織錦巴非蛤幼蟲對不同種類單胞藻的攝食和消化效果

鄧正華，翟子欽，魏海軍，趙 旺，陳明強(qiáng)，李有寧，黃星美，張鈺偉，5，王 雨*

（1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510300；2三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南三亞 572018；3中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南三亞 572018；4北海金不換水產(chǎn)有限公司，廣西北海 536007；5天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

0 引言

【研究意義】織錦巴非蛤（Paphia textzle）俗稱花甲王，是自然分布于我國南海潮下帶泥沙質(zhì)海底的一種埋棲型雙殼經(jīng)濟(jì)貝類，其在北部灣自然海域也有一定的分布（楊文等，2013；陳瑞芳等，2020）。織錦巴非蛤殼表面呈黃棕色，布滿淺褐色波紋，與波紋巴非蛤（P.undulata）在外形上極為相似。但織錦巴非蛤成貝殼長達(dá)7 cm，濕重在30 g以上，其味道鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，市場價(jià)格常年維持在80~100元/kg。近年來，隨著海洋捕撈技術(shù)與裝備的不斷進(jìn)步、漁船馬力的快速增加、捕撈隊(duì)伍的迅速擴(kuò)大及捕撈作業(yè)監(jiān)控不力，海洋生物繁殖棲息地受破壞程度越來越嚴(yán)重（Deng et al.，2021a，2021b），致使織錦巴非蛤的自然資源量逐年銳減。因此，開展織錦巴非蛤苗種人工規(guī)?；庇驮鲳B(yǎng)殖，對補(bǔ)充其自然種群資源及豐富人民日益增長的海產(chǎn)品需求具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】織錦巴非蛤作為我國南海海水養(yǎng)殖新型品種，苗種規(guī)?；斯し庇菦Q定其能否實(shí)現(xiàn)大規(guī)模人工養(yǎng)殖的關(guān)鍵（鄧正華等，2016）。其中，單胞藻作為雙殼貝類幼蟲培育的重要餌料，是影響其生長速率和存活率的主要因素之一（Mar‐shall et al.，2010；Cheng et al.，2020）。已有大量研究證實(shí)，優(yōu)化單胞藻投喂種類和濃度（Pettersen et al.，2010；Yang et al.，2021），分析單胞藻營養(yǎng)價(jià)值（Martínez-Fernández，2006；Chen et al.，2015；Liu et al.，2016），調(diào)節(jié)幼蟲培育密度（Doroudi and South‐gate，2000；Mazón-Suástegui et al.，2008；Ramos et al.，2021），滿足幼蟲營養(yǎng)需求（Martínez-Fernández and Southgate，2007；Aranda-Burgos et al.，2014）等方式均有利于提高幼蟲培育生長速率及其存活率。單胞藻被作為濾食性雙殼貝類的主要餌料，也是無脊椎動(dòng)物苗種培育的重要食物來源（Pettersen et al.，2010；Shi et al.，2013）。Duy等（2015）認(rèn)為影響雙殼貝類幼蟲生長和存活的因素不僅與投喂單胞藻餌料的營養(yǎng)價(jià)值有關(guān)，還與幼蟲對該餌料的消化效率和同化效率有關(guān)，究其原因可能是并非所有單胞藻種類都能被幼蟲攝食和消化（Quang et al.，2015）。Lo‐ra-Vilchis和Maeda-Martinez（1997）曾研究報(bào)道，扇貝（Argopecten ventricosus）幼蟲飼喂的10種單胞藻中僅有7種能被攝食，其中5種能被消化；而在燕鷗珍珠母貝（Pteria sterna）幼蟲飼喂的10種單胞藻中，僅有3種能被攝食，其中2種能被消化（Martínez-Fernández et al.，2004）。因此，在幼蟲培育過程中選擇單胞藻餌料時(shí)首先要明確投喂的單細(xì)胞種類是否能被幼蟲攝食和消化（Marshall et al.，2010）。【本研究切入點(diǎn)】單胞藻能否作為海水雙殼貝類幼蟲培育的餌料來源應(yīng)當(dāng)滿足以下條件：（1）合適的粒徑大小和形態(tài)以確保能被攝食；（2）易于消化；（3）滿足幼蟲生長發(fā)育的營養(yǎng)需求；（4）無毒；（5）適宜人工大規(guī)模培養(yǎng)（Fernández-Reiriz et al.，2015）。小球藻（Chlo‐rella vulgaris）、微綠球藻（Nannochloropsis oculata）、杜氏鹽藻（Dunaliella salina）、亞心形扁藻（Platymo‐nas subcordiformis）、綠色巴夫藻（Pavlova viridis）、湛江等鞭金藻（Dicrateria zhanjianggensis）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornu‐tum）是我國沿海濾食性貝類人工苗種繁育常用的單胞藻餌料，但目前有關(guān)織錦巴非蛤幼蟲在不同時(shí)期飼喂何種單胞藻餌料尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】在織錦巴非蛤幼蟲培育期分別飼喂不同種類的單胞藻，觀察幼蟲對單胞藻攝食情況和消化效果，以期為織錦巴非蛤的苗種規(guī)?；斯し庇峁D料投喂策略及參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2021年1月22日從廣西北海市鐵山港區(qū)自然海域捕撈的織錦巴非蛤2齡貝為親本（n=30），親貝殼長68.87±5.82 mm、殼高36.43±4.78 mm、殼寬21.45±3.88 mm、濕重30.33±4.28 g。供試的9種單胞藻（小球藻、微綠球藻、杜氏鹽藻、亞心形扁藻、綠色巴夫藻、湛江等鞭金藻、球等鞭金藻、牟氏角毛藻和三角褐指藻）由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供，其形態(tài)特征及粒徑大小描述見表1和圖1。

