飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能、免疫指標、轉錄組及腸道菌群的影響

陳 儉，代冰濤，王紅明，宋守鋼，譚北平，2，章 雙，2*

（1廣東海洋大學水產動物營養(yǎng)與飼料實驗室，廣東湛江 524088；2農業(yè)農村部華南水產與畜禽飼料重點實驗室，廣東湛江 524088）

0 引言

【研究意義】珍珠龍膽石斑魚（Epinephelu fus‐coguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）是以褐點石斑（E.fuscoguttatus）為母本、鞍帶石斑魚（E.lanceo‐latus）為父本雜交培育獲得（Koh et al.，2008；王麗娜等，2017），也稱為龍虎斑，是一種生性兇猛的肉食性魚類，隸屬于鱸形目（Perciformes）鱸亞目（Percoidei）鮨科（Serranidae）。因其肉質細嫩、營養(yǎng)豐富而深受消費者喜愛，且生長速度快，市場價值高。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖致使其養(yǎng)殖環(huán)境惡化，進而導致病害頻發(fā)，嚴重制約了石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（羅鳴等，2013）。免疫增強劑是指通過提高機體非特異性免疫功能以增強對外界應激和病原感染抵抗能力的物質，具有安全性、廣泛性及穩(wěn)定性等特點，能有效解決傳統(tǒng)化學藥物防治引起的耐藥性、藥物殘留及水體污染等問題（An‐derson，1992）。因此，在飼料中添加免疫增強劑替代化學藥物是魚蝦類等水產動物疾病防控的新方向。【前人研究進展】多糖作為一種免疫增強劑在水產養(yǎng)殖中已有較多研究報道（韓夢瑤等，2021），其中又以β-葡聚糖在水產養(yǎng)殖業(yè)中的應用最廣泛，主要用于改善生長性能和增強免疫力，以及提高機體抗氧化能力、促進消化和優(yōu)化腸道菌群結構等（許冰瑩和邵慶均，2019）。Bahmani等（2000）以不同水平的β-葡萄糖喂養(yǎng)波斯鱘魚（Acipenser persicus），結果發(fā)現其生長性能顯著提高。Ji等（2017）研究表明，β-葡聚糖不僅能明顯提高虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）特異性生長速率、體重增加和飼料效率，還能使其在應對殺鮭氣單胞菌感染時的存活率顯著增加。Reyes-Becerril等（2018）對太平洋紅鯛魚（Lutjanus peru）的外周血白細胞進行體外測定，發(fā)現β-葡聚糖組能顯著增加魚體的非特異性免疫應答，在受到細菌感染后體內的過氧化物酶活性顯著增強。Li等（2019）研究表明，在飼料中添加β-葡聚糖不僅可改善凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的消化酶活性、抗氧化能力和免疫能力，還能大量增加芽孢桿菌等益生菌，優(yōu)化腸道中定殖微生物群結構。Nguyen等（2019）研究發(fā)現，在鯉魚（Cyprinus carpio）養(yǎng)殖過程中以植物油形式在基礎飼料中添加β-葡聚糖能抑制體內的一些炎癥反應，且對其免疫調節(jié)無顯著負面影響。β-葡聚糖在石斑魚產業(yè)也有廣泛應用，不僅可降低石斑魚在運輸過程中帶來的損傷（Wu et al.，2020），還可作為珍珠龍膽石斑魚哈維氏弧菌疫苗的免疫佐劑（Wei et al.，2020），也可減輕土霉素對珍珠龍膽石斑魚造成的不良影響（Lee et al.，2020）。此外，張海艷等（2018）采用轉錄組測序分析腹腔注射β-葡聚糖對斜帶石斑魚的影響，結果發(fā)現β-葡聚糖可引起魚體免疫相關基因差異表達，進一步證實β-葡聚糖可作為新型漁業(yè)免疫增強劑?！颈狙芯壳腥朦c】目前，β-葡聚糖作為飼料添加劑在石斑魚上的研究主要集中在生長性能及免疫相關生化指標等方面（Chang et al.，2013；Lee et al.，2020），而鮮見從轉錄組水平分析差異表達免疫基因和腸道優(yōu)勢菌群的研究報道，特別是以β-葡聚糖作為免疫增強劑對珍珠龍膽石斑魚免疫途徑的分子機制及作用通路尚未明確?！緮M解決的關鍵問題】以珍珠龍膽石斑魚為研究對象，通過在飼料中添加β-葡聚糖進行養(yǎng)殖試驗，考察β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能和免疫指標的影響，并進行高通量測序及腸道菌群結構分析，旨在明確β-葡聚糖誘導珍珠龍膽石斑魚的免疫響應機制，為β-葡聚糖作為免疫增強劑在水產飼料中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 飼料配方

