shù)字病理相結(jié)合，可使診療相關(guān)的腫瘤組織生物標(biāo)記物的評估更具重復(fù)性和可靠性。將組織標(biāo)記物染色切片掃描構(gòu)成與精準(zhǔn)治療緊密相關(guān)的DP圖像集合，并構(gòu)建相應(yīng)的AI判讀系統(tǒng)，將是構(gòu)建腫瘤智能精準(zhǔn)診療體系的重要方向。計算機(jī)專家、腫瘤醫(yī)生和病理醫(yī)生需要緊密協(xié)作，根據(jù)臨床診療的具體需求開發(fā)更有針對性的腫瘤分子病理標(biāo)志物的模型算法，運用大樣本病例數(shù)據(jù)驗證并制定相應(yīng)的臨床質(zhì)控流程，從而實現(xiàn)腫瘤組織標(biāo)記物的智能伴隨診斷模式。