不同濃度丙泊酚抑制宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的效果及作用機(jī)制研究Δ

李利彪，張雨瑩，代志慧，楊 昊，趙海平，戴曉怡

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，呼和浩特010050； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院放療科，呼和浩特 010050； 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，呼和浩特 010050； 4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，呼和浩特 010050)

宮頸癌是一種特發(fā)于女性的惡性腫瘤，在所有女性惡性腫瘤中該病的發(fā)病率居第2位，近年來(lái)該病的發(fā)病率明顯升高，且發(fā)病逐漸呈年輕化[1]。隨著宮頸癌診療水平的提高，病死率有所降低，但在我國(guó)該病仍是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一[2]。宮頸癌的常用治療手段為手術(shù)，但是復(fù)發(fā)率較高。研究結(jié)果顯示，宮頸癌復(fù)發(fā)的主要因素之一為惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在手術(shù)操作中減少惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移對(duì)降低術(shù)后復(fù)發(fā)率也有一定優(yōu)勢(shì)[3-4]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和Wnt等信號(hào)通路參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其中最重要的通路為Wnt信號(hào)通路[5]。該信號(hào)通路可對(duì)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲進(jìn)行調(diào)節(jié)。丙泊酚是臨床術(shù)前使用率較高的麻醉藥。臨床研究結(jié)果表明，丙泊酚、嗎啡等麻醉藥會(huì)對(duì)惡性腫瘤的進(jìn)展造成一定的影響。較多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚主要通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用。故本研究對(duì)不同濃度丙泊酚抑制宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的效果以及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：宮頸癌HELA細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只普通級(jí)雌性成年Wistar大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，平均飼養(yǎng)于12個(gè)籠子內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度15～18 ℃，濕度35%～40%。

1.1.3 儀器：Attune CytPix成像型流式細(xì)胞儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；970CRT型熒光分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；U-CTR30-2型倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；5415R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.1.4 藥品與試劑：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF，上海信乎生物科技有限公司，批號(hào)為0810H2020)；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，深圳子科生物科技有限公司，批號(hào)為201308)；Annexin V-FITC(廣州博翔生物科技有限公司，批號(hào)為69060010)；增殖細(xì)胞核抗原(PCNA，深圳子科生物科技有限公司，批號(hào)為201308)；Ki67(杭州百替生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為A20191210)；Caspase-9和Caspase-3(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為20181029和20150623)；丙泊酚乳狀注射液(西安力邦制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20163040)；CCK試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(上海博升生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，上海烜雅生物科技有限公司)；凋亡檢測(cè)試劑盒(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Binding Buffer(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；碘化丙啶[PI，范德(北京)生物科技有限責(zé)任公司]。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥：(1)取丙泊酚(質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5和10 μg/mL)對(duì)人宮頸癌HELA細(xì)胞進(jìn)行處理，分為高劑量組(10 μg/mL)、中劑量組(5 μg/mL)、低劑量組(2.5 μg/mL)和空白對(duì)照組(0 μg/mL)。(2)取丙泊酚(質(zhì)量濃度分別為0、10、20和50 μg/mL)對(duì)60只普通級(jí)雌性成年Wistar大鼠進(jìn)行腹腔注射，并對(duì)其進(jìn)行分組，即高劑量組(50 μg/mL)、中劑量組(20 μg/mL)、低劑量組(10 μg/mL)和空白對(duì)照組(0 μg/mL)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：于DMEM高糖培養(yǎng)基(10%FBS)內(nèi)培養(yǎng)人宮頸癌HELA細(xì)胞，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中完成，細(xì)胞傳代培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 模型建立：使用0.25%胰酶消化宮頸癌HELA細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為0.10%的小牛血清終止培養(yǎng)基消化，以1 200 r/min的轉(zhuǎn)速離心處理5 min(離心半徑為10 cm)，上層清液去除后懸浮沉淀、記數(shù)，最后定容。將細(xì)胞懸液(2.5×108g/L)經(jīng)大鼠尾靜脈注射，注射后第3日觀察大鼠腫瘤生長(zhǎng)情況。發(fā)現(xiàn)腫瘤后10周內(nèi)每周對(duì)瘤體短徑和長(zhǎng)徑以超聲診斷儀測(cè)量，從3周開(kāi)始，檢查是否出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。記錄生存時(shí)間，待其自然死亡后進(jìn)行解剖，取新鮮瘤體組織進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.2.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖：對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，有80%以上的細(xì)胞生長(zhǎng)融合度后，進(jìn)行胰蛋白酶消化，離心處理后進(jìn)行PBS溶液洗滌，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基重懸，對(duì)細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整，調(diào)至為1×104個(gè)/mL。選擇96孔板，將90 μL細(xì)胞懸液置入每孔，4孔為1組。將不同濃度丙泊酚(0、2.5、5和10 μg/mL)置入。將CCK8試劑(10 μL)加入各孔內(nèi)，混勻并進(jìn)行3 h的培養(yǎng)，再對(duì)吸光度(波長(zhǎng)位置450 nm)進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞增殖計(jì)算根據(jù)CCK試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：選擇恒溫離心機(jī)，溫度控制為4 ℃，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心處理5 min(離心半徑為10 cm)，將Binding Buffer重懸細(xì)胞(100 μL)加入收集細(xì)胞內(nèi)，并置入PI(5 μL)和Annexin V-FITC(5 μL)，混合均勻。在室溫(25 ℃)下，進(jìn)行15 min避光孵育，再將Binding Buffer(400 μL)置入，開(kāi)展流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)。

