雞肉中三種喹諾酮藥物殘留檢測的 不確定度評定

◎ 張丹鶴，周瑩瑩，劉定舟，朱欣欣，崔倩倩，賈松濤，趙林萍

（1.河南中標(biāo)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001；2.鄭州中道生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001）

喹諾酮類，又稱吡酮酸類，是一類合成抗菌藥。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、組織穿透力強(qiáng)、價(jià)格低廉以及與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽多種疾病的預(yù)防和治療[1]。恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星是家禽養(yǎng)殖中的常用藥，使用率較高[2]。但是，如果在畜禽養(yǎng)殖過程中不合理用藥，或者未嚴(yán)格按照休藥期用藥，易導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品的藥物殘留超標(biāo)，對人類健康帶來安全隱患。在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管中，不確定度顯得極為重要，尤其是當(dāng)檢測結(jié)果處于限量附近時(shí)，通過方法的不確定度的評估，可以對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評價(jià)，以驗(yàn)證樣品是否合格[3]。本研究對實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.17—2021）測定雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星含量進(jìn)行了不確定度分析，找出影響結(jié)果的主要分量，在實(shí)際操作中對這些分量進(jìn)行重點(diǎn)控制，有利于在獸藥殘留檢測工作中對檢測結(jié)果作出更準(zhǔn)確的判定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Thermo Fisher TSQ Quantis/Vanquish超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；20～200 μL移液槍，100～1 000 μL移液槍（Dragon）；0.000 01 g感量分析天平（美國奧豪斯Ohaus）；0.01 g感量分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；50 mL容量瓶。

1.2 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星，均由Dr. Ehrenstorfer GmbH生產(chǎn)；甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，由Thermo Fisher公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為一級水。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：用十萬分之一天平稱量5 mg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用0.03 mol·L-1氫氧化鈉溶液溶解并定容至50 mL，配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：分別用移液器取0.1 mL濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

0.1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用移液器取1 mL濃度為1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.3 樣品處理

提取凈化：稱取試樣1 g（準(zhǔn)確至±0.01 g），按照GB 31658.17—2021的測定步驟進(jìn)行處理，收集洗脫液，45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?。加入?fù)溶液1.0 mL，渦旋1 min溶解殘余物，14 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定[4]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液適量，分別加入7份經(jīng)提取和凈化的空白試樣殘?jiān)校?5 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，加入?fù)溶液1.0 mL渦旋溶解殘余物，配制成濃度為 2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、 50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22 μm濾膜過濾。

1.5 樣品測定

將配制的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品溶液，用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)，用外標(biāo)法計(jì)算試樣中藥物的殘留量。計(jì)算公式如下：

式中：C為測定樣液中被測組分的濃度，ng·mL-1；V為定容體積，mL；m為樣品重量，g；X為樣品中待測組分的含量，μg·kg-1；f為稀釋倍數(shù)。

1.6 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)上述結(jié)果計(jì)算公式，在實(shí)驗(yàn)過程中f為1，是一個(gè)常數(shù)，因此不確定度評定中此參數(shù)可忽略不計(jì)。由于實(shí)驗(yàn)過程步驟多，包括提取和凈化等多個(gè)步驟，很難對各環(huán)節(jié)進(jìn)行評定，具有不可控性，可通過加標(biāo)回收率等對處理樣品過程中的不確定度進(jìn)行評定。綜合得到雞肉中3種喹諾酮類藥物（恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算的不確定度評定數(shù)學(xué)模型如下：

式中：X為試樣中藥物殘留量的數(shù)值，μg·kg-1；C為樣品溶液中被測組分的濃度，μg·mL-1；m為樣品重量，g；V為試樣中最終定容體積的數(shù)值，mL；Rrec為回收率校正因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量的主要來源分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程及數(shù)學(xué)模型分析，3種喹諾酮類藥物（恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星）殘留測定的不確定度主要來源于樣品稱量、樣品溶液中被測組分的濃度、最終定容體積和樣品前處理過程（通過加標(biāo)回收率來反映）等。被測組分的濃度受標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、標(biāo)準(zhǔn)曲線配制、校準(zhǔn)曲線擬合等的影響較大。下面以恩諾沙星為例計(jì)算測量不確定度，然后以同樣方法計(jì)算環(huán)丙沙星、沙拉沙星的測量不確定度。

2.2 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

本實(shí)驗(yàn)中稱量樣品1.00 g，所用天平精密度為0.01 g。校準(zhǔn)證書給出的擴(kuò)展不確定度U1=0.01 g，k=2。標(biāo)準(zhǔn)不確定度=0.01/2=0.005 g，相對不確定度urel(m)=0.005/1=0.005。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b)

主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容過程引入。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(p)

3種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、不確定度和包含因子見表1。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出的是擴(kuò)展不確定度，屬于正態(tài)分布，置信概率P=95%，包含因子k=2，是B類評定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

根據(jù)上述計(jì)算公式，求得環(huán)丙沙星的相對不確定度為0.007 10，沙拉沙星的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.010 30。

表1 3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的來源、純度及擴(kuò)展不確定度表

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制時(shí)，恩諾沙星稱取5.01 mg，環(huán)丙沙星稱取5.42 mg，沙拉沙星稱取5.15 mg。十萬分之一天平校準(zhǔn)證書給出的擴(kuò)展不確定度U2=0.05 mg，k=2，是B類評定。以恩諾沙星為例，標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

