UPLC-MS/MS檢測長白山白眉蝮蛇蛇毒中的類凝血酶

咸瑞卿 ，王聰聰，鞏麗萍，張迅杰，彭 麗，石 峰*

（1. 山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250101；2. 山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250012；3. 華潤雙鶴利民藥業(yè)（濟南）有限公司 質(zhì)量部，山東 濟南 250200）

蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一種天然蛋白質(zhì)，含多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其他小分子物質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性[1-4]。蛇毒類凝血酶（thrombin-like enzyme，TLE）是蛇毒中與凝血酶作用機制部分相似的一類蛋白水解酶，屬絲氨酸蛋白酶，能水解纖維蛋白原為纖維蛋白，具有體外促凝、體內(nèi)降纖的作用，因其具有重大臨床應(yīng)用價值而被廣泛研究[5-6]。目前國內(nèi)獲批上市的蛇毒類凝血酶藥物有多種，其中注射用白眉蛇毒血凝酶（邦亭）、注射用矛頭蝮蛇血凝酶（巴曲亭）等是臨床廣泛使用的止血藥，占止血藥市場份額近50 %[7-9]。但不同蛇種來源的類凝血酶結(jié)構(gòu)不同，其作用機制不同，相應(yīng)的藥理作用也存在差異[10]，因此明確蛇毒類凝血酶蛇種來源對于該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制，保障臨床用藥的安全有重要作用。

現(xiàn)報道的蛇毒種屬鑒別及其類凝血酶檢測方法主要為酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）[11]、液相色譜法和電泳法等[12]，存在方法繁瑣、專屬性差等問題。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的物種特征肽檢測已逐漸成為食品藥品質(zhì)量控制的重要方法[13-14]。本研究基于長白山白眉蝮蛇類凝血酶特征肽，建立了一種專屬性強、靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），用于檢測長白山白眉蝮蛇的蛇毒種屬來源及類凝血酶含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AB SCIEX Triple Quad 6500+型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；CP225D電子天平（德國Sartorius公司）；Sigma 3-30 K冷凍離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q Advantage A10超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，美國Honeywell公司）；甲酸（色譜純，美國ACS恩科化學(xué)公司）；胰蛋白酶（效價≥10 000 IU/mg）；碘乙酰胺（分析純，美國Sigma公司）；三羥甲基氨基甲烷（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；二硫蘇糖醇（純度：≥99 %，上海翌圣生物科技有限公司）；特征肽（TLCAGVMEGGIDTCNR）對照品（純度：≥98 %，上海強耀生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

長白山白眉蝮蛇蛇毒（編號：S1～S3，錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司）；矛頭蝮蛇蛇毒（編號：S4～S6，蓬萊諾康藥業(yè)有限公司）；長白山白眉蝮蛇類凝血酶（批號：201429，錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μl；流速：0.2 ml/min；流動相A為0.1 %甲酸水溶液，流動相B為0.1 %甲酸乙腈，梯度洗脫，洗脫程序：0→1 min， 流動相B 20 %；1→3 min，流動相B 20 %→60 %；3→6 min，流動相B 60 %。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測；以m/z877.4（雙電荷）→892.4為定量離子對，以m/z877.4（雙電荷）→550.2為定性離子對；離子源溫度：500 ℃；離子化電壓：5.5 kV；碰撞室出口電壓：10 V；入口電壓：10 V；碰撞能量：45 eV，去簇電壓：135 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取特征肽對照品10 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取0.1，0.25，0.5，1，2 ml，分別置100 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取200 μl，加0.2 mol/L二硫蘇糖醇溶液10 μl，混勻，60 ℃反應(yīng)60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氫銨溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶水溶液（臨用新制）10 μl，37 ℃反應(yīng)90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室溫，12 000 r/min離心10 min，取上清作為系列對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取待測樣品20 mg，置10 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解并定容；精密量取200 μl，加0.2 mol/L二硫蘇糖醇溶液10 μl，混勻，60 ℃反應(yīng)60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氫銨溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶溶液（臨用新制）10 μl，37 ℃反應(yīng)90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室溫，12 000 r/min離心10 min，取上清作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密量取25 mmol/L碳酸氫銨溶液200 μl，加0.2 mol/L二硫蘇糖醇溶液10 μl，混勻，60 ℃反應(yīng)60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氫銨溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶溶液（臨用新制）10 μl，37 ℃反應(yīng)90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室溫，12 000 r/min離心10 min，取上清，即得陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液和空白溶液（25 mmol/L碳酸氫銨溶液），按2.1項下色譜質(zhì)譜條件進樣測定，MRM色譜圖見圖1。結(jié)果顯示陰性樣品溶液、空白溶液在對照品溶液出峰位置沒有干擾峰出現(xiàn)，供試品溶液在相應(yīng)保留時間處峰形良好，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性考察MRM圖譜