1.2.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力：對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24 h培養(yǎng)，完成無(wú)FBS懸浮液的制作，在恒溫(37 ℃)條件下培養(yǎng)1 d，之后用顯微鏡選擇任意視野，對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，并記錄細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 大鼠模型試驗(yàn)：60只大鼠完成移植瘤模型建立后腹腔注射不同濃度丙泊酚(10、20和50 μg/mL)；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，選擇等量0.9%氯化鈉溶液注入。1個(gè)月后對(duì)腫瘤進(jìn)行稱重。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：采用蛋白質(zhì)印跡法，選擇掃描儀對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行掃描，對(duì)VEGF、MMP-9、Caspase-9、Caspase-3、PCNA和Ki67蛋白質(zhì)條帶灰使用Imagaquent 5.1軟件進(jìn)行處理分析。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶/GAPDH灰度。

1.2.9 免疫組化觀察：通過(guò)PV法染色，石蠟切片后進(jìn)行脫蠟，浸泡于過(guò)氧化氫甲醇溶液(3%)內(nèi)，15 min后通過(guò)4%胃蛋白消化，消化15 min后將效價(jià)1∶ 50的一抗VEGF和Ki67滴入，放入濕盒內(nèi)，儲(chǔ)存恒溫冰箱12 h，以PBS(0.01 mol/L)進(jìn)行清洗，之后將二抗葡聚糖-酶復(fù)合物滴入，在37 ℃條件下，孵育1 h，再進(jìn)行1次PBS(0.01 mol/L)清洗，顯色，再通過(guò)蘇木精復(fù)染60 s，脫水、封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚高、中及低劑量組與空白對(duì)照組宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)比較

(1)高劑量組、中劑量組、低劑量組與空白對(duì)照組(丙泊酚0 μg/mL)宮頸癌HELA細(xì)胞經(jīng)丙泊酚處理24、48和72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)能力的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；96 h后，空白對(duì)照組宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯高于高劑量組、中劑量組和低劑量組，低劑量組宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)能力高于中劑量組、高劑量組，中劑量組宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)能力高于高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。(2)高劑量組、中劑量組和低劑量組細(xì)胞的PCNA、Ki67蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，中劑量組、低劑量組細(xì)胞的PCNA、Ki67蛋白表達(dá)水平高于高劑量組，低劑量組細(xì)胞的PCNA、Ki67蛋白表達(dá)水平高于中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖1 四組宮頸癌HELA細(xì)胞增殖倍數(shù)比較Fig 1 Comparison of the proliferation fold among four groups of cervical cancer HELA cells

