生長激素釋放激素受體拮抗劑對翼狀胬肉上皮細胞生長的影響及機制△

何倍婷 林宏亮 王 盛 覃泳杰 張洪洋

翼狀胬肉作為一種常見的良性增生性眼表疾病，常表現(xiàn)為鼻側(cè)結(jié)膜和纖維血管組織呈三角形增生，當過度生長時會引起嚴重的角膜散光，甚至直接侵犯瞳孔區(qū)導致視力障礙。翼狀胬肉患病率高，但成因尚不明確，其治療方法以手術(shù)切除為主，只是術(shù)后復發(fā)率高。因此，研究翼狀胬肉的發(fā)病機制，探索可能有效的藥物治療方法，對翼狀胬肉的防治具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉發(fā)病早期近角膜緣上皮細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，MMPs 具有溶解角膜前彈力層的作用，致使翼狀胬肉上皮細胞(PECs)向角膜移行和侵蝕[1-2]。因此，如何抑制PECs的增殖，促使其凋亡，是治療翼狀胬肉的關(guān)鍵。我們早期研究發(fā)現(xiàn)，生長激素釋放激素受體(GHRH-R)在翼狀胬肉上皮組織中異常高表達，提示GHRH-R是PECs增殖和侵襲的潛在重要因素[1-2]。本研究通過使用GHRH-R拮抗劑MIA602進一步探索GHRH-R對翼狀胬肉生長的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco,美國)，MIA602(AVS實驗室提供，美國)，單克隆抗體GHRH-R(ab76263)、Caspase-3(ab32042)、p-ERK1/2(ab201015)(Abcam,美國)，內(nèi)參GAPDH(#8884,CST,美國)，F(xiàn)ITC標記IgG熒光二抗(Cambridge,美國)，DAPI染料(含封片劑)(Sigma,美國)。熒光倒置顯微鏡(蔡司，德國)，直流穩(wěn)壓電泳儀(Bio-Rad,美國)。

1.1.2 樣本取材結(jié)膜下人Tenon囊組織取自2019年7月至2021年6月于廣東省人民醫(yī)院眼科行翼狀胬肉切除手術(shù)的24例原發(fā)性翼狀胬肉患者(男10例，女14例)，所有患者術(shù)前均由專業(yè)眼科醫(yī)生進行檢查，參照文獻[3]，根據(jù)翼狀胬肉組織的透明度(T1～T3級)和血管化程度(V1～V3級)將翼狀胬肉分為靜止期翼狀胬肉(8例)和活動期翼狀胬肉(16例)。正常結(jié)膜組的結(jié)膜組織取自于6例結(jié)膜松弛癥患者的術(shù)中。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則，已通過廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準(編號：2019-406H-01)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織體外培養(yǎng)、干預及分組術(shù)中獲取翼狀胬肉頭部組織和正常結(jié)膜組織，PBS反復沖洗，剪除上皮下結(jié)締組織，將整塊上皮組織鋪于60 mm培養(yǎng)皿，等待30 min，待組織塊貼牢后加入完全培養(yǎng)基(DEME/F12培養(yǎng)液，含100 U·mL-1雙抗和體積分數(shù)10%澳洲胎牛血清)，培養(yǎng)第3天時隨機選取8例活動期翼狀胬肉組織使用含10 μmol·L-1MIA602的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)翼狀胬肉類型和培養(yǎng)條件分為正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組、活動期翼狀胬肉組和MIA602干預組。各組培養(yǎng)皿均置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天于鏡下觀察翼狀胬肉上皮細胞和結(jié)膜上皮細胞的生長情況，并記錄細胞從組織塊邊緣起的最遠生長距離。培養(yǎng)第5天收集組織塊及細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 免疫印跡實驗檢測相關(guān)蛋白的表達培養(yǎng)第5天收集組織塊及細胞，冷PBS清洗，加入RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)，BCA法進行定量并配平各組蛋白濃度，振蕩混勻，98 ℃蛋白變性8 min。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電泳、電轉(zhuǎn)后，蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉1 h，分別使用GHRH-R(11000)、p-ERK1/2(11000)、Caspase-3(12000)和內(nèi)參GAPDH(11000)一抗孵育，4 ℃過夜。第2天，4 ℃二抗孵育2 h，使用ECL系統(tǒng)顯色，所得條帶采用ImageJ軟件進行灰度定量，計算蛋白相對GAPDH的表達水平。

