不同線栓法復制局灶性腦缺血模型大鼠恢復期學習記憶能力的差異及其機制

繆培，張通，米海霞，張偉東

1.首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院，北京市 101199；2.中國康復研究中心北京博愛醫(yī)院，北京市 100068；3.首都醫(yī)科大學康復醫(yī)學院，北京市 100068；4.國家衛(wèi)生健康委員會保健局，北京市 100044

0 引言

腦卒中是最常見的嚴重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，約88%是缺血性腦卒中。實驗動物模型為研究缺血性腦卒中的病理生理過程提供了重要手段[1]。

大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlu‐sion,MCAO)模型是目前最常用的模擬人類腦梗死的實驗動物模型。制備MCAO模型的方法很多，如光化學法、三氯化鐵法、線栓法、自體血栓法、電流損傷法、自發(fā)性MCAO 等[2]。Zea Longa 線栓法[3]具有不開顱、效果肯定、可準確控制缺血時間等優(yōu)點，是目前應用最廣泛的方法。根據(jù)線栓保留時間，可分為永久性腦缺血模型和腦缺血再灌注模型，分別模擬沒有再灌注的腦梗死和血管再通的腦梗死[4]。探討不同模型大鼠功能預后，對選擇實驗動物模型十分重要。

既往比較不同MCAO大鼠模型間差異的研究主要集中于急性期，觀察指標局限在梗死體積和病理生理方面[5-9]。腦梗死會出現(xiàn)長期感覺運動功能和認知功能障礙，慢性期的研究也非常重要；對實驗性腦梗死動物模型長期預后的研究主要集中于感覺運動和認知功能方面[10]。也有學者探討不同MCAO 模型間恢復期差異，主要集中于行為學方面，且均非線栓法[11-12]。

局灶性腦缺血大鼠存在自發(fā)恢復[13]，探討腦梗死動物模型在自發(fā)恢復過程中的認知功能變化，對評估藥物或康復策略的長期效果很有必要。

彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)利用水分子在不均質(zhì)組織中的擴散具有各向異性特征進行成像，最常用的參數(shù)是各向異性分數(shù)(fractional anisot‐ropy,FA)[14]。

本研究比較永久性缺血和缺血再灌注大鼠模型在自然恢復狀態(tài)下認知功能恢復的差異，并分析DTI 相應感興趣腦區(qū)的FA，為選取理想的局灶性腦缺血大鼠模型進行相關(guān)實驗研究提供參考；同時探討功能恢復與腦結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，為預測腦梗死功能恢復提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley 大鼠21 只，體質(zhì)量250～280 g，SPF 級，飼養(yǎng)于北京友誼醫(yī)院實驗動物部動物屏障實驗室，許可證號SYXK(京)2012-0023。

本研究已經(jīng)首都醫(yī)科大學動物試驗倫理審核(No.AEEI-2014-132)。

1.2 模型制備

將大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=7)、永久性缺血組(n=7)和缺血再灌注組(n=7)。禁食水12 h。

永久性缺血組以10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺上，頸部正中切口，鈍性分離暴露左頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈分岔處，結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈近心端，動脈夾臨時夾閉頸內(nèi)動脈，于頸總動脈遠心端做一切口，插入相應直徑的硅膠頭線栓，使其沿頸總動脈進入頸內(nèi)動脈，到達大腦中動脈起始部，有輕微阻力感時停止，深約1.8～2.0 cm。固定線栓，檢查無出血后縫合切口。每天皮下注射生理鹽水5 mL補液，連續(xù)3 d。

缺血再灌注組基本操作同永久性缺血組，插入線栓后開始計時；固定線栓，縫合頸部皮膚，使栓線尾端暴露于皮膚外；90 min 后再次麻醉大鼠，拆除頸部皮膚縫合線，拔出栓線；縫合頸部皮膚。

假手術(shù)組僅暴露左頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈分岔處后，縫合切口。

手術(shù)過程中保持室溫＞25 ℃。術(shù)后予電熱毯保暖，維持肛溫(37±0.5)℃。予充足的食物和水。

1.3 納入標準

造模后參照Longa 評分標準[3]評分：0 分，無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分，不能伸展對側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3 分，向?qū)?cè)傾倒；4 分，不能自發(fā)行走；5分，意識喪失。1～3分納入實驗。所有大鼠均納入。

