基于SSR分析廣東羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群的遺傳結(jié)構(gòu)

何 南，張小麗， 陳 寧， 陳澤檸， 武正軍*

1.珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541006；(2.廣東曲江羅坑鱷蜥省級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，廣東 韶關(guān) 512100；3.廣西珍稀瀕危動(dòng)物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541006)

遺傳多樣性是物種演化的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究物種遺傳多樣性可以評(píng)估物種的生存潛力，尤其對(duì)于瀕危物種而言，遺傳多樣性可作為評(píng)價(jià)物種存活現(xiàn)狀、解釋其瀕危原因的重要指標(biāo)[1-4]。研究認(rèn)為，物種遺傳多樣性受遺傳物質(zhì)變異的影響[3,5]，并且與有效種群數(shù)量的Ne值(物種在每個(gè)世代中能成功繁殖個(gè)體的平均數(shù))成正相關(guān)[6]。當(dāng)Ne值低于100時(shí)，種群遺傳變異容易喪失，造成物種絕滅；當(dāng)Ne值大于1 000時(shí)，才能有效阻止有害等位基因在種群中固定；只有當(dāng)Ne值大于10 000時(shí)，才能保障種群具備適應(yīng)性的遺傳變異，維持物種的長期生存[6-7]。Fang等[8]研究大熊貓Ailuropodamelanoleuca在大種群和小種群之間的遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，較大種群大熊貓比小種群大熊貓具有更高的遺傳多樣性，大種群大熊貓能在自然界中較好生存，而小種群大熊貓則需要通過人為放歸增加種群遺傳多樣性[8]。此外，地理環(huán)境[5]、氣候[9]、外來物種入侵[10]、生境破碎化[11]以及人類活動(dòng)[12]等都會(huì)直接影響物種遺傳多樣性。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，哲羅魚Huchotaimen遺傳多樣性水平較低與環(huán)境惡化、過度捕撈導(dǎo)致的近親繁殖有關(guān)；陳蓉等[14]研究表明，受棲息地喪失和狩獵因素的威脅，野生黃頰長臂猿Nomascusgabriellae數(shù)量減少，遺傳多樣性降低。生境破碎化可能會(huì)造成種內(nèi)近親繁殖，而近親繁殖是影響小種群遺傳多樣性水平的主要原因之一[15]。研究表明，近交會(huì)增加有害等位基因以及隱性有害基因的純合概率，出現(xiàn)生存力下降、繁殖適應(yīng)度降低、死亡率高以及種群遺傳多樣性快速喪失等近交衰退現(xiàn)象[16-19]。例如，周蕓蕓[20]研究發(fā)現(xiàn)，由于棲息地隔離，神農(nóng)架川金絲猴Rhinopithecusroxellana在遺傳多樣性上已經(jīng)可以劃分為3個(gè)保護(hù)管理單元。

目前，在物種遺傳多樣性研究領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)出多種標(biāo)記方法，例如線粒體DNA標(biāo)記[21]、微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記[22]、單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記[23]以及基因測(cè)序[24]等。微衛(wèi)星又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)，是由2～6 bp核苷酸重復(fù)疊加所產(chǎn)生的串聯(lián)重復(fù)序列[25-27]，廣泛存在于真核生物中[28]。該序列具有多態(tài)性[29]、共顯性且易于檢測(cè)等特點(diǎn)[30]。微衛(wèi)星標(biāo)記法可以了解物種的親緣關(guān)系、種群的動(dòng)態(tài)以及遺傳多樣性等信息[31-32]，在非損傷采樣的瀕危動(dòng)物研究中應(yīng)用廣泛[33]。在大熊貓Ailuropodamelanoleuca[34]、小熊貓Ailurusfulgens[35]、川金絲猴Rhinopithecusroxellana[36]等瀕危物種均有使用。