圖1 9種單胞藻的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of nine species of microalgae

表1 9種單胞藻的生物學(xué)特征Table 1 Biological characteristics of nine species of microalgae

1.2 單胞藻培養(yǎng)與幼蟲培育

9種單胞藻均采用5000 mL錐形瓶在室溫28 ℃和光照5000 lx（12 h黑暗：12 h光照）條件下進(jìn)行保種，藻種瓶每天搖晃2次，每7~10 d重新接種1次。在500 L圓形玻璃鋼纖維桶中添加F/2營養(yǎng)鹽，于自然光照條件下大規(guī)模培養(yǎng)單胞藻，確保單胞藻在使用時(shí)處于快速生長期且密度>106個(gè)/mL（亞心形扁藻>105個(gè)/mL）。

織錦巴非蛤親貝從海區(qū)運(yùn)回后，用塑料筐裝好懸掛于20 m3的水泥池中進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化，期間每天投喂亞心形扁藻和牟氏角毛藻混合藻，餌料投喂密度為1×104~2×104個(gè)/mL，親貝每天投喂2次，每天換水50%。經(jīng)過1周左右的室內(nèi)暫養(yǎng)，將親貝沖洗干凈，置于陰涼處陰干刺激3 h，然后置于塑料筐中懸掛在水泥池中進(jìn)行流水刺激，促使其排卵/排精。觀察水中卵細(xì)胞和精子數(shù)量，當(dāng)卵細(xì)胞數(shù)量達(dá)10個(gè)/mL時(shí)，及時(shí)將親貝移出并停氣30 min使卵細(xì)胞下沉，采用虹吸法吸取上層水排出多余精子，如此往復(fù)多次，洗去多余的精子。受精卵在水泥池孵化24 h，發(fā)育至D形幼蟲后停氣使其上浮，以虹吸法將上層幼蟲吸出，經(jīng)350目篩絹網(wǎng)收集，然后將幼蟲轉(zhuǎn)移至過濾的清海水池中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度5個(gè)/mL。幼蟲培育期間每天換水1次，換水量從前期30%增至60%，幼蟲每天投喂2次，在1~9 dph（孵化后天數(shù)，days post hatch）期間投喂湛江等鞭金藻，超過9 dph后投喂亞心形扁藻，餌料投喂量根據(jù)幼蟲攝食情況進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。幼蟲培育期間水溫（22.45±0.87）℃，鹽度30‰，pH 8.24。

1.3 幼蟲發(fā)育觀察

幼蟲培育期間，每天從培育池中取一部分幼蟲（n>30）在顯微鏡下觀察幼蟲的運(yùn)動(dòng)和攝食狀態(tài)，并在顯微鏡下連接Toup Cam XCAM1080PHD攝像頭進(jìn)行拍照，使用Toup View3.7測量幼蟲大小。