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖2 四組細(xì)胞的PCNA、Ki67蛋白表達(dá)水平比較Fig 2 Comparison of the expression levels of PCNA and Ki67 protein among four groups of cells

2.2 丙泊酚高、中及低劑量組與空白對(duì)照組宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡比較

(1)空白對(duì)照組宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡率低于高劑量組、中劑量組及低劑量組，低劑量組宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡率低于高劑量組、中劑量組，中劑量組宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡率低于高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。(2)空白對(duì)照組Caspase-9、Caspase-3水平高于高劑量組、中劑量組及低劑量組，低劑量組Caspase-9、Caspase-3水平低于高劑量組、中劑量組，中劑量組Caspase-9、Caspase-3水平低于高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖3 四組宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡率比較Fig 3 Comparison of the apoptosis rates among four groups of cervical cancer HELA cells

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖4 四組細(xì)胞的Caspase-9、Caspase-3水平比較Fig 4 Comparison of Caspase-9 and Caspase-3 levels among four groups of cells

2.3 丙泊酚高、中及低劑量組與空白對(duì)照組宮頸癌HELA細(xì)胞運(yùn)動(dòng)比較

(1)空白對(duì)照組單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目高于高劑量組、中劑量組及低劑量組，低劑量組單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目高于高劑量組、中劑量組，中劑量組單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目高于高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。(2)空白對(duì)照組細(xì)胞的VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平高于高劑量組、中劑量組及低劑量組，低劑量組細(xì)胞的VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平高于高劑量組、中劑量組，中劑量組細(xì)胞的VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平高于高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖5 四組單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目比較Fig 5 Comparison of the number of invasive cells per unit area among four groups

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖6 四組細(xì)胞的VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較Fig 6 Comparison of the expression levels of VEGF and MMP-9 protein among four groups of cells

2.4 丙泊酚高、中及低劑量組與空白對(duì)照組宮頸癌HELA細(xì)胞Wnt1/β-catenin通路比較

空白對(duì)照組細(xì)胞的Wnt1、β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)水平高于高劑量組、中劑量組及低劑量組，低劑量組細(xì)胞的Wnt1、β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)水平高于高劑量組、中劑量組，中劑量組細(xì)胞的Wnt1、β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)水平高于高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖7 四組宮頸癌HELA細(xì)胞 Wnt1/β-catenin通路蛋白表達(dá)比較Fig 7 Comparison of expressions of Wnt1/β-catenin pathway protein among four groups of cervical cancer HELA cells

2.5 丙泊酚高、中及低劑量組與空白對(duì)照組大鼠體內(nèi)腫瘤情況比較

(1)空白對(duì)照組大鼠腫瘤重量高于高劑量組、中劑量組及低劑量組，低劑量組大鼠腫瘤重量高于高劑量組、中劑量組，中劑量組大鼠腫瘤重量高于高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖8。(2)免疫組化染色顯示，空白對(duì)照組的VEGF和Ki67為淡黃色，代表陽(yáng)性；丙泊酚處理染色顯示，VEGF和Ki67為藍(lán)色，丙泊酚濃度越低，其顯色越輕，見(jiàn)圖9。(3)空白對(duì)照組大鼠VEGF、Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目百分比高于高劑量組、中劑量組及低劑量組，低劑量組大鼠VEGF、Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目百分比高于高劑量組、中劑量組，中劑量組大鼠VEGF、Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目百分比高于高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖10。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖8 四組大鼠腫瘤重量比較Fig 8 Comparison of the tumor weights of rats among four groups of rats