鱷蜥Shinisauruscrocodilurus隸屬鱷蜥科Shinisautidae鱷蜥屬Shinisaurus。由于人類的捕捉和棲息地喪失，鱷蜥數(shù)量急劇下降，屬于我國一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[37]。目前，研究主要集中于鱷蜥的數(shù)量[38]、形態(tài)[39]、病理[40]、腸道微生物[41]等方面，關(guān)于人工飼養(yǎng)鱷蜥遺傳多樣性的研究報(bào)道較少。本研究基于微衛(wèi)星標(biāo)記分析廣東羅坑保護(hù)區(qū)人工飼養(yǎng)鱷蜥群體的遺傳結(jié)構(gòu)，擬闡明當(dāng)前人工繁育鱷蜥的遺傳結(jié)構(gòu)，為鱷蜥圈養(yǎng)群體的復(fù)壯以及野外放歸工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究的112個(gè)鱷蜥個(gè)體均為來自廣東羅坑鱷蜥國家自然保護(hù)區(qū)人工飼養(yǎng)的種群。利用無損傷法采集鱷蜥的唾液樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體過程：取一次性醫(yī)用棉簽伸入鱷蜥口腔內(nèi)部，待棉簽上的棉花黏上足夠的唾液即刻拿出，轉(zhuǎn)移至裝有無水乙醇的離心管內(nèi)，旋上蓋子，置冰箱中-20 ℃保存。

1.2 總DNA提取和微衛(wèi)星擴(kuò)增

使用動(dòng)物唾液DNA提取試劑盒(Qiagen，Germany)提取全基因組DNA。微衛(wèi)星引物獲取以及PCR產(chǎn)物電泳與檢測(cè)參照貝榮丙[42]的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有鱷蜥SSR位點(diǎn)數(shù)據(jù)均采用GENEPOP on the web軟件進(jìn)行分析檢驗(yàn)，用GenALEx6.502軟件分析檢驗(yàn)鱷蜥SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)，用MEGA 7.0軟件基于Nei's遺傳距離對(duì)羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群的112個(gè)個(gè)體構(gòu)建種群鄰接進(jìn)化樹(neighbor-joining tree，N-J)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)

Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)可以檢測(cè)出每個(gè)等位基因和等位基因的基因型出現(xiàn)頻率以及它們?cè)诜N群中是否處于平衡狀態(tài)。對(duì)羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群的9個(gè)SSR基因位點(diǎn)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，結(jié)果顯示所有基因位點(diǎn)的平衡檢驗(yàn)系數(shù)均大于0.05(表1)，表明種群的等位基因及等位基因的基因型出現(xiàn)頻率保持穩(wěn)定。在9個(gè)基因位點(diǎn)中，DC11位點(diǎn)的平衡檢驗(yàn)系數(shù)最低(0.314)，但并未偏離平衡，其余位點(diǎn)在0.775～0.998，平衡系數(shù)較大，表明種群的遺傳穩(wěn)定性較高。

表1 羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)

2.2 遺傳多樣性

分析該飼養(yǎng)群體的遺傳多樣性，結(jié)果見表2。由表可見，羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群在各SSR位點(diǎn)上的等位基因數(shù)(Na)在3～17，均值為10。DC2、DC3這2個(gè)位點(diǎn)的Na值最小，僅有3個(gè)。位點(diǎn)DC9擁有的等位基因數(shù)最多，為17個(gè)。位點(diǎn)DC4、DC12的Na值與均值相等。DC2、DC3、DC7、DC8、DC9、DC11這6個(gè)位點(diǎn)的Na值與均值相差較大，表明這些位點(diǎn)上的等位基因在種群中并非均勻分布。

表2 羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群SSR引物的多態(tài)性

此外，9對(duì)SSR引物的觀測(cè)雜合度(Ho)在0.018～0.929，均值為0.629，其中：位點(diǎn)DC2的Ho值最小(0.018)；位點(diǎn)DC11的Ho值最大(0.929)。9對(duì)SSR引物的期望雜合度(He)范圍為0.018～0.851，均值為0.622，其中：位點(diǎn)DC2的He值最小(0.018)；位點(diǎn)DC12的He值最大(0.851)?？傮w而言，Ho、He兩者的均值較為接近，其中兩者的最小值在位點(diǎn)DC2重合且相等，但最大值并不重合，Ho最大值在位點(diǎn)DC11，He最大值則在位點(diǎn)DC12。

