基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討芍藥甘草湯治療高催乳素血癥的潛在作用機制Δ

時萌萌，蔡華丹，馬 良，周 坤，付永莉，劉 茜，顧洪偉#

(1.武漢市精神衛(wèi)生中心/武漢市心理醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430000； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100039)

服用抗精神病藥的患者中，高催乳素血癥(hyperprolactinemia，HPRL)發(fā)生率高達70%[1]。該病可導(dǎo)致性功能障礙、骨密度降低、月經(jīng)紊亂、乳房發(fā)育和溢乳，以及下丘腦-垂體-性腺軸的抑制，還可能使乳腺癌的發(fā)生率升高。目前，針對藥源性HPRL尚無安全有效的治療方法，中醫(yī)認為肝脾腎三臟功能失調(diào)導(dǎo)致氣血失和為HPRL的基本病機，故中醫(yī)多從腎、肝、脾三臟著手治療[2]。芍藥甘草湯始載于《傷寒論》，方中芍藥味酸、苦、甘，入肝脾二經(jīng)，具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛的功效；甘草味甘、性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有補中益氣、緩急止痛及調(diào)和藥性的功效。研究結(jié)果證實，芍藥甘草湯可治療HPRL，但尚不明確其作用機制[3-4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為新興的技術(shù)方法能對中藥作用于機體后的多成分、多途徑和多靶點進行較為全面地揭示。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析、預(yù)測芍藥甘草湯治療HPRL的活性成分和作用靶點，以期為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)和啟示。

1 資料與方法

1.1 芍藥甘草湯活性成分及作用靶點的獲取

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫中，以白芍、甘草為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為篩選條件進行檢索，檢索出芍藥甘草湯的活性成分。再次利用TCMSP檢索白芍和甘草所有活性成分對應(yīng)的靶點，在Uniprot數(shù)據(jù)庫中獲取靶點對應(yīng)的靶基因，即芍藥甘草湯活性成分作用的靶點。

1.2 HPRL疾病靶點的獲取

以“HPRL”和“Hyperprolactinaemia”為關(guān)鍵詞，分別通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM)數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索并篩選HPRL相關(guān)的靶點。

1.3 藥物-疾病靶點取交集

為明確芍藥甘草湯與HPRL潛在靶點間的相互作用，利用Venny 2.1在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取交集靶點，作為芍藥甘草湯治療HPRL的重要靶點。

1.4 芍藥甘草湯成分-HPRL靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

把得到的交集靶點上傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)置為0.4，去除游離的節(jié)點，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape 3.7.1軟件根據(jù)節(jié)點度值大小篩選核心靶點。

1.5 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用Cytoscape 3.7.1創(chuàng)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，并利用Network Analyzer插件對點度中心性(DC)、中介中心性(BC)和接近中心性(CC)網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)進行分析，判斷核心靶點和主要活性成分。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)中導(dǎo)入藥物與疾病的交集靶點，設(shè)置P<0.01，對主要的生物學(xué)過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)與代謝通路進行富集分析，按Pvalue升序進行排序，利用微生信軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)將通路進行可視化，以柱狀圖和氣泡圖形式繪制結(jié)果。

1.7 芍藥甘草湯活性成分和核心靶點分子對接

從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載芍藥甘草湯活性成分SDF結(jié)構(gòu)，靶蛋白三維結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫下載獲得，使用AutodockTools 1.5.6打開配體小分子和靶蛋白，對其進行加氫、計算電荷、合并非極性氫后，采用Autodock vina 1.1.2進行半柔性對接，分析結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1 芍藥甘草湯活性成分和作用靶點

以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為篩選條件，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到白芍活性成分13種，甘草活性成分92種，重復(fù)成分3種，共102種活性成分。同時，刪除重復(fù)靶點后獲得白芍和甘草活性成分對應(yīng)靶點244個。白芍和甘草部分活性成分基本信息見表1(僅列出其中20項)。

表1 芍藥甘草湯部分活性成分Tab 1 Some active ingredients of Shaoyao Gancao decoction

2.2 HPRL疾病靶點

通過檢索GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫，分別得到113、48個疾病靶點，以O(shè)MIM和DrugBank數(shù)據(jù)庫作為補充，整合并刪除重復(fù)靶點，最終獲取HPRL疾病靶點144個。