2.3.2 線性及范圍 按2.2.1項下方法制備終濃度為20，50，100，200，400 ng/ml的系列對照品溶液，按2.1項下色譜質(zhì)譜條件進樣測定。以系列對照品溶液中特征肽的濃度（x，ng/ml）為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，計算得線性回歸方程：y=783.41x-10 329（r=0.9990），在20～400 ng/ml范圍內(nèi)，特征肽的濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗 精密稱取編號S1的蛇毒樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜質(zhì)譜條件測定，連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示保留時間和峰面積的RSD均＜2.6 %，表明該法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密稱取編號S1的蛇毒樣品6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜質(zhì)譜條件測定，結(jié)果顯示，6份樣品的保留時間和峰面積的RSD均＜2.5 %，表明該法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取2.2.2項下供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，16，24 h進樣測定，結(jié)果顯示，各時間點保留時間和峰面積的RSD均＜3 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 檢出限與定量限 取2.2.1項下20 ng/ml對照品溶液，用空白溶液稀釋制備不同濃度的溶液。當(dāng)濃度為2 ng/ml和6 ng/ml時，對應(yīng)的峰高信噪比分別為3.4和11.8，因此檢出限為2 ng/ml，定量限為6 ng/ml。

2.3.7 加標(biāo)回收試驗 精密稱取已知特征肽含量的蛇毒樣品（S1，含量530 ng/kg）19.80 mg，用25 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至10 ml；取9份，每份200 μl，各加入適量特征肽對照品溶液，按2.2.2項下方法制備回收率考察溶液，以m/z877.4（雙電荷）→892.4作為定量離子對，進行檢測。結(jié)果顯示3個水平的回收率均在91.2 %～107.8 %范圍內(nèi)，平均回收率96.2 %，RSD為6.6 %，該方法回收率良好。見表1。

表1 加標(biāo)回收試驗結(jié)果（n=3）

2.4 樣品測定

采用本方法對收集到的6批蛇毒樣品進行測定。結(jié)果顯示在以m/z877.4（雙電荷）→892.4和m/z877.4（雙電荷）→550.2離子對提取的供試品溶液離子流色譜中，S1～S3樣品均呈現(xiàn)與對照特征肽色譜保留時間一致的色譜峰，而S4～S6樣品在對照特征肽色譜保留時間處均未提取到色譜峰。因此，編號為S1～S3的3批蛇毒中均可檢測到特征肽TLCAGVMEGGIDTCNR，確認(rèn)其來源于長白山白眉蝮蛇，而另外3批蛇毒均未檢測到該特征肽，因此為非長白山白眉蝮蛇來源。對于檢測到特征肽的3批樣品，用回歸方程計算供試品溶液特征肽的含量，結(jié)果見表2。由表2可見，特征肽含量為474～530 mg/kg。

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論

特征肽的選擇是采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行蛋白質(zhì)定性定量分析的關(guān)鍵和難點，直接決定了后續(xù)建立方法的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。在前期研究[15]中，采用胰蛋白酶對純化的長白山白眉蝮蛇類凝血酶進行酶解，利用納升液相-高分辨質(zhì)譜（Nano LC-HRMS）和Proteome Discoverer軟件分別進行多肽的檢測和鑒定，通過BLAST搜索與Uniprot數(shù)據(jù)庫對比分析，篩選了具有種屬特異性的長白山白眉蝮蛇類凝血酶特征肽段TLCAGVMEGGIDTCNR。

本研究基于具有種屬特異性的白眉蝮蛇類凝血酶特征肽，建立了UPLC-MS/MS檢測白眉蝮蛇蛇毒種屬來源及類凝血酶含量的方法。該方法專屬性強、靈敏高、準(zhǔn)確可靠，可進一步推廣應(yīng)用于長白山白眉毒蛇血凝酶藥物原料、中間體及其制劑中活性蛋白的檢測，對于優(yōu)選蛇毒原料、優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品安全性具有重要意義。