1.4 幼蟲對單胞藻的攝食與消化

幼蟲孵化后，每隔3 d從培育池中取一部分幼蟲置于過濾清海水中饑餓處理12 h，以確保幼蟲胃內(nèi)消化完全。然后將幼蟲按10個(gè)/mL的密度置于9個(gè)1000 mL燒杯中，每個(gè)燒杯分別加入9種單胞藻使藻類濃度達(dá)104個(gè)/mL。幼蟲在燒杯中攝食1 h后，從各燒杯中取一部分幼蟲置于0.1 mL浮游植物計(jì)數(shù)框（2 cm×2 cm×250 μm）中，蓋上蓋玻片，在Phenix BMC536-ICCF光學(xué)顯微鏡下觀察幼蟲對單胞藻攝食情況。將已攝食單胞藻的幼蟲用350目篩絹網(wǎng)過濾，經(jīng)過濾清海水清洗后按5個(gè)/mL的密度置于過濾清海水中，分別在2、4、6和8 h后采用光學(xué)顯微鏡觀察幼蟲（n>30）對單胞藻的消化情況，參照Deng等（2021a，2021b）的研究結(jié)果，詳細(xì)描述幼蟲在饑餓、攝食、消化和空胃下的狀態(tài)（表2）。

表2 幼蟲對單胞藻的攝食與消化狀態(tài)Table 2 Stages of larvae during ingesting and digesting microalgae

1.5 圖像處理

采用Adobe Photoshop CS5對圖像進(jìn)行處理，以Tracker跟蹤幼蟲運(yùn)動(dòng)并形成運(yùn)動(dòng)軌跡。

2 結(jié)果與分析

2.1 織錦巴非蛤幼蟲發(fā)育及其形態(tài)變化特征

織錦巴非蛤在水體整個(gè)發(fā)育過程中的幼蟲形態(tài)特征及大小變化如圖2所示。其中，初孵幼蟲（D形幼蟲）大?。らL×殼高）為（82.49±3.02）μm×（63.98±2.16）μm，于4 dph發(fā)育至殼頂前期（115.89±3.86）μm×（101.62±3.80）μm，13 dph 進(jìn)入變態(tài)期（205.61±15.84）μm×（182.61±13.53）μm，于15 dph變態(tài)至稚貝（225.63±8.99）μm×（198.65±8.25）μm。

圖2 織錦巴非蛤幼蟲發(fā)育及其形態(tài)特征Fig.2 Developmental and morphological characteristics of P.textzle larvae

2.2 織錦巴非蛤幼蟲運(yùn)動(dòng)與攝食觀察結(jié)果

織錦巴非蛤幼蟲在附著變態(tài)前于水中呈浮游狀態(tài)，幼蟲在水中正常運(yùn)動(dòng)時(shí)顯微鏡下的俯視觀察如圖3-A所示，幼蟲側(cè)面如圖3-B所示，幼蟲在水中的運(yùn)動(dòng)軌跡如圖3-C所示?？楀\巴非蛤幼蟲在水中正常運(yùn)動(dòng)時(shí)，雙殼張開，面盤伸出殼外靠近殼的后端且與水平軸呈一定角度?？楀\巴非蛤幼蟲通過面盤外周纖毛有規(guī)律地?cái)[動(dòng)，從而維持自身的運(yùn)動(dòng)和懸浮，大部分幼蟲在水平方向沿順時(shí)針方向運(yùn)動(dòng)。織錦巴非蛤幼蟲在運(yùn)動(dòng)過程中也伴隨著攝食，通過纖毛的擺動(dòng)形成水流，單胞藻則隨著水流方向進(jìn)入幼蟲口溝，在口溝纖毛擺動(dòng)下進(jìn)入胃內(nèi)，胃內(nèi)的單胞藻在微絨毛擺動(dòng)下快速旋轉(zhuǎn)并消化，消化的單胞藻則通過胃內(nèi)微絨毛運(yùn)動(dòng)和胃自身收縮下排入腸道，再從肛門排出體外，從而完成幼蟲對單胞藻的攝食、消化和排泄過程。

圖3 織錦巴非蛤幼蟲的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)及其運(yùn)動(dòng)軌跡Fig.3 Movement and movement trajectory of P.textzle larvae

2.3 織錦巴非蛤幼蟲對不同種類單胞藻的攝食與消化情況

織錦巴非蛤幼蟲饑餓、攝食、消化和空胃狀態(tài)如圖4所示。幼蟲在過濾清海水中饑餓處理12 h后，其胃內(nèi)處于空虛狀態(tài)，消化盲囊無顏色（圖4-A）；當(dāng)幼蟲在水中攝食1 h后，其胃內(nèi)可見形態(tài)完整的單胞藻（圖4-B）；而幼蟲在過濾清海水中停置一段時(shí)間后，單胞藻在幼蟲胃內(nèi)消化呈糜狀（圖4-C）；當(dāng)幼蟲對單胞藻完全消化后，幼蟲胃內(nèi)又處于空虛狀態(tài)，消化盲囊因吸收單胞藻營養(yǎng)其顏色與消化的單胞藻顏色相同（圖4-D）。