β-葡聚糖來源于釀酒酵母，購自青島瑪斯特生物技術有限公司?；A飼料配方如表1所示，其粗蛋白含量為50.18%、粗脂肪含量為11.63%。以基礎飼料組為對照組，參考吳春玉等（2013）、李永娟等（2015）的研究結果，在基礎飼料中添加100 mg/kg β-葡聚糖。飼料原料粉碎后過60目篩，準確稱取各飼料原料，將β-葡聚糖按逐級擴大法混合均勻，采用雙螺桿擠條機（F-75華南理工大學科技實業(yè)總廠）加工成2.0和2.5 mm規(guī)格的飼料。飼料制作完成在通風處風干，用自封袋密封，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼料組成配方（干物質基礎）Table 1 Basic feed composition（dry matter basis）

1.2 試驗用魚及養(yǎng)殖管理

珍珠龍膽石斑魚苗購自廣東省湛江市雷州石斑魚苗場，購回后暫養(yǎng)于廣東海洋大學東海島生物研究基地室內的海水魚養(yǎng)殖系統(tǒng)1000 L玻璃鋼桶中，期間投喂商品料，馴化1周后隨機挑選規(guī)格一致、初始平均體重為6.12±0.22 g、健壯無病的珍珠龍膽石斑魚置于玻璃鋼桶（500 L）中進行養(yǎng)殖。試驗設2個處理（對照組和β-葡聚糖組），每處理3個重復，每個重復40尾魚，養(yǎng)殖8周。養(yǎng)殖期間，按魚體重3%進行表觀飽食投喂2次（8：00和17：00），投喂量依據攝食情況和天氣變化及時調整。投喂1 h后通過虹吸法清除殘餌和糞便，每天換水1次，每次換水量為50%。試驗期內養(yǎng)殖車間由自然光照提供光源，水溫28~30 ℃，海水鹽度為26.5‰~28.0‰，連續(xù)充氧，溶解氧含量>6.8 mg/L，pH 7.8~8.2，氨氮含量<0.03 mg/L。記錄養(yǎng)殖過程中試驗魚的異?，F象。

1.3 樣本采集

養(yǎng)殖試驗結束，空腹24 h后稱取每桶珍珠龍膽石斑魚總重，記錄存活尾數，體重和體長用于生長性能分析。以丁香酚進行麻醉后，通過尾靜脈取血法抽取全血，每個重復6尾魚，每尾魚抽取1 mL，前3尾全血放入裝有抗凝劑的無菌防爆管，經液氮速凍后-80 ℃保存，用于轉錄組測序；后3尾全血置于離心管中，離心收集上清液，分裝后-80 ℃保存，用于血清生化指標測定。采集完血剩下的試驗魚解剖3尾取胃和腸道，剔除內容物及腸系膜，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，置于防爆管中，液氮速凍后-80 ℃保存。取出待測樣品在4 ℃下解凍，用剪刀剪成小塊，加入10倍體積的預冷生理鹽水，高速組織勻漿機冰浴勻漿，勻漿液經2500 r/min離心10 min后取上清液，用于測定消化酶活性。每個重復取4尾珍珠龍膽石斑魚，用75%酒精擦拭體表，無菌條件下剖取中腸，以無菌生理鹽水漂洗后裝入無菌防爆管中，液氮速凍后-80 ℃保存，用于腸道微生物測定。同時，對飼料進行常規(guī)分析，其中粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法，粗脂肪含量測定采用索氏提取法。