2.3 藥物與疾病靶點取交集

在Venny 2.1在線工具中輸入芍藥甘草湯靶點和HPRL相關(guān)靶點繪制韋恩圖，共取得藥物-疾病交集靶點35個，見圖1。

圖1 芍藥甘草湯-HPRL共同靶點韋恩圖Fig 1 Venny diagram of the common targets of Shaoyao Gancao decoction-HPRL

2.4 芍藥甘草湯成分-HPRL靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入韋恩圖獲得的35個交集靶點，得到芍藥甘草湯-HPRL的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共有35個節(jié)點，183條邊，平均節(jié)點度值為10.5，度值排序居前10位的靶點為FOS、雌激素受體1(ESR1)、表皮生長因子(EGF)、受體酪氨酸蛋白激酶2(ERBB2)、G1/S-特異性Cyclin-D1(CCND1)、JUN、孕酮受體(PGR)和白細胞介素(IL)4，上述靶點可能是芍藥甘草湯治療HPRL的關(guān)鍵靶點。

圖2 芍藥甘草湯-HPRL靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network diagram of Shaoyao Gancao decoction-HPRL

2.5 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在Cytoscape 3.7.1軟件上，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖3；圖中，箭頭表示疾病，三角形表示藥物，菱形表示預(yù)測靶點，圓形和六邊形表示活性成分，八邊形表示共有活性成分。利用Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)的拓撲參數(shù)，以大于DC、BC和CC的平均值為標準篩選出ESR1、α1B-腎上腺素受體(ADRA1B)和血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)等核心靶點，槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、芒柄花黃素(formononetin)、甘草查爾酮A(licochalcone a)和柚皮素(naringenin)等關(guān)鍵有效成分，見表2—3。

圖3 芍藥甘草湯-成分-靶點-HPRL網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network diagram of Shaoyao Gancao decoction-ingredient-target-HPRL

表2 芍藥甘草湯治療HPRL核心靶點拓撲參數(shù)Tab 2 Topological parameters of core targets of Shaoyao Gancao decoction in the treatment of HPRL

表3 芍藥甘草湯治療HPRL關(guān)鍵成分拓撲參數(shù)Tab 3 Topological parameters of key ingredients of Shaoyao Gancao decoction in the treatment of HPRL

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過GO富集分析共獲取GO條目112個(P<0.05)，其中BP條目82個，CC條目10個，MF條目20個，根據(jù)P值大小，可視化分析前10條GO條目，見圖4。結(jié)果顯示，芍藥甘草湯主要參與的BP包括藥物反應(yīng)、老化、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、從RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控以及對乙醇的反應(yīng)等；涉及的CC主要包括線粒體外膜、軸突、質(zhì)膜的組成部分、核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等；涉及蛋白質(zhì)異二聚活性、酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體信號蛋白酪氨酸激酶活性等MF。

圖4 GO功能富集分析柱狀圖Fig 4 Histogram of GO enrichment analysis

KEGG富集分析得到信號通路40條(P<0.05)，分為疾病通路24條，包括各類癌癥、肺結(jié)核、肝炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等；其他通路16條，包括FoxO、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1、JAK激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Jak-STAT)、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、催乳素(PRL)信號通路和T細胞受體信號通路等，P值由小到大排序居前25位通路的氣泡圖見圖5。

圖5 KEGG通路富集氣泡圖Fig 5 Enrichment bubble diagram of KEGG pathway

2.7 分子對接結(jié)果

以“2.5”項下篩選出來的11個活性化合物分別與核心靶蛋白進行分子對接驗證，見圖6。對接效能排序居前4位的分別為ADRA1B與shinpterocarpin(MOL004891)、ADRA1B與山柰酚(MOL000422)、ADRA1B與甘草查爾酮A(MOL000497)以及KDR與槲皮素(MOL000098) ，其結(jié)合能分別為-42.7、-41.9、-39.8和-38.5 kJ/mol。上述結(jié)合模式見圖7。

圖6 分子對接效能熱圖Fig 6 Heat map of molecular docking efficiency

圖7 分子對接模式圖Fig 7 Molecular docking mode diagram

3 討論

根據(jù)中醫(yī)古籍中的記載，HPRL可歸屬為“閉經(jīng)”“月經(jīng)后期”“乳泣”“崩漏”“不孕”和“經(jīng)行乳房脹痛”等范疇，中醫(yī)治療主要以疏肝解郁、補腎健脾、化濕祛瘀和回乳通經(jīng)為主。芍藥甘草湯有疏肝解郁、安脾緩急之功，益氣養(yǎng)血、散瘀通經(jīng)之效，近年來多項研究結(jié)果證實芍藥甘草湯具有降低PRL的效用，但發(fā)揮效用的有效成分和作用靶點尚不明確。