圖4 織錦巴非蛤幼蟲饑餓、攝食、消化和空胃狀態(tài)Fig.4 Starvation，ingestion，digestion and empty stomach of P.textzle larvae

通過考察織錦巴非蛤幼蟲在不同日齡對9種單胞藻的攝食情況與消化效果，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)幼蟲在1 dph時(shí)能攝食小球藻、微綠球藻、綠色巴夫藻、湛江等鞭金藻和球等鞭金藻，在4 dph時(shí)有少量幼蟲開始攝食杜氏鹽藻，至10 dph時(shí)幼蟲開始攝食亞心形扁藻和牟氏角毛藻，整個(gè)浮游幼蟲期均不攝食三角褐指藻?？楀\巴非蛤幼蟲對小球藻和微綠球藻的消化較對其他種類單胞藻的消化更難。

表3 不同日齡幼蟲對9種單胞藻的攝食與消化Table 3 Ingestion and digestion of nine microalgae species by larvae at different larval age

3 討論

織錦巴非蛤是一種小型的埋棲型雙殼經(jīng)濟(jì)貝類，其初孵幼蟲規(guī)格為（82.49±3.02）μm×（63.98±2.16）μm，較大多數(shù)附著型和固著型雙殼貝類初孵幼蟲大，如福建牡蠣（Crassostrea angulata）（Qiu et al.，2015）、企鵝珍珠貝（P.penguin）（Southgate et al.，2016）、珠母貝（Pinctada margaritifera）（鄧正華等，2018）及合浦珠母貝（P.fucata）（鄧正華等，2019）；但比其他埋棲型雙殼貝類初孵幼蟲小，如黃邊糙鳥蛤（Trachycardium flavum）（鄧正華等，2016）、象拔蚌（Panopea zelandical）（Le et al.，2017）、靚巴非蛤（P.schnelliana）（Deng et al.，2021a）及對角蛤（Antigona lamellaris）（Deng et al.，2021a；Chen et al.，2021）。一般認(rèn)為，初孵幼蟲的大小與其浮游期的長短成反比（鄧正華等，2016，2018）。幼蟲浮游期也是苗種培育過程中極不穩(wěn)定的時(shí)期，因此，浮游期縮短有利于提高苗種培育成功率，相對于浮游期長的種類能降低隨機(jī)事件造成的死亡風(fēng)險(xiǎn)（鄧正華等，2019）?？楀\巴非蛤幼蟲在水中正常運(yùn)動(dòng)時(shí)，雙殼張開，面盤伸出殼外且靠近殼的后端，面盤斜向上與水平方向約呈45°的夾角，纖毛不斷擺動(dòng)使面盤產(chǎn)生斜向上的牽引力。類似于珠母貝幼蟲（鄧正華等，2018）的運(yùn)動(dòng)方式，斜向上的牽引力又分解為水平方向和垂直方向的牽引力，水平方向牽引著幼蟲在水平方向的運(yùn)動(dòng)，垂直方向則促使幼蟲在水中維持懸浮或下降的狀態(tài)。俯視觀察發(fā)現(xiàn)，織錦巴非蛤幼蟲水平方向沿順時(shí)針方運(yùn)動(dòng)，與珠母貝幼蟲（鄧正華等，2018）、合浦珠母貝幼蟲（鄧正華等，2019）、靚巴非蛤幼蟲（Deng et al.，2021a）及對角蛤幼蟲（Deng et al.，2021b）在水中觀察到的運(yùn)動(dòng)方式相同。據(jù)Blake和Ottl（1996）對牡蠣幼蟲纖毛擺動(dòng)觀察，發(fā)現(xiàn)其與鐘形蟲（Vorticella）擺動(dòng)規(guī)律類似，纖毛周期性按統(tǒng)一方向擺動(dòng)，因此在帶動(dòng)面盤產(chǎn)生牽引力的同時(shí)產(chǎn)生一定方向旋轉(zhuǎn)，從而使幼蟲在水體中沿著一定的方向螺旋運(yùn)動(dòng)。螺旋運(yùn)動(dòng)是一種較特殊的運(yùn)動(dòng)行為，在原生動(dòng)物和軟體動(dòng)物的面盤幼蟲期較常見。浮游幼蟲螺旋運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)是沿著螺旋狀的路徑游動(dòng)，被認(rèn)為是由于身體形狀不對稱或鞭毛和纖毛等運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)所造成，許多雙殼貝類幼蟲還可通過改變纖毛擺動(dòng)頻率和面盤的角度而改變螺旋運(yùn)動(dòng)軌跡以應(yīng)對環(huán)境變化。Le等（2017）研究認(rèn)為，幼蟲在纖毛擺動(dòng)的同時(shí)形成水流，單胞藻隨著水流方向被運(yùn)送到幼蟲口溝處，部分單胞藻在口溝纖毛擺動(dòng)下被捕獲，從而經(jīng)幼蟲口溝進(jìn)入胃內(nèi)，攝食方式效率較低。相比于幼蟲的攝食方式，變態(tài)后的稚貝則依靠鰓進(jìn)行濾食，極大提高了攝食效率。因此，較短的浮游幼蟲期更有利于提高其苗種培育成功率。