1.4 生長性能分析

珍珠龍膽石斑魚的存活率、增重率、特定生長率、飼料系數、肝體比及肥滿度分別按以下公式計算：

存活率（SR，%）=Nt/N0×100

增重率（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100

特定生長率（SGR，%/d）=（lnWt-lnW0）/t×100

飼料系數（FCR）=F/（Wt+Wn-W0）

肝體比（HSI，%）=肝臟重/全魚重×100

肥滿度（CF，g/cm2）=Wi/（L3）×100

式中，Nt為終末珍珠龍膽石斑魚尾數，N0為初始珍珠龍膽石斑魚尾數，Wt為終末珍珠龍膽石斑魚總重，W0為初始珍珠龍膽石斑魚總重，Wn為死亡個體總量，t為養(yǎng)殖時間，F為攝入飼料干重，Wi為珍珠龍膽石斑魚體重（g），L為珍珠龍膽石斑魚體長（cm）。

1.5 血清生化指標測定

珍珠龍膽石斑魚血清生化指標采用南京建成生物工程研究所有限公司生產的試劑盒進行測定，每個樣品重復3次，血清生化指標包括總蛋白（Total protein，TP）、葡萄糖（Glucose，GLU）、總膽固醇（To‐tal cholesterol，TCHO）、總甘油三酯（Total triglyceride，TG）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量及谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、溶菌酶（Lysozyme，LZM）、胃蛋白酶（Pepsin）、腸胰蛋白酶（Trypsin）、腸淀粉酶（Amy‐lase）、腸脂肪酶（Lipase）活性。

1.6 轉錄組測序分析

1.6.1 測序文庫構建及Illumina測序 用TRIzol?試劑（美國Invitrogen公司）從血細胞中提取總RNA，以帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若為原核生物，則用試劑盒去除rRNA）。加入Fragmenta‐tion Buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA Polymerase I合成cDNA第二鏈，經Qia Quick PCR試劑盒純化并加入EB緩沖液洗脫后進行末端修復、加poly（A）尾并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進行片段選擇，最后進行PCR擴增，建好的測序文庫委托廣州基迪奧生物科技有限公司，采用Illumina HiSeqTM4000進行測序。

1.6.2 轉錄組De novo組裝 Illumina測序得到的原始圖像數據經Base Calling轉化為序列數據，對原始數據（Raw date）進行過濾，去除含Adaptor的Reads、低質量Reads（Q≤20的堿基數占整個Read的40%以上）、N率≥10%的Reads，得到高質量的Clean reads。使用Trinity進行轉錄組De novo組裝：首先將具有一定長度overlap的Reads連成更長的片段，再通過Reads overlap得到不含N的組裝片段即組裝獲得Unigenes。

1.6.3 轉錄組注釋分析 注釋前利用Trinity提供的ORF預測流程對組裝的Unigenes進行基因預測，通過HMMER 3.0對組裝的Unigenes在Pfam數據庫中進行蛋白家族注釋分析。設定期望值<0.00001，使用BLASTx對拼接所得的所有核苷酸序列分別在Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG數據庫進行比對，以獲得相應的注釋信息。

1.6.4 差異表達基因富集分析 使用Bowtie將Clean reads比對到轉錄組序列上，通過RSEM對Bowtie比對結果進行表達量統(tǒng)計分析，以RPKM/FPKM衡量基因的表達量水平，并運用edgeR進行基因表達差異分析。FDR≤0.05且|log2FC（Sample2/Sample1）|≥1，則該基因為顯著差異表達基因。然后利用Blast2 GO在GO數據庫中進行功能分類注釋，并在KEEG數據庫中進行代謝通路富集分析。

1.6.5 實時熒光定量PCR驗證 為驗證RNA-Seq測序結果準確性，選擇保存在-80 ℃用于轉錄組測序的樣本提取RNA進行實時熒光定量PCR驗證。隨機選擇10個差異表達基因進行驗證，包括肌紅蛋白（Myoglobin）基因、絮凝蛋白FLO11（SPRR3）基因、Septin-5基因、細胞表面糖蛋白（MCAM）基因、血清剝奪反應因子（SDPR）基因、逆轉錄病毒相關Pol多蛋白（Pol）基因、Kruppel-like因子9（KLF9）基因、干擾素調節(jié)因子4（IRF4）基因、C-myc啟動子結合蛋白（DENND4A）基因和肽基脯氨酰順反異構酶（FKBP5）基因。差異表達基因擴增引物序列如表2所示，以EF1α為內參基因。利用實時熒光定量PCR儀（德國Eppendorf公司）進行檢測，擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃15 s，60 ℃10 s，72 ℃20 s，進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法換算目的基因相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR擴增引物序列信息Table 2 Real-time fluorescent quantitative PCR amplified primer sequence information