1.4 Morris水迷宮

Morris 水迷宮(安徽正華生物儀器設備有限公司)直徑170 cm，高50 cm，水池內(nèi)壁漆為黑色，水溫(23±1)℃。室內(nèi)光照恒定，無光線反射在池內(nèi)。將水池分為四個象限，第一象限正中距離池壁35 cm 處放直徑9 cm、高35 cm 的圓形平臺，平臺頂?shù)陀谒? cm，水池中倒入墨水掩蓋平臺。水迷宮上方攝像機同步記錄大鼠運動軌跡。訓練期間，水迷宮外參照物保持不變。

1.4.1 定位航行實驗

大鼠從術(shù)后16 d 開始，于每天上午8:00～11:00 訓練4 次，共6 d。依次選擇4 個象限作為入水點，將大鼠面向池壁放入水池，同一次訓練所有大鼠入水點相同。如大鼠在水中游泳一段時間后爬上站臺，并在站臺上停留時間超過3 s，認為大鼠找到站臺，系統(tǒng)記錄大鼠在水中游泳時間，為逃避潛伏期。如大鼠90 s 內(nèi)未找到平臺，人為將其引導上平臺，潛伏期記為90 s；大鼠爬上平臺或被引導上平臺后，讓其在平臺上休息10 s。取四次訓練的平均值。第1 天訓練為適應性訓練，不計入統(tǒng)計。

1.4.2 空間探索實驗

訓練第7天(術(shù)后22 d)撤除平臺，將大鼠從第三象限面向池壁放入水中120 s。記錄其第一次到達平臺所在位置時間(潛伏期)，在各象限的游泳路程、時間、速度，以及大鼠在站臺周圍活動路程、時間、游泳路徑。計算平臺象限與邊界游泳路程比和時間比。

1.5 DTI

術(shù)后22 d，各組選Longa 評分相近的4 只大鼠，采用PharmaScan 7.0 T MRI 掃描儀(德國BRUKER BIOSPIN 公司)進行掃描，包括定位圖、T2WI、T2map及DTI。定位圖采用RARE序列，層厚1 mm，掃描層數(shù)8 層，TR 2000 ms，TE 32.2 ms，偏轉(zhuǎn)角180°，視野330×330 mm，矩陣256×256；T2WI 采用RARE 序列，層厚0.7 mm，掃描層數(shù)30 層，TR 5000 ms，TE 36 ms，偏轉(zhuǎn)角180°，視野330×330 mm，矩陣256×256；DTI 采用SE-EPI 序列，彌散敏感梯度為非共線且非共面的30 個梯度方向，b=1000 s/mm2，同時包括5 個b=0 s/mm2的DTI 圖像，層厚0.7 mm，掃描層數(shù)30 層，TR 7500 ms，TE 25 ms，偏轉(zhuǎn)角90°，視野330×330 mm，矩陣256×256，相位編碼方向為從左到右，平均激勵次數(shù)4次。

數(shù)據(jù)由同一實驗人員在工作站采集，選T2WI 顯示缺血灶面積最大的層面，在病灶側(cè)選缺血皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)面積1 mm2的感興趣區(qū)；以冠狀位為軸，在對側(cè)相應位置取相同面積感興趣區(qū)。測定感興趣區(qū)FA，計算病灶側(cè)與對側(cè)比值(rFA)。

選T2WI海馬層面，選取病灶側(cè)海馬區(qū)面積1 mm2感興趣區(qū)，以冠狀位為軸，在對側(cè)相應位置取相同面積感興趣區(qū)。測定感興趣區(qū)FA，計算rFA。

采用Image J 軟件分別劃取大鼠各層面腦梗死區(qū)域，計算腦梗死體積和梗死體積比。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以()表示，若符合正態(tài)分布且方差齊，則采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗；若不符合正態(tài)分布，則采用秩和檢驗；多組重復測量數(shù)據(jù)比較采用重復測量方差分析。大鼠感興趣區(qū)有顯著性差異的DTI參數(shù)與有顯著性差異的認知功能相關(guān)指標行Spearman相關(guān)分析。顯著性水平，秩和檢驗采用校正α=0.017，其余檢驗α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1 定位航行實驗

