食品中紐甜含量的不確定度評(píng)定

◎ 聶阿真，南利華，趙雪峰，李 帥，馬金華，劉定舟，賈松濤，趙林萍

（1.河南中標(biāo)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001；2.鄭州中道生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001）

紐甜是一種甜味劑，但人工合成紐甜的安全性受到質(zhì)疑，多數(shù)食品中紐甜的使用量都有最大限量值，如加工堅(jiān)果和籽類的最大使用量為0.032 g·kg-1[1]。不同的儀器、人員、檢測環(huán)境都會(huì)對(duì)檢測結(jié)果造成一定的偏差，為了避免用“誤差”的概念表示測量結(jié)果，相關(guān)部門提出使用測量不確定度對(duì)測量結(jié)果進(jìn)行評(píng)定[2]。根據(jù)《檢驗(yàn)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（CNAS-CL01：2018）[3]、《測量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006：2018）[5]和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中紐甜的測定》（GB 5009.247—2016）[6]，樣品經(jīng)甲酸-三乙胺-水提取液提取，C18固相萃取小柱凈化后，經(jīng)C18色譜柱進(jìn)行分離，采用液相色譜儀（二極管陣列檢測器）進(jìn)行分析，通過保留時(shí)間進(jìn)行定性，采取峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量。在實(shí)驗(yàn)過程中充分考慮樣品稱量、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制、定容體積、樣品回收率、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和測量重復(fù)性等因素，把這些因素引起的不確定度分量合成食品中紐甜含量的不確定度計(jì)算中。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

華譜S6000高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）；OHAUS DV215CD電子天平（美國奧豪斯，感量0.01 mg）；JJ300A電子天平（感量0.01g）；SYU-10-200DTD超聲波清洗儀；TARGIN TECH VXIII多管渦旋振蕩器；SPE-24 Mediwax-24固相萃取裝置；BT-III水浴式氮吹儀；Perfect-20VF超純水機(jī)。

磷酸；三乙胺；乙腈（Thermo）；庚烷磺酸鈉（色譜純）；甲酸（色譜純）；甲醇（Thermo，色譜純）；紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2 色譜條件

色譜柱：Acclaim TM 120 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）（序列號(hào)：005751)；流動(dòng)相：0.02%庚烷磺酸鈉溶液-乙腈；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：218 nm。

1.3 樣品的處理和測定

稱10 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加30 mL三乙胺-甲酸-水提取液提取，振蕩器上振蕩15 min，超聲波超聲20 min后，用三乙胺-甲酸-水溶液定容至50 mL，混勻，離心5 min（8 000 r·min-1），過濾，吸取10 mL的過濾液，濾液用C18小柱（3 mL，250 mg）凈化，用5 mL的甲酸-三乙胺-水溶液淋洗，舍棄所有的淋洗液，5 mL甲醇洗脫目標(biāo)物，氮吹濃縮洗脫液，用甲酸-三乙胺-水提取液定容至2 mL，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后，上機(jī)檢測。

1.4 工作曲線繪制

準(zhǔn)確移取紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500 μg·mL-1）10 μL、20 μL、40 μL、100 μL、200 μL和400 μL于10 mL容量瓶中，用35%乙腈水稀釋并定容至刻度即得標(biāo)準(zhǔn)系列為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1，以樣品濃度作為曲線的橫坐標(biāo)，以樣品峰面積作為曲線的縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型

根據(jù)一些影響紐甜不確定度的主要因素和紐甜的計(jì)算公式，建立食品中紐甜測定的不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型如下：

式中：X代表待測樣中紐甜的含量，mg·kg-1；C代表上機(jī)濃度，μg·mL-1；V代表定容體積，mL；m代表樣品質(zhì)量，g；R代表回收率，%；frep代表重復(fù)性系數(shù)。

2 不確定度來源分析

從樣品的數(shù)學(xué)模型、測量過程、前處理方法分析，測定食品中紐甜不確定度來源主要有稱樣引入的不確定度、定容過程中引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度、回收率引入的不確定度以及反復(fù)測量引入的不確定度。

3 不確定度分量的評(píng)定

3.1 稱樣引入的不確定度u(m)

本實(shí)驗(yàn)稱樣量為10 g（精確至0.01 g），使用YP5002電子天平（儀器編號(hào)：ZBJC201700070），根據(jù)電子天平的校準(zhǔn)證書，擴(kuò)展不確定度為U=0.5 mg，k=2；由此得出稱樣量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為；引入稱樣量的相對(duì)不確定度為。

3.2 定容過程中引起的不確定度u(v)