1.7 腸道菌群組成分析

1.7.1 PCR擴增及產物回收 采用美國Hipurte PowerSoil?的DNA Isolation Kit試劑盒完成珍珠龍膽石斑魚腸道細菌總DNA提取，采用16S rDNA序列V3~V4區(qū)通用引物（341F：5'-CCTAYGGGRBGCAS CAG-3'；806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）進行PCR擴增，反應體系20.0 μL：5×FastPfu Buffer 10.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5μL，DNA模板10 ng，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性1 min；98 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，進行27個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后利用成像系統(tǒng)檢測，并在紫外燈下割取目的條帶，隨后按凝膠回收試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說明純化目的產物，最后用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果。將DNA濃度調至25 ng/μL，所有樣品按1∶1混勻后，通過Illumina HiSeq PE250平臺進行建庫及測序，委托廣州賽哲生物科技股份有限公司完成。

1.7.2 信息學分析 得到Clean Tags后進行OTUs聚類分析。根據OTUs聚類結果，對每個OTU的代表序列進行物種注釋，得到對應的物種注釋信息和基于物種的豐度分布情況；同時對OTUs進行豐度、Al‐pha多樣性分析（包括物種豐富度指數Chao1和ACE，多樣性指數Shannon和Simpson），明確樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等；最后在門和屬2個分類水平上統(tǒng)計每個樣品的物種豐度和物種分布，進行群落結構分析。

1.8 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 7.04對試驗數據進行t檢驗，以分析組間差異。

2 結果與分析

2.1 飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能的影響

與對照組相比，添加β-葡聚糖能顯著提高珍珠龍膽石斑魚的終末體重、增重率和特定生長率（P<0.05，下同）。β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚的存活率和肥滿度也高于對照組，肝體比低于對照組，但差異不顯著（P>0.05，下同）。在飼料系數方面，β-葡聚糖組顯著高于對照組（表3）。

表3 飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能的影響Table 3 Effects of adding β-glucan to feed on growth perfor‐mance of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.2 飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚血清生化和免疫指標的影響

如表4所示，飼料中添加β-葡聚糖能顯著提高珍珠龍膽石斑魚血清中總蛋白含量，同時顯著降低總膽固醇和總甘油三酯水平。與對照組相比，β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚血清中的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性均呈下降趨勢，其中谷丙轉氨酶活性呈顯著下降趨勢。添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚血清中的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性未造成顯著影響，但可使過氧化氫酶和溶菌酶活性顯著提高，丙二醛含量顯著降低。

表4 飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚血清生化和免疫指標的影響Table 4 Effects of adding β-glucan to feed on serum biochemical and immune indexes of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.3 飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚消化酶的影響

如表5所示，β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚的胃蛋白酶和腸道脂肪酶活性顯著高于對照組，而胰蛋白酶和腸淀粉酶活性與對照組相比無顯著差異。

表5 飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚消化酶的影響Table 5 Effects of adding β-glucan to feed on digestive en‐zyme of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.4 飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚轉錄組的影響

2.4.1 測序及序列組裝結果 利用Illumina HiSeq PE250平臺進行測序，濾掉低質量堿基后得到的有效堿基（Clean bases）數目為8194810200個，Clean bases占總堿基數的98.50%。原始Reads濾過后得到54632068條Clean reads，占原始Reads的97.14%，其中GC含量為49.96%、Q20為98.50%、Q30為95.50%。采用Trinity對Clean reads進行組裝，共獲得79291條Unigenes，其長度范圍為201~20143 bp，所有Unige‐nes長度均大于200 bp，平均長度為941 bp，Unigenes的N50為2141 bp。進一步對Unigenes進行質量評估，結果發(fā)現隨著序列長度的增加，Unigenes分布數量呈逐級遞減趨勢（圖1），沒有明顯中斷現象，表明本研究的轉錄組測序質量較高。