本研究結(jié)果顯示，織錦巴非蛤幼蟲在1 dph時(shí)能攝食小球藻、微綠球藻、綠色巴夫藻、湛江等鞭金藻和球等鞭金藻，在4 dph時(shí)有少量幼蟲開始攝食杜氏鹽藻，至10 dph時(shí)幼蟲開始攝食亞心形扁藻和牟氏角毛藻，整個(gè)浮游幼蟲期均不攝食三角褐指藻。從單胞藻形態(tài)與粒徑大小分析可知，幼蟲更易攝食形狀呈圓形且粒徑較小的單胞藻，隨著幼蟲的生長逐漸攝食粒徑更大的單胞藻，與其他無脊椎動(dòng)物幼蟲攝食情況（Doroudi et al.，2003；Deng et al.，2021a，2021b）一致。雙殼貝類幼蟲一般是通過面盤外周纖毛的擺動(dòng)從而維持自身運(yùn)動(dòng)和形成相對水流，單胞藻隨著水流的方向進(jìn)入幼蟲口溝，單胞藻再經(jīng)過幼蟲口溝進(jìn)入胃內(nèi)，從而完成整個(gè)攝食過程（鄧正華等，2016）。因此，單胞藻形狀呈球形且粒徑較小的個(gè)體更易進(jìn)入到幼蟲口溝而被攝食。牟氏角毛藻由于耐高溫、生長繁殖快、易于大規(guī)模培養(yǎng)及富含不飽和脂肪酸等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于熱帶和亞熱帶地區(qū)無脊椎水生動(dòng)物苗種繁育（Reitan，2011；Carboni et al.，2012；Scholtz et al.，2013），且作為棘皮動(dòng)物和雙殼貝類幼蟲繁育的主要或搭配餌料（Doroudi et al.，2003；Knauer，2011；Kaspar et al.，2014）。牟氏角毛藻雖細(xì)胞粒徑大小只有6.68 μm×4.65 μm，但4個(gè)角分別著生有長度大于20 μm的硬質(zhì)角毛，易阻礙幼蟲攝食，因此不適宜作為幼蟲開口餌料（Deng et al.，2021a，2021b）。三角褐指藻在我國北方常用于雙殼貝類親貝催熟育肥的餌料，由于其形態(tài)特征呈長條形，長度約25 μm，導(dǎo)致幼蟲難以攝食，因此不適宜作為幼蟲培育期的餌料。此外，在織錦巴非蛤幼蟲能攝食的單胞藻餌料中，小球藻和微綠球藻較其他種類更難消化，在其他貝類中也得出相同的結(jié)論（Doroudi et al.，2003；Deng et al.，2021a，2021b）。小球藻和微綠球藻皆隸屬于綠藻門，其細(xì)胞外表有一層纖維素細(xì)胞壁（鄧正華等，2016），因此相對于無細(xì)胞壁種類更難消化。

4 結(jié)論

在織錦巴非蛤幼蟲培育過程中，幼蟲開口餌料宜選擇湛江等鞭金藻、球等鞭金藻和綠色巴夫藻，在10 dph時(shí)適宜投喂杜氏鹽藻，至13 dph時(shí)可投喂牟氏角毛藻藻和亞心形扁藻；在其他易被攝食和消化單胞藻種類充足的情況下，一般不選取小球藻和微綠球藻作為幼蟲培育的首選餌料。