液相色譜法測(cè)定食品中納他霉素的方法驗(yàn)證

◎ 陳秀英

（廣州市增城質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 廣州 511300）

納他霉素是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類的真菌抑菌劑，具有很強(qiáng)的抗真菌能力，特別能有效地抑制霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)，在某些產(chǎn)品中甚至比常用的脫氫乙酸更能有效地抑制真菌[1-4]。其不僅抑制效果好，且在哺乳動(dòng)物中的毒性不強(qiáng)，因此被廣泛用于食品中。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定相關(guān)要求，在方法使用前需進(jìn)行驗(yàn)證，以確保本實(shí)驗(yàn)室的人員、設(shè)備、環(huán)境和耗材能滿足開展《食品中納他霉素的測(cè)定 液相色譜法》（GB/T 21915—2008）的需求，故本文對(duì)食品中納他霉素的檢測(cè)展開了方法驗(yàn)證[5-6]。驗(yàn)證內(nèi)容包括儀器設(shè)備是否合適、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與耗材是否滿足檢驗(yàn)需求、方法性能指標(biāo)——檢出限、線性范圍、基質(zhì)效應(yīng)、精密度和正確度能否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（CH3OH，色譜純），CNW Technologies；冰乙酸（CH3COOH，分析純），廣州化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；納他霉素有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAS：7681-93-8），中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 儀器和設(shè)備

LC-2010AHT高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；AR224CN型天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]，感量為0.000 1 g；恒溫水浴鍋； KQ-500E型超聲清洗器（昆山超聲）；BCD-216SDN冰箱（Haier）；TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 儀器參數(shù)

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm（島津Ankylo C18）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：305 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：甲醇+水+乙酸=60+40+5。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備

（1）乳酪、火腿、酸奶等基質(zhì)。準(zhǔn)確稱取10.00 g 樣品到50 mL比色管中，加入30 mL甲醇，超聲提取30 min，加水約10 mL，定容到50 mL刻度線，搖勻放入冰箱中冷凍1 h，取出冷凍后的樣品立即用有機(jī)相進(jìn)行過(guò)濾。濾液放置室溫后，依次過(guò)0.45 μm和0.22 μm針頭式過(guò)濾器，收集濾液約2 mL并上機(jī)測(cè)定。

（2）月餅、糕點(diǎn)基質(zhì)。準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品到50 mL比色管中，置于離心管中，加入30 mL甲醇，超聲提取30 min，加水定容到50 mL刻度線，搖勻后置于離心機(jī)中，以3 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min。上清液依次過(guò)0.45 μm和0.22 μm針式過(guò)濾器，收集濾液約2 mL，上機(jī)測(cè)定。

（3）果汁飲料等基質(zhì)。準(zhǔn)確量取果汁飲料樣品 10 mL到50 mL比色管中，加入30 mL甲醇，超聲提取30 min，加水定容到50 mL刻度線。提取液依次過(guò) 0.45 μm和0.22 μm針頭式過(guò)濾器，收集濾液約2 mL上機(jī)測(cè)定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取適量的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配成濃度為479.2 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。然后量取1.0 mL儲(chǔ)備液到10 mL的容量瓶中，用甲醇定容到10 mL刻度線,搖勻配成47.92 μg·mL-1的中間液。再分別量取適量的中間液，用甲醇稀釋到10 mL，配成0.479 2 μg·mL-1、 1.916 8 μg·mL-1、4.792 0 μg·mL-1、9.584 0 μg·mL-1、19.170 0 μg·mL-1和47.920 0 μg·mL-1等不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列。以納他霉素的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

按照1.3的實(shí)驗(yàn)儀器參數(shù)上機(jī)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是Y=51 993x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，符合《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)及驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）[7]中R2大于0.99的要求。在0.479 2～47.920 0 μg·mL-1的濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 方法檢出限

根據(jù)GB/T 27417—2017中“空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法”進(jìn)行檢出限的測(cè)定。樣品空白連續(xù)測(cè)定10次，計(jì)算出樣品空白平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)偏差S。

2.2.1 乳酪、火腿、酸奶等基質(zhì)的檢出限測(cè)定

由表1可知，樣品最低檢出濃度C=c-+3S=0.08 μg·mL-1， 樣品空白平均值為0.075 3 μg·mL-1，按照試液定容體積V=50 mL，稱樣量m=10.0 g計(jì)，可算出檢出限CLOD=C×V/m=0.438 mg·kg-1。