圖1 Unigenes序列長度統(tǒng)計結果Fig.1 Unigenes sequence length statistics

2.4.2 轉錄組注釋分析結果 通過與Nr、Swiss-Prot、KOG、KEGG數據庫進行比對，發(fā)現有28811條Unigenes與已知基因同源，占整個組裝轉錄本的36.34%，在Nr、Swiss-Prot、KOG、KEGG數據庫中注釋到的同源序列數目分別為28664（占36.15%）、19668（占24.80%）、16056（占20.24%）和14866（占18.74%）條。物種同源性分析結果（圖2）顯示，珍珠龍膽石斑魚Unigenes與Nr數據庫中的脊椎動物基因高度同源，其中與大黃魚（Larimichthys crocea）的同源序列比例最高，達22.26%（6381個），其次是與盲曹魚（Lates calcarifer），其同源序列比例達22.10%（6335個）。

圖2 轉錄組序列同源物種分布統(tǒng)計結果Fig.2 Transcriptome sequence allied species distribution statistics

對79291條Unigenes進行GO功能注釋分析，結果顯示共有35161條Unigenes在生物學過程（Biologi‐cal process）、細胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）三大類別的53個功能分支中得到注釋（圖3）。在生物學過程方面，Unigenes主要注釋到細胞過程（Cellular process）、單一生物過程（Single-organism process）、代謝過程（Metabolic pro‐cess）和生物調控（Biological regulation）等功能條目上；在細胞組分方面，以注釋到細胞（Cell）、細胞部分（Cell part）、生物膜（Membrane）、生物膜部分（Membrane part）和細胞器（Organelle）等功能條目的Unigenes較多；在分子功能方面，Unigenes主要注釋到結合（Binding）和催化活性（Catalytic activity）2個功能條目上。

圖3 Unigenes的GO功能注釋分析結果Fig.3 GO functional annotation analysis result of unigenes

對79291條Unigenes進行KEGG信號通路富集分析，結果如圖4所示，共有16849條Unigenes富集為細胞過程（Cellular processes）、有機系統(tǒng)（Organis‐mal systems）、代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic information processing）和環(huán)境信息（Envi‐ronmental information processing）五大分類，富集到的Unigenes數目分別為2875（占17.06%）、2129（占12.64%）、6865（占40.74%）、2089（占12.40%）和2891（占17.16%）條，共涉及228條KEGG信號通路，其中免疫相關通路有16條。

圖4 Unigenes的KEGG信號通路富集分析結果Fig.4 KEGG signaling pathway enrichment analysis result of unigenes

2.4.3 差異表達基因篩選及富集分析結果 依據FDR≤0.05且|log2FC（Sample2/Sample1）|≥1的篩選條件，共篩選獲得8014個差異表達基因（圖5），包括4990個上調基因和3024個下調基因。GO功能注釋分析結果（圖6）表明，分別有470、262和436個差異表達基因注釋到生物學過程、細胞組分和分子功能三大類別中。在生物學過程類別中，以生物調控所占比例最高，其次是細胞過程、代謝過程和單一生物過程；在細胞組分類別中，以細胞類別所占比例最高，其次是細胞部分及細胞器；在分子功能類別中，主要是結合及分子傳感器活性功能。KEEG信號通路富集分析結果（圖7）顯示，共有648個差異表達基因富集到175個KEEG信號通路上。其中，富集基因數目最多且具有顯著差異的前10個信號通路分別是細胞因子—細胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、吞噬體（Phagosome）、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、微生物在不同環(huán)境中的代謝（Microbial metabolism in diverse environ‐ments）、細胞黏附分子（Cell adhesion molecules）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、JAK-STAT信號通路（Jak-STAT signaling pathway）、神經活性配體—受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、糖化/葡萄糖生成（Glycolysis/gluconeogenesis）及IgA產生的腸道免疫網絡（Intestinal immune network for IgA production）。在富集到的KEGG信號通路中共有16條通路與免疫功能相關，涉及139個顯著差異基因。與對照組相比，β-葡聚糖組有108個顯著上調的差異表達基因和31個顯著下調的差異表達基因富集到13條免疫調節(jié)通路上（表6）。

表6 飼料添加β-葡聚糖后珍珠龍膽石斑魚中與免疫通路相關的差異表達基因Table 6 DEGs related to immune pathway in E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂after adding β-glucan to the feed

圖5 差異表達基因的火山圖Fig.5 Volcano map of DEGs

圖6 差異表達基因的GO功能注釋分析結果Fig.6 GO functional annotation analysis of differentially expressed genes（DEGs）