三組逃避潛伏期均隨訓練時間增加呈下降趨勢，永久性缺血組無顯著性差異(P＞0.05)，但永久性缺血組第3天、第5天時潛伏期小于第1天(P＜0.05)。

組間比較，永久性缺血組各時間點逃避潛伏期均大于假手術(shù)組和缺血再灌注組(P＜0.05)。缺血再灌注組與假手術(shù)組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組定位航行實驗逃避潛伏期比較 單位：s

2.1.2 空間探索實驗

三組平臺象限時間比、距離比無顯著性差異(P＞0.017)；永久性缺血組和缺血再灌注組邊界時間比和距離比大于假手術(shù)組(P＜0.017)，永久性缺血組潛伏期大于假手術(shù)組(P＜0.017)。三組平均速度值無顯著性差異(P＞0.017)。見表2。

2.1.3 游泳路徑

假手術(shù)組和缺血再灌注組探索軌跡趨向性、目的性更強，主要集中于水池內(nèi)部，永久性缺血組路徑集中于周邊。見圖1。

圖1 三組游泳路徑

2.2 DTI

2.2.1 皮質(zhì)

皮質(zhì)左側(cè)(患側(cè))FA 和rFA 由小到大依次為永久性缺血組＜缺血再灌注組＜假手術(shù)組(P＜0.05)。三組間右側(cè)FA無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表3 三組皮質(zhì)感興趣區(qū)FA及rFA值比較

2.2.2 紋狀體

紋狀體左側(cè)FA 由小到大依次為永久性缺血組＜缺血再灌注組＜假手術(shù)組(P＜0.05)。rFA 由小到大依次為永久性缺血組=缺血再灌注組＜假手術(shù)組(P＜0.05)。三組間右側(cè)FA無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

2.2.3 海馬

三組間海馬左側(cè)、右側(cè)FA和rFA均無顯著性差異(P＞0.05)。見表5。

表5 三組海馬感興趣區(qū)FA及rFA值比較

2.2.4 梗死體積

永久性缺血組梗死體積和梗死體積比明顯大于缺血再灌注組(P＜0.01)。見表6。

表6 兩組梗死體積比較

2.3 相關(guān)性分析

逃避潛伏期、邊界時間比和距離比與皮質(zhì)和紋狀體左側(cè)FA、rFA 均相關(guān)(P＜0.05)。水迷宮測試的潛伏期和邊界時間比與梗死體積和梗死體積比均相關(guān)(P＜0.05)。見表7。

表7 DTI參數(shù)與Morris水迷宮相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

Morris 水迷宮是用來評定局灶性腦缺血大鼠空間學習能力和記憶能力的常用方法[15-17]，逃避潛伏期代表動物空間學習能力。本研究顯示，永久性缺血模型和缺血再灌注模型大鼠學習能力均有損傷，缺血再灌注大鼠損傷較輕。

空間探索實驗中，大鼠尋找平臺所在位置的游泳策略是衡量動物分析判斷能力和解決問題能力的指標。正常大鼠隨著訓練次數(shù)增加，游泳軌跡更有趨向性和直線性，目的性較強，而癡呆大鼠可能更趨向于邊緣性和隨機性。本研究顯示，永久性缺血模型大鼠游泳路徑屬典型的邊緣式，提示認知損傷較重。三組大鼠平均速度基本相同，可排除速度對結(jié)果的影響。與Roof等[11]的結(jié)果一致，永久性腦缺血大鼠學習記憶能力損傷持久而嚴重。

DTI 通過改變擴散敏感梯度方向，測量體素內(nèi)水分子在各個方向上的擴散強度[14]，F(xiàn)A指各向異性部分與總擴散張量之比[18]，主要反映腦組織神經(jīng)纖維的多少、排列方向的一致性及纖維束完整性，可用于評價組織結(jié)構(gòu)完整性、病理改變及組織結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系[19],臨床應用最為廣泛。