本研究共篩選出93種芍藥甘草湯的活性成分，關(guān)鍵活性成分包括槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素、甘草查爾酮A和柚皮素等，上述活性成分可能在芍藥甘草湯治療HPRL的過程中發(fā)揮重要作用，表明芍藥甘草湯是通過多成分、多靶點、多途徑共同發(fā)揮作用的。雌激素可促進腦垂體泌乳細胞的形成，并且刺激其分泌和釋放PRL[5]。植物雌激素作為“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”可以與ESR1結(jié)合，發(fā)揮弱的雌激素樣或抗雌激素樣作用[6-7]。槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素和柚皮素均為植物雌激素，當(dāng)其處于高水平時，可起到抗雌激素的作用，從而降低PRL水平[8-9]。

藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出ESR1、ADRA1B、KDR、FOS、EGF和ERBB2等多個核心靶點，芍藥甘草湯可能通過上述靶點發(fā)揮治療HPRL的作用。下丘腦室旁核(PVN)被認為是PRL調(diào)節(jié)系統(tǒng)的中樞刺激成分，有實驗結(jié)果證明，α1B-腎上腺素能受體亞型(ADRA1B)在PVN水平上調(diào)節(jié)催乳素具有重要作用[10]。體外研究結(jié)果表明，所有的腎上腺素受體拮抗劑對ADRA1B的拮抗作用都會使PRL產(chǎn)生劑量依賴性降低[11]。有研究結(jié)果表明，小鼠乳腺肌上皮和上皮中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的條件性缺失降低了血管密度和功能，嚴重影響乳汁分泌[12]。KDR可以通過共受體神經(jīng)纖毛蛋白增強VEGF的作用[13-14]。證明KDR可能參與了PRL的生成過程。本研究結(jié)合分子對接技術(shù)，進一步驗證了芍藥甘草湯治療HPRL的作用機制，其主要活性成分與核心靶點具有較好的結(jié)合能力。

KEGG分析結(jié)果表明，芍藥甘草湯可能通過調(diào)控FoxO、HIF-1、PRL、Jak-STAT、PI3K-Akt和MAPK等信號通路發(fā)揮治療HPRL的作用。有研究結(jié)果表明，PRL誘導(dǎo)成纖維細胞、白細胞和大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)的表達，nNOS產(chǎn)生的一氧化氮可能是大腦中PRL作用的信使，調(diào)節(jié)PRL和催產(chǎn)素分泌[15]。PRL受體(PRLR)與PRL結(jié)合啟動JAK激酶2-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5(JAK2-STAT5)信號傳導(dǎo)通路[16-17]。高PRL環(huán)境下，PRL/PRLR-JAK2-STAT5信號通路相關(guān)因子表達降低，與該信號通路相關(guān)的激素酶級聯(lián)反應(yīng)降低，抑制性腺軸功能及性激素的產(chǎn)生[18-19]。丁巧燕等[20]的研究結(jié)果表明，回乳抑增方可通過調(diào)控PI3K-Akt-mTOR信號通路，抑制催乳素腺瘤的增長和PRL的過度分泌；Tang等[21]的研究結(jié)果表明，卡麥角林通過抑制AKT-mTOR信號通路誘導(dǎo)催乳素瘤細胞自噬死亡，控制PRL水平；Romano等[22]發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt抑制劑可減弱胰島素樣生長因子刺激的催乳素分泌。結(jié)合本研究結(jié)果可推測，芍藥甘草湯可能通過PI3K-Akt途徑治療HPRL。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對芍藥甘草湯治療HPRL的作用機制進行探討，預(yù)測了芍藥甘草湯治療HPRL的主要成分、作用靶點和信號通路，并以分子對接理論驗證了預(yù)測結(jié)果的合理性。但本研究是基于目前公開的數(shù)據(jù)資料，而數(shù)據(jù)具有實時性，故本研究具有一定的局限性，尚有待基礎(chǔ)和臨床研究的進一步驗證。