圖7 差異表達基因的KEGG信號通路富集分析結果Fig.7 KEGG signaling pathway enrichment analysis of DEGs

2.4.4 實時熒光定量PCR驗證結果 隨機挑選在對照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚間呈顯著差異表達的相關基因（Myoglobin、SPRR3、Septin5、MCAM、SDPR、Pol、KLF9、IRF4、DENND4A和FKBP5）進行實時熒光定量PCR驗證，結果（圖8）顯示，實時熒光定量PCR檢測得到的基因相對表達量與RNA-Seq測序結果基本一致。

圖8 珍珠龍膽石斑魚差異表達基因實時熒光定量PCR驗證結果Fig.8 Real-time fluorescent quantitative PCR verification analysis of DEGs in E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.5 飼料中添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的影響

2.5.1 腸道菌群多樣性分析結果 珍珠龍膽石斑魚腸道菌群多樣性分析結果（表7）表明，β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的OTUs數量、ACE指數和Shannon指數均顯著高于對照組，而Chao1指數和Simpson指數在兩處理組間無顯著差異。

表7 飼料添加β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚腸道菌群多樣性的影響Table 7 Effects of adding β-glucan to feed on intestinal bacte‐ria community diversity of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.5.2 腸道菌群結構組成 在門分類水平上，對照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群中共發(fā)現30個門類，包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻門（Cyanobacteria）及厚壁菌門（Firmicutes）等。選取2個處理組相對豐度排名前5的物種生成相對豐度柱形堆疊圖，結果顯示其總相對豐度均超過97%（圖9），但不同門類細菌在兩處理組間的相對豐度存在明顯差異，β-葡聚糖組中變形菌門、藍藻門的相對豐度顯著低于對照組（圖10-A和圖10-C），而厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度極顯著高于對照組（圖10-B和圖10-D）。

圖9 在門分類水平上對照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群結構的差異Fig.9 Intestinal bacteria community structural difference of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂in control and β-glu‐can groups at phylum level

圖10 β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚腸道優(yōu)勢菌門相對豐度的影響Fig.10 Effects of β-glucan on phylum-level dominant bacteria relative abundance of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

在屬分類水平上，對照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群中共發(fā)現295個種屬，包括發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphin‐gomonas）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）及無色桿菌屬（Achromobacter）等，選取2個處理組相對豐度排名前5的物種生成相對豐度柱形堆疊圖（圖11）。不同種屬細菌在兩處理組間的相對豐度也存在明顯差異，β-葡聚糖組中發(fā)光桿菌屬的相對豐度顯著低于對照組（圖12-A），鹽單胞菌屬的相對豐度極顯著低于對照組（圖12-B），而其余3 個種屬的相對豐度在兩處理組間無顯著差異（圖12-C、圖12-D和圖12-E）。

圖11 在屬分類水平上對照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群結構的差異Fig.11 Intestinal bacteria community structural difference of E.fuscoguttatus ♀× E.lanceolatus♂in control and βglucan groups at genus level

圖12 β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑魚腸道優(yōu)勢菌屬相對豐度的影響Fig.12 Effects of β-glucan on genus-level dominant bacteria relative abundance of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

3 討論

已有大量研究表明，在飼料中添加β-葡聚糖能有效提高魚類的生長性能。Selvaraj等（2005）研究發(fā)現，在飼料中添加酵母β-葡聚糖能提高鯉魚的存活率、特異性和非特異性生長性能；周艷萍等（2008）研究表明，β-葡聚糖能提高異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）的存活率，但效果不顯著；吳春玉等（2013）對花鱸的研究表明，飼料中添加β-葡聚糖能顯著提高其增重率和特定生長率。本研究發(fā)現，在飼料中添加β-葡聚糖能顯著提高珍珠龍膽石斑魚的增重率和特定生長率，表明β-葡聚糖對珍珠龍膽石斑起到促生長作用。肝體比和肥滿度是反映魚體形體的重要指標。本研究結果表明，飼料中添加β-葡聚糖可降低珍珠龍膽石的肝體比，提高其肥滿度，但效果均不顯著，與β-1,3-葡聚糖對花鱸的研究結果（吳春玉等，2013）一致。此外，多種魚類攝食添加β-葡聚糖的飼料時其飼料系數顯著提高。許國煥等（2004）對羅非魚的研究發(fā)現，投喂β-葡聚糖飼料組的飼料系數顯著高于基礎飼料組，推測是由于胰蛋白酶分解產物中存在抑制生長因子。周艷萍等（2008）研究表明，對異育銀鯽投喂210和420 mg/kg的β-葡聚糖時其飼料系數均顯著提高。本研究中，β-葡聚糖添加組珍珠龍膽石的飼料系數明顯高于對照組，可能與β-葡聚糖對魚的消化能力產生的影響有關，但具體原因有待進一步探究。