圖9 四組大鼠腫瘤免疫組化染色情況比較Fig 9 Comparison of tumor immunohistochemical staining among four groups rats

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05vs. the blank control group, *P<0.05圖10 四組大鼠VEGF、Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目百分比比較Fig 10 Comparison of the percentage of VEGF and Ki67 positive cells among four groups of rats

3 討論

細(xì)胞增殖分化中，PCNA起著重要作用，細(xì)胞分裂增殖速度隨著其指數(shù)升高而加快，當(dāng)其持續(xù)升高，會(huì)更改細(xì)胞結(jié)構(gòu)機(jī)能和形態(tài)，進(jìn)而提升細(xì)胞增殖能力[6]。Ki67是一種細(xì)胞核內(nèi)蛋白抗原，與細(xì)胞分裂增殖密切相關(guān)，當(dāng)Ki67表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖能力也會(huì)隨之升高[7-8]。有研究結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖與Ki67表達(dá)水平具有相關(guān)性，Ki67可用于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚處理宮頸癌HELA細(xì)胞后，其PCNA和Ki67蛋白表達(dá)明顯降低，丙泊酚濃度越高則降低越明顯。由此可見(jiàn)，丙泊酚可有效抑制、降低PCNA和Ki67蛋白表達(dá)水平，減弱宮頸癌HELA細(xì)胞的增殖能力。

細(xì)胞凋亡的重點(diǎn)是Caspase，該家族的凋亡因子包含Caspase-9和Caspase-3。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凋亡啟動(dòng)因子之一為Caspase-9，Caspase-3主要執(zhí)行凋亡[10-11]。Caspase-3可經(jīng)Caspase-9裂解形成，Caspase底物經(jīng)剪切可產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后引起移植瘤死亡，以發(fā)揮腫瘤細(xì)胞凋亡控制作用[12]。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚處理宮頸癌HELA細(xì)胞后，其Caspase-9和Caspase-3水平提高，可見(jiàn)丙泊酚能夠抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，最終引起細(xì)胞凋亡；此外，丙泊酚濃度越高，Caspase-9和Caspase-3水平越高，說(shuō)明丙泊酚能夠影響宮頸癌HELA細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

MMP是蛋白水解酶之一，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用，與惡性腫瘤細(xì)胞的血管生成、運(yùn)動(dòng)、遷移和浸潤(rùn)具有相關(guān)性[13]。有研究結(jié)果提示，惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的前提是將細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解，并將其基底膜破壞。ECM降解最主要的蛋白酶類(lèi)為MMP-9。激活MMP會(huì)產(chǎn)生MMP-9，對(duì)腫瘤表面進(jìn)行降解和破壞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲周邊組織，引起腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲[14-15]。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚處理宮頸癌HELA細(xì)胞后，其MMP-9表達(dá)水平明顯降低，表明丙泊酚能夠?qū)δ[瘤的遷移與侵襲起到一定的抑制作用。

研究結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化相關(guān)，而抑制腫瘤細(xì)胞增殖可通過(guò)抑制Wnt1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，同時(shí)還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[16-17]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞中的β-catenin和Wnt1表達(dá)水平明顯區(qū)別于健康正常宮頸細(xì)胞，其水平明顯更高，且隨著疾病的進(jìn)展而升高[18-20]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌HELA細(xì)胞經(jīng)丙泊酚處理后，β-catenin、Wnt1以及c-Myc水平降低，說(shuō)明丙泊酚能夠?qū)nt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)行抑制，丙泊酚濃度升高，該信號(hào)通路有關(guān)蛋白表達(dá)水平降低。

綜上所述，丙泊酚能夠抑制宮頸癌HELA細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力，濃度越高則抑制能力越強(qiáng)。該作用機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin通路有關(guān)蛋白表達(dá)、抑制細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)蛋白以及促進(jìn)凋亡因子Caspase-9、Caspase-3表達(dá)有關(guān)。