2.3 鄰接進(jìn)化樹(N-J)的構(gòu)建

基于Nei's遺傳距離對(duì)羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群的112個(gè)個(gè)體構(gòu)建N-J樹進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示(圖1)，112個(gè)個(gè)體首先聚成2個(gè)主支系：第一主支系包含3個(gè)小支系；第二主支系包含5個(gè)小支系。在2個(gè)主支系中，第一主支系的個(gè)體數(shù)量明顯少于第二主支系。

圖1 基于Nei's遺傳距離的羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群個(gè)體N-J樹

2.4 瓶頸效應(yīng)

羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群的瓶頸效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果見表3。由表可見，該種群在3種模型中都存在雜合子過剩，并且在TPM和SMM模型中都達(dá)到顯著水平，表明在這2種模型下，羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群存在顯著的瓶頸效應(yīng)。但在IAM模型下，該種群則不存在瓶頸效應(yīng)(P>0.05)。

表3 羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群的瓶頸效應(yīng)檢測(cè)

3 討論

3.1 鱷蜥人工飼養(yǎng)種群遺傳多樣性現(xiàn)狀

等位基因數(shù)在一定程度上可以反映物種某一點(diǎn)遺傳變異在進(jìn)化過程中的累積情況，位點(diǎn)擁有的等位基因數(shù)多，意味著保存了更為豐富的種質(zhì)資源[43]。在羅坑人工飼養(yǎng)鱷蜥種群9個(gè)SSR位點(diǎn)中，平均每個(gè)SSR位點(diǎn)等位基因數(shù)為12個(gè)。其中，單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)最大達(dá)到17個(gè)，最少為3個(gè)?？傮w看來，除了DC2、DC3這2個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)少于9個(gè)，其余7個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)均大于或等于9個(gè)。

Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)以種群間個(gè)體的自由交配為基礎(chǔ)，對(duì)于自然種群，它們具有相對(duì)自由的選擇交配對(duì)象，所以，Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)可以提供關(guān)于自然種群中遺傳變異和進(jìn)化過程的基本信息[44]。但對(duì)于極其瀕危的物種而言，由于可選擇的交配對(duì)象過少而導(dǎo)致近親繁殖，致使羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群基因雜合度不足，從而在Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)不平衡情況[45-46]。對(duì)羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群的9個(gè)SSR基因位點(diǎn)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因位點(diǎn)的平衡檢驗(yàn)系數(shù)均大于0.05，表明在該種群內(nèi)9個(gè)基因位點(diǎn)中各個(gè)等位基因及等位基因的基因型出現(xiàn)頻率遺傳保持穩(wěn)定，即羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群處于平衡狀態(tài)。該鱷蜥種群未出現(xiàn)偏離平衡，可能與羅坑飼養(yǎng)種群的個(gè)體基數(shù)較大，且有時(shí)會(huì)補(bǔ)充野生鱷蜥個(gè)體至飼養(yǎng)種群中有關(guān)。

遺傳雜合度是某個(gè)位點(diǎn)的等位基因雜合度，雜合度越高，表明群體內(nèi)遺傳多樣性系數(shù)越高[47]。羅坑鱷蜥飼養(yǎng)群體的觀測(cè)雜合度(Ho)波動(dòng)范圍為0.018～0.929，均值為0.629。期望雜合度(He)波動(dòng)范圍為0.018～0.851，均值為0.622。與其他珍稀瀕危動(dòng)物的遺傳多樣性相比，例如：窄脊江豚長江口種群N.asiaeorientalis(He為0.733)[48]和川金絲猴Rhinopithecusroxellanae(He為0.626)[49]，羅坑自然保護(hù)區(qū)人工飼養(yǎng)鱷蜥群體的遺傳多樣性水平與其差異不大，遺傳多樣性均貧乏。