大鼠MCAO模型造成紋狀體及額頂顳葉、部分枕葉等區(qū)域損傷，丘腦、下丘腦、黑質(zhì)等部位也會出現(xiàn)不同程度損傷[20-21]。腦梗死后，由于梗死區(qū)白質(zhì)和灰質(zhì)結(jié)構(gòu)小梁破壞，急性期和亞急性期FA 減小[22]。慢性期，F(xiàn)A 可能增加，可能與運動和神經(jīng)功能恢復有關(guān)；也可能隨著缺血持續(xù)，血管源性水腫、細胞膜碎裂、細胞壞死，結(jié)構(gòu)小梁破壞，導致FA 持續(xù)降低[23]。本實驗中模型大鼠患側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)FA和rFA均明顯下降，可能反映皮質(zhì)、紋狀體區(qū)細胞結(jié)構(gòu)和髓鞘結(jié)構(gòu)的破壞，神經(jīng)纖維完整性降低；缺血再灌注大鼠患側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)FA、rFA 較永久性缺血大鼠增高，可能與再灌注大鼠早期恢復血流，半暗帶血供改善，細胞壞死減輕有關(guān)[24]。右側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)FA 和rFA均無顯著性差異，提示對側(cè)皮質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)無明顯損傷。

本實驗中，三組大鼠雙側(cè)海馬區(qū)FA、rFA 均無顯著性差異，主要由于海馬的血供主要是由大腦后動脈分支供應，少部分由頸內(nèi)動脈發(fā)出的脈絡膜前動脈供應，因此MCAO 并不會引起海馬缺血改變[25]。有研究顯示[26]，海馬改變可能與腦梗死后，周圍皮質(zhì)形成的擴散性抑制波有關(guān)：擴散性抑制波會引起皮質(zhì)釋放過量谷氨酸，過量的谷氨酸順突觸傳遞到同側(cè)海馬，引起同側(cè)海馬神經(jīng)元興奮性中毒和環(huán)氧化酶2 升高，進而引起海馬炎癥反應和神經(jīng)元凋亡。海馬與學習記憶能力密切相關(guān)[27]。兩種模型大鼠均出現(xiàn)與海馬相關(guān)的學習記憶能力受損，可能與海馬區(qū)炎癥反應和神經(jīng)元凋亡有關(guān)，也可能與皮質(zhì)、紋狀體區(qū)與海馬區(qū)之間的神經(jīng)通路受損有關(guān)[28]。有研究顯示[29]，皮質(zhì)或紋狀體損傷與Morris 水迷宮學習記憶能力受損有關(guān)，與本研究一致。

缺血側(cè)大腦半球距嗅球尖端7～11 mm 矢狀裂至外側(cè)裂下2/3 皮質(zhì)組織僅由大腦中動脈供血，大鼠MCAO 模型時梗死出現(xiàn)早而完全，可代表缺血中心區(qū)；上1/3 皮質(zhì)組織由大腦前動脈和中動脈雙重供血，缺血較輕，表現(xiàn)為半暗帶變化[30]；缺血再灌注后主要恢復半暗帶區(qū)血流，在灌注時間窗內(nèi)恢復血流可減少梗死體積。缺血后恢復再灌注時間越長，梗死體積越大[31]。本研究顯示，缺血再灌注大鼠梗死體積較永久性腦缺血大鼠縮小，與既往研究結(jié)果一致[31-32]。

相關(guān)性分析顯示，學習記憶能力與腦梗死大鼠患側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)FA、rFA 相關(guān)，這與湯翔宇等[33]的研究一致。有學者認為，腦梗死體積與大鼠神經(jīng)功能缺損有一定相關(guān)性，可將梗死體積變化作為評估大鼠預后的指標[24,32]。

綜上所述，永久性腦缺血和缺血再灌注模型大鼠均會出現(xiàn)學習記憶功能障礙，可能與缺血區(qū)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)破壞、缺血區(qū)血管源性水腫，以及皮質(zhì)、紋狀體區(qū)與海馬未缺血區(qū)纖維聯(lián)系斷裂等相關(guān)。嚴重的認知功能障礙只出現(xiàn)在永久性腦缺血大鼠模型中，缺血再灌注大鼠認知功能損傷較輕，可能與缺血皮質(zhì)、紋狀體區(qū)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)更加完整、梗死體積更小有關(guān)?；謴推谀X損傷區(qū)域FA 增加、梗死體積變小，可能為功能恢復良好的有效預測指標。

本研究樣本量偏小，還需進一步研究驗證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。