血清生化指標可反映機體物質代謝和某些組織器官的變化，常用于評價魚體健康及營養(yǎng)狀況等。其中，血清總蛋白含量能反映魚體的營養(yǎng)與代謝狀況，也間接反映機體的免疫水平（Bahmani et al.，2000）；血清總膽固醇和總甘油三酯的變化情況可反映機體脂質代謝功能。吳春玉等（2013）在花鱸中的研究表明，飼料中添加適量β-葡聚糖在一定程度上能升高花鱸體內血清總蛋白含量，降低總膽固醇和總甘油三酯水平，說明飼料中添加β-葡聚糖能促進機體蛋白合成，進而提高花鱸對蛋白的消化吸收，同時脂類等營養(yǎng)物質通過代謝而促進其生長。本研究結果也表明，在珍珠龍膽石斑魚飼料中添加β-葡聚糖能顯著提高血清總蛋白含量，并顯著降低血清總膽固醇和總甘油三酯水平，說明β-葡聚糖在不同魚類中能發(fā)揮相似的功能。谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶是衡量動物機體肝臟是否受損的標志之一，其活性隨著肝臟受損傷的程度增加而升高，當肝臟受到損傷或短期內外界環(huán)境的刺激，血清中的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性就會升高（Giannini et al.，2003）。本研究結果表明，珍珠龍膽石斑魚血清中的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性均低于對照組，且β-葡聚糖添加組的谷丙轉氨酶活性與對照組間差異顯著，說明β-葡聚糖能有效保護珍珠龍膽石斑魚肝臟不受損。汪成竹和陳昌福（2008）、賀國龍等（2010）研究發(fā)現，以β-葡聚糖為主要成分的酵母細胞壁免疫多糖可顯著降低草魚血清中谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性，改善草魚的肝功能。過氧化氫酶能將體內形成的過氧化物氧化成無害物質，對宿主起保護作用；溶菌酶則具有抗菌、消炎、抗病毒等作用；丙二醛是膜脂氧化的重要標志物，能加劇膜氧化，具有細胞毒性（張晨光等，2021）。Engstad等（1992）研究發(fā)現給虹鱒中注射β-葡聚糖其血清過氧化氫酶活性顯著提

高；王永宏等（2013）研究表明腹腔注射β-葡聚糖可有效提高暗紋東方魚血清過氧化氫酶和溶菌酶活性；吳春玉等（2013）研究發(fā)現在飼料中添加適量β-葡聚糖能一定程度上降低花鱸血清丙二醛含量。在本研究中，β-葡聚糖能顯著提高珍珠龍膽石斑魚血清過氧化氫酶和溶菌酶活性，并顯著減低丙二醛含量，進一步證實β-葡聚糖可提高魚類的抗氧化水平與抗菌能力，降低丙二醛造成的細胞毒性作用，進而提升機體免疫力。

本研究的差異表達基因GO功能注釋分析結果表明，分別有470、262和436個差異表達基因注釋到生物學過程、細胞組分和分子功能三大類別中；KEGG信號通路富集分析則發(fā)現有有648個差異表達基因被富集到175個KEEG信號通路上，其中有16條通路與免疫功能有關，以MAPK信號通路、Toll樣受體信號傳導通路、Jak-STAT信號通路及細胞凋亡等通路富集到的差異表達基因最多。Jak-STAT信號通路參與機體的多種調節(jié)反應，其中，白細胞介素-6（IL-6）與白細胞介素-6受體α（IL-6Rα）結合，通過這種結合IL-6可誘導gp130同型二聚化（Heinrich et al.，1998），而gp130同型二聚化可觸發(fā)JaK-STAT級聯(lián)，異常的IL-6信號或導致自身免疫性及炎癥等疾?。∟eurath and Finotto，2011；Sansone and Bromberg，