3.2 瓶頸效應(yīng)與種質(zhì)資源保護(hù)

當(dāng)一個(gè)種群經(jīng)過了“瓶頸”作用后，原群體異質(zhì)性會(huì)大幅度降低，加上遺傳漂變作用，等位基因頻率的快速變化，甚至?xí)霈F(xiàn)某些基因完全消失以及某些等位基因固定[50]。TPM、SMM模型計(jì)算結(jié)果顯示，羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群出現(xiàn)雜合子過剩，即在近期歷史上該種群經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，但在IAM模型下卻顯示該種群在歷史上并未經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)。相比于其他物種(例如：張楓等[48]研究發(fā)現(xiàn)長江口窄脊江豚東亞亞種N.asiaeorientalis僅Wilcoxon test檢測(cè)的IAM模式下顯示該種群可能經(jīng)歷過瓶頸, 其他檢測(cè)結(jié)果均不支持種群經(jīng)歷了近期的瓶頸效應(yīng)；吳華等[51]對(duì)梅花鹿Cervusnippon研究結(jié)果表明，東北種群、江西種群在3個(gè)突變模型中都表現(xiàn)出顯著的雜合度過剩，浙江種群在IAM模型和TPM模型中表現(xiàn)出顯著的雜合度過剩，四川種群在3個(gè)突變模型中都沒有出現(xiàn)瓶頸效應(yīng))，本研究2種結(jié)果不一致，可能是3種模型的算法不一樣或選取的鱷蜥飼養(yǎng)群體間的個(gè)體差異以及人為干擾所致。多個(gè)研究顯示，微衛(wèi)星數(shù)據(jù)更符合TPM模型，目前已廣泛用于種群數(shù)量瓶頸效應(yīng)的檢測(cè)[52]。因此，從TPM模型顯示結(jié)果來看，羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群在近期歷史上經(jīng)歷了顯著的瓶頸效應(yīng)(P<0.01)，這可能與鱷蜥種群數(shù)十年來因人為捕捉和棲息地快速喪失導(dǎo)致種群數(shù)量急劇下降有關(guān)。

近親繁殖在動(dòng)物種群中較為常見，然而近親繁殖可降低后代存活率與基因多樣性，且同時(shí)可能攜帶大量遺傳疾病，是瀕危物種數(shù)量下降的重要原因之一。以Nei's遺傳距離繪制羅坑鱷蜥飼養(yǎng)種群個(gè)體N-J樹(圖1)，結(jié)果顯示112個(gè)鱷蜥個(gè)體主要聚成2個(gè)主分支，而后分散成若干小支系，各支系內(nèi)個(gè)體親緣關(guān)系接近，第一主支系個(gè)體數(shù)量明顯少于第二主支系個(gè)體數(shù)量。從個(gè)體分支情況來看，2個(gè)主支系內(nèi)的個(gè)體大部分具有較近的親緣關(guān)系，在之后的飼養(yǎng)管理中，建議根據(jù)N-J樹結(jié)果制定專門飼養(yǎng)管理措施，將親緣關(guān)系較近的個(gè)體分開飼養(yǎng)，避免近親繁殖，以維持種群的遺傳多樣性。

4 結(jié)語

本研究利用SSR標(biāo)記法研究羅坑保護(hù)區(qū)鱷蜥飼養(yǎng)種群中112個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，當(dāng)前羅坑保護(hù)區(qū)內(nèi)鱷蜥飼養(yǎng)種群的遺傳多樣性貧乏，且由于經(jīng)歷嚴(yán)重的瓶頸效應(yīng)，導(dǎo)致低頻的等位基因消失。在后續(xù)保護(hù)管理中，應(yīng)注意稀有等位遺傳型個(gè)體的發(fā)現(xiàn)；在人工飼養(yǎng)管理中，應(yīng)注意避免近親繁殖，最大限度保持鱷蜥現(xiàn)存的遺傳多樣性。