根據(jù)上述計(jì)算公式可得，環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.004 61，沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.004 85。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 20—2001）[5]， 50 mL A級容量瓶的允許誤差為±0.016 mL， 容量瓶引入的不確定度為B類不確定度，符合矩形分布，包含因子，標(biāo)準(zhǔn)不確定度，容量瓶體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

儲(chǔ)備液配制過程中所用的溶劑為0.03 mol·L-1氫氧化鈉水溶液，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1[6]。 容量瓶在20 ℃校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室溫度范圍為（20±3）℃，水的溫差效應(yīng)引起的體積變化為50 mL×3 ℃×2.1× 10-4℃-1=0.031 5 mL，溫度導(dǎo)致體積變化符合矩形分布，溫度對體積影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.018 2，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度=0.000 364。

2.3.4 計(jì)算合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以恩諾沙星為例，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

經(jīng)計(jì)算，環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度為0.008 48，沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度為0.011 40。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

2.4.1 移液器使用引入的不確定度

根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[7]，用200 μL移液器移取200 μL的允許誤差是±3.0 μL，移取100 μL的允許誤差是±2.0 μL，移取20 μL的允許誤差是±0.8 μL。因標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定50 μL的允許誤差，移取50 μL的允許誤差取最大容量允許誤差±4%計(jì)算，為±2.0 μL。

以200 μL移液器吸取100 μL溶液為例計(jì)算移液器引入的不確定度，允許誤差是±2.0 μL，取均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度，引入的相對不確定度urel(vy1)=1.15/100=0.011 5，由此計(jì)算方法得到200 μL移液器移取其他體積的不確定度urel(vx)，見表2。

表2 200 μL移液器引入不確定度表

2.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的不確定度

（1）1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中引入的不確定度。10 mL A級容量瓶的允許誤差為±0.006 mL，容量瓶引入的不確定度為B類不確定度，符合矩形分布，包含因子，標(biāo)準(zhǔn)不確定度，容量瓶體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中所用的溶劑為甲醇，甲醇的膨脹系數(shù)為1.1×10-3℃-1。容量瓶在20 ℃校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室溫度范圍為（20±3）℃，甲醇的溫差效應(yīng)引起的體積變化為10 mL×3 ℃×1.1×10-3℃-1=0.033 mL，溫度導(dǎo)致體積變化符合矩形分布，溫度對體積影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。根據(jù)表2，200 μL移液器吸取100 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的不確定度為0.011 5， 則1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中引入的不確定度為：

（2）0.1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中引入的不確定度。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[7]，用1 000 μL移液器移取1 000 μL的允許誤差是±10 μL，相對不確定度=0.005 77。參照1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液不確定度評定分析過程，經(jīng)計(jì)算得到0.1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(b2)=0.006 09。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制的不確定度urel(L)

標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)配制的不確定度由所用混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、移液器吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)工作液以及用移液器吸取1 mL定容引入。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)移液槍的使用過程見表3。以100 ng·mL-1濃度點(diǎn)的配制過程為例，相對不確定度：

按照此分析方法，經(jīng)計(jì)算得200 ng·mL-1、50 ng·mL-1、20 ng·mL-1、10 ng·mL-1、5 ng·mL-1和2 ng·mL-1的不確定度分別為0.015 7、0.026 5、0.012 1、0.014 2、0.024 6 和0.024 6，計(jì)算時(shí)取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的最大不確定度 值0.026 5。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程表

2.4.4 線性擬合引入的不確定度

將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，進(jìn)樣量為5 μL，得到恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999 6、0.999 3、0.999 9，因此線性擬合引起的不確定度可以不做考慮。

2.5 樣品復(fù)溶定容引起的不確定度

提取過程中，氮?dú)獯蹈珊?，最后? mL移液槍吸取1 mL復(fù)溶液復(fù)溶。用1 000 μL移液器移取1 000 μL 的允許誤差是±10 μL，按矩形分布計(jì)算，量取1 mL復(fù)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6 處理樣品過程中的不確定度

樣品前處理過程的不確定度通過添加樣的回收率和精密度進(jìn)行評定，屬于A類評定[8]。取雞肉空白基質(zhì)，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到含量為20 μg·kg-1（與測試樣品濃度相當(dāng)）的空白加標(biāo)雞肉樣品，每個(gè)濃度6個(gè)平行，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理。6次測定的回收率、回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。恩諾沙星的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。經(jīng)計(jì)算可得環(huán)丙沙星和沙拉沙星的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.020 7、0.029 1。

表4 添加樣回收率及其標(biāo)準(zhǔn)偏差表

2.7 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

各檢測項(xiàng)目的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表5。

表5 各檢測項(xiàng)目合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度表

2.8 報(bào)告結(jié)果與表示

報(bào)告中雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星測定結(jié)果X測分別為20.40 μg·kg-1、17.80 μg·kg-1、18.90 μg·kg-1。

u(X)=urel(X)×X，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=k×u(X)，k=2，測定結(jié)果為X=X±U，k=2，具體結(jié)果見表6。

表6 各項(xiàng)目最終結(jié)果表

3 結(jié)論

分析各不確定度分量的評定數(shù)據(jù)可以得出，在實(shí)驗(yàn)室按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.17—2021）測定雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星含量時(shí)，影響不確定度的主要環(huán)節(jié)是標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收率。在日常檢測工作中，需要重視這些環(huán)節(jié)，使用高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，保證標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確度，盡量將回收率控制在較高水平。在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中，相較容量瓶，使用移液器引入的不確定度較大。因此，實(shí)驗(yàn)室要定期對移液器進(jìn)行校準(zhǔn)，必須要正確操作、定期維護(hù)，保證移液器的準(zhǔn)確。