2012）。Toll樣受體（TLRs）可識別不同的病原體相關分子模式，在先天性免疫應答中扮演重要角色，是機體抵御病原體入侵的第一道防線（Horng et al.，2001；Kagan and Medzhitov，2006）。Toll/白細胞介素-1受體結構域包含接頭蛋白（TIRAP），可介導相關Toll樣受體下游信號轉導。本研究發(fā)現，在飼料中添加β-葡聚糖能誘導珍珠龍膽石斑魚IL-6基因和TI‐RAP基因高表達，提示IL-6和TIRAP介導的JaKSTAT信號通路及Toll樣受體信號通路在先天免疫屏障中發(fā)揮作用，參與珍珠龍膽石斑魚抗病免疫反應。

魚類消化道中的菌群主要是通過環(huán)境或食物進入消化道定殖，進而成為魚類消化道重要的組成成分，與魚類的健康及免疫密切相關。魚類一旦接觸到周圍的水生環(huán)境和活餌料，多種細菌即開始在腸道內定殖，而最先定殖的細菌與宿主腸道環(huán)境相適應，因此腸道是消化道內細菌數量最多的部位（宋增福和吳天星，2007）。多糖通常被認為是一種腸道功能調節(jié)劑，能改善動物腸道菌群結構，促進有益菌生長，并抑制有害菌繁殖。在本研究中，添加β-葡聚糖后珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的OTUs數量、ACE指數和Shannon指數顯著高于對照組，表明β-葡聚糖能顯著提高腸道菌群物種豐富度和多樣性。腸道菌群結構組成分析結果顯示，珍珠龍膽石斑魚腸道菌群以變形菌門占主導地位，其次是厚壁菌門和擬桿菌門。變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是動物腸道當中最常見的定殖菌，其中變形菌門豐度升高可能是導致腸道菌群不平衡的主要原因（Shin et al.，2015）。擬桿菌門和厚壁菌門所產生的多糖水解酶能有效降解膳食纖維，進而產生單糖和短鏈脂肪酸，是腸道內壁細胞基本代謝的能量來源之一（Mount‐fort et al.，2002）。楊俊花等（2017）研究表明，在小鼠腸道中，腸道炎癥可能會伴隨著變形菌門上升及擬桿菌門下降。在本研究中，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門在β-葡聚糖添加組和對照組珍珠龍膽石斑魚腸道中均占優(yōu)勢，但β-葡聚糖添加組變形菌門的相對豐度較對照組呈顯著下降趨勢，表明添加β-葡聚糖可調節(jié)魚腸道有益菌的相對豐度，在屬分離水平上也得到證實。美人魚發(fā)光桿菌（P.damselae）又稱?；【?，隸屬于發(fā)光桿菌屬，是海洋魚類常見的一種致病菌，能致使魚類死亡（王洪彬等，2018）。因此，發(fā)光桿菌屬相對豐度的下降能有效抑制美人魚發(fā)光桿菌的產生。何遠法等（2017）以添加酵母培養(yǎng)物（葡聚糖≥50%，甘露寡糖≥1%）的飼料喂養(yǎng)凡納濱對蝦，其腸道中發(fā)光桿菌屬豐度下降；Jung-Schroers等（2015）研究發(fā)現在飼料中添加β-葡聚糖對鯉魚腸道菌群也有一定的影響，尤其是顯著降低腸道中的弧菌數目，增加菌群多樣性。在本研究中，β-葡聚糖添加組珍珠龍膽石斑魚腸道中的發(fā)光桿菌屬相對豐度明顯下降，也表明β-葡聚糖可調節(jié)魚類腸道菌群多樣性，優(yōu)化菌群結構組成。

4 結論

β-葡聚糖能有效增強珍珠龍膽石斑魚的抗氧化能力及提高其腸道菌群物種豐度和多樣性以抵御外界有害菌的繁殖，同時提升珍珠龍膽石斑魚的抗炎癥和抗病等免疫能力。即β-葡聚糖在珍珠龍膽石斑魚上具有良好的生長和免疫增強效果，可作為新型免疫增強劑推廣應用。