表1 樣品空白平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果表

2.2.2 月餅、糕點(diǎn)基質(zhì)的檢出限測(cè)定

樣品空白連續(xù)測(cè)定10次，得到的樣品空白平均值=0.042 9 μg·mL-1，S=0.003 7 μg·mL-1，最 低 檢 出濃度C=c-+3S=0.046 6 μg·mL-1，同理可計(jì)算出檢出限CLOD=C×V/m=0.466 mg·kg-1。

2.2.3 果汁飲料基質(zhì)的檢出限測(cè)定

樣品空白連續(xù)測(cè)定10次，得到的樣品空白平均值=0.068 9 μg·mL-1，S=0.001 5 μg·mL-1，最 低 檢 出濃度C=c-+3S=0.046 6 μg·mL-1，同理可計(jì)算出檢出限CLOD=C×V/V2=0.367 mg·L-1。

2.3 精密度

精密度的測(cè)定通常需要自由度至少為6，故實(shí)驗(yàn)選取一個(gè)陽(yáng)性樣品，重復(fù)測(cè)定7次，結(jié)果如下。

2.3.1 乳酪、火腿、酸奶等基質(zhì)的精密度

陽(yáng)性樣品的結(jié)果見表2。

2.3.2 月餅、糕點(diǎn)基質(zhì)的精密度

陽(yáng)性樣品重復(fù)測(cè)定7次的平均值為18.217 mg·kg-1，變異系數(shù)（CV值）為1.59%。

2.3.3 果汁飲料基質(zhì)的精密度

陽(yáng)性樣品重復(fù)測(cè)定7次的平均值為9.535 mg·L-1，變異系數(shù)（CV值）為1.71%。

2.4 回收率

稱取6份已確認(rèn)的空白樣品，各加入一定量的標(biāo)物，然后按1.4.1中的步驟進(jìn)行處理。

2.4.1 乳酪、火腿、酸奶等基質(zhì)的回收率

火腿的加標(biāo)回收結(jié)果見表3。

表2 陽(yáng)性樣品7次檢測(cè)結(jié)果表

表3 加標(biāo)回收結(jié)果表

2.4.2 月餅、糕點(diǎn)基質(zhì)的回收率

6份加標(biāo)樣品的回收率依次為101.10%、98.75%、95.32%、94.85%、99.15%和99.02%。

2.4.3 果汁飲料基質(zhì)的回收率

6份加標(biāo)樣品的回收率依次為96.38%、96.24%、101.20%、101.80%、98.96%和99.15%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室在現(xiàn)在設(shè)備及設(shè)施條件下，通過(guò)線性范圍、檢出限、精密度和正確度對(duì)不同類型代表的基質(zhì)（乳酪、火腿、酸奶等基質(zhì)、月餅、糕點(diǎn)等基質(zhì)以及果汁飲料基質(zhì)）進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1，大于0.99；3種基質(zhì)的檢出限依 次 為0.438 mg·kg-1、0.466 mg·kg-1、0.367 mg·L-1， 均低于GB/T 21915—2008要求的“固體和半固體 0.5 mg·kg-1，液體樣品0.5 mg·L-1”；3種基質(zhì)的變異系數(shù)（CV值）依次為1.85%、1.59%、1.71%，依次低于GB/T 27417—2017要求的CV值（5.3%、5.3%、7.5%）（參考GB/T 27417—2017要求，當(dāng)被測(cè)組分含量＜ 1 mg·kg-1時(shí)，變異系數(shù)要求＜7.5%；當(dāng)被測(cè)組分含量＜100 mg·kg-1時(shí)，變異系數(shù)要求＜5.3%）； 3種基質(zhì)的回收率依次為91.72%～96.30%、94.85%～ 101.10%、96.24%～101.80%，均符合GB/T 27417—2017 要求的當(dāng)添加量在0.1～1.0 mg·kg-1時(shí)，回收率要求滿足80%～110%的水平。從以上數(shù)據(jù)可知，本實(shí)驗(yàn)室能力滿足GB/T 21915—2008標(biāo)準(zhǔn)要求。