3.2.1 容量瓶引起的不確定度

根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006），在溫度為（25±1）℃的情況下，50 mL容量瓶（A級(jí)，單標(biāo)線）的允許誤差為±0.05 mL，假設(shè)其為矩形分布，則50 mL容量瓶的不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.2 溫度對(duì)定容體積的影響引入的不確定度

容量瓶的校準(zhǔn)溫度為21.6 ℃，環(huán)境溫度在（20±5）℃時(shí)，50 mL容量瓶溶液所引起的體積變化為50 mL×3.4 ℃×2.1×10-4℃-1=3.57×10-2mL（水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1），假設(shè)其為矩形分布，則其引入的不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過程引入的不確定度u(c)

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（紐甜）純度引入的不確定度u(p)

證書上顯示純度為95.1%，其擴(kuò)展不確定度為1.0%，取k=2，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度u(z)

稱量紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用DV215CD電子天平（儀器編號(hào)：ZBJC201500013），根據(jù)電子天平的校準(zhǔn)證書，擴(kuò)展不確定度為U=0.12 mg，k=2；由此得出稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)不確定度為。

3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容引入的不確定度u(v)

（1）容量瓶引入的不確定度。稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容至50 mL容量瓶中，根據(jù)《常用玻璃量器》 （JJG 196—2006），在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為（25±1）℃的情況下，50 mL容量瓶（單標(biāo)線，A級(jí)）的允許誤差為±0.05 mL，假設(shè)其為矩形分布，50 mL容量瓶的不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）溫度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容體積的影響引入的不確定度。容量瓶的校準(zhǔn)溫度為21.6 ℃，環(huán)境溫度在（20±5）℃時(shí)。此時(shí)容量瓶中液體的溫度與校準(zhǔn)時(shí)溶液的溫度不同所引起的體積變化為50 mL×3.4 ℃ ×1.0×10-3℃-1=1.7×10-2mL（有機(jī)溶劑膨脹系數(shù)為1.0×10-3℃-1），則環(huán)境溫度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容體積影響（假定為矩形分布）所引入的不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由此得出標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度u(q)

實(shí)驗(yàn)人員對(duì)6個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度點(diǎn)進(jìn)行測定，其對(duì)應(yīng)濃度與峰面積見表1。

表1 不同濃度紐甜的標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積表

采用最小二乘法對(duì)紐甜的濃度X與其對(duì)應(yīng)的峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得到紐甜標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=aX+b= 15 534.67X-17.776 7，相關(guān)系數(shù)為R2=1.000 0。

則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差S(A)為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液含量殘差的平方和Sxx為：

式中：a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；c0為測得樣品中紐甜的濃度mg·kg-1；p為c0測量次數(shù)；n為標(biāo)準(zhǔn)工作液的測量次數(shù)；A為標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。

由擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)不確定度urel(q)為：

3.5 回收率引入的不確定度urel(R)

樣品前處理過程產(chǎn)生的不確定度，通過計(jì)算回收率的方式來評(píng)定，并且在平均回收率與100%存在顯著性差異時(shí)，才將平均回收率作為不確定度的來源進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回收率校正，否則忽略。實(shí)驗(yàn)以糕點(diǎn)為空白樣品添加紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，做6個(gè)樣品來測定紐甜的回收率，結(jié)果見表2。

表2 樣品不同添加濃度所對(duì)應(yīng)的回收率表

為評(píng)估對(duì)u(R)的貢獻(xiàn)，必須先計(jì)算顯著因子為：

而置信概率95%下自由度15時(shí)，查得ta.f為2.13，可見t＞ta.f，說明樣品平均回收率與100%存在顯著性差異，因此回收率引入的不確定度不可以忽略。

3.6 測量重復(fù)性引入的不確定度u(frep)

在重復(fù)性條件下，對(duì)同一樣本重復(fù)測量6次，測得樣品中紐甜的含量為1.798 mg·kg-1、1.822 mg·kg-1、 1.805 mg·kg-1、1.801 mg·kg-1、1.824 mg·kg-1和 1.799 mg·kg-1。

測量的重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，6次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差按貝塞爾公式計(jì)算：

本次共測量了2個(gè)樣品，其中X1=0.852，X2=0.858， 以兩次測量的平均值作為檢測結(jié)果，則本次測量平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

兩次測量的紐甜的平均含量為0.855 mg·kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差即為測量的重復(fù)性系數(shù)frep的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4 合成不確定度分析計(jì)算

食品中紐甜相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總?cè)绫?所示。

表3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表

合成不確定度為：

由紐甜測定的平均值X=0.855 mg·kg-1和公式uc(y)=u(X)/X得：

取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U為：

因此，食品中紐甜不確定度的測量結(jié)果可最終表示為X=(0.855±0.108) mg·kg-1（k=2）。