1.2.3 免疫熒光染色檢測相關(guān)蛋白的表達培養(yǎng)第5天時取出培養(yǎng)皿，輕輕夾去組織塊并吸除舊培養(yǎng)液，PBS清洗，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，體積分數(shù)0.2% Triton X-100穿透5 min，體積分數(shù)5%山羊血清封閉20～30 min，滴加一抗GHRH-R(11000)、p-ERK1/2(11000)、Caspase-3(12000)，4 ℃過夜。PBS浸洗后，滴加熒光二抗(1500)，常溫下孵育1 h，DAPI染核，封閉，干燥，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 一般情況靜止期翼狀胬肉組織較薄，裂隙燈下可清晰見到體部覆蓋的鞏膜外層血管，輕度的血管化，向角膜侵襲進展緩慢；活動期翼狀胬肉組織較厚，裂隙燈下難以觀察到體部覆蓋的鞏膜血管，且血管化嚴重，可見充盈的大血管爬行，向角膜侵襲進展較快。正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組和活動期翼狀胬肉組患者間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 各組翼狀胬肉分級標準及患者一般資料

2.2 各組上皮細胞的增殖情況組織貼壁培養(yǎng)第2天，可見柱狀上皮樣細胞從組織塊邊緣爬出，密集排列，并隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，逐漸向外生長移行。每天測量細胞至組織塊邊緣的最大距離，并進行比較。結(jié)果顯示，培養(yǎng)第5天，各組間上皮細胞最大生長距離的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但正常結(jié)膜組和靜止期翼狀胬肉組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組比較，活動期翼狀胬肉組PECs最大生長距離顯著增大，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 光鏡下培養(yǎng)第5天各組上皮細胞最大生長距離(箭頭示最遠生長處)

表2 各組上皮細胞最大生長距離的比較

2.3 各組上皮組織中GHRH-R、p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相對表達情況免疫印跡實驗檢測結(jié)果顯示，正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組和活動期翼狀胬肉組上皮組織中GHRH-R、p-EKR1/2和Caspase-3蛋白相對表達量多組間比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。與正常結(jié)膜組和靜止期翼狀胬肉組比較，活動期翼狀胬肉組上皮組織中GHRH-R、p-ERK1/2蛋白相對表達量均顯著升高，Caspase-3蛋白相對表達量則明顯減少(均為P<0.05)。靜止期翼狀胬肉組與正常結(jié)膜組相比，雖然GHRH-R蛋白相對表達量較高(P<0.05)，但是p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相對表達量兩組間差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(圖2)。

圖2 免疫印跡實驗檢測各組上皮組織中GHRH-R、Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表達情況 與正常結(jié)膜組相比，aP<0.05；與靜止期翼狀胬肉組相比，bP<0.05。

2.4 阻斷GHRH-R后各組p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相對表達情況培養(yǎng)第5天鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，MIA602干預組PECs的增殖和移行速度明顯趨于停滯，而未干預的活動期翼狀胬肉組PECs則表現(xiàn)為繼續(xù)快速向外生長延伸(圖3)。 取兩組PECs做免疫熒光染色，結(jié)果顯示，與活動期翼狀胬肉組相比，MIA602干預組細胞內(nèi)p-ERK1/2綠色熒光亮度減弱，陽性細胞數(shù)量顯著減少，而Caspase-3紅色熒光亮度增強，陽性細胞數(shù)量明顯增加(圖3)。免疫印跡實驗結(jié)果同樣顯示，與活動期翼狀胬肉組比較，MIA602干預組中GHRH-R和p-ERK1/2蛋白相對表達量明顯減少，而Caspase-3蛋白相對表達量顯著增加(均為P<0.05)(圖4)。上述結(jié)果表明，阻斷GHRH-R能夠有效降低p-ERK1/2的表達并促進Caspase-3表達，從而抑制PECs的增殖和遷移。

圖3 免疫熒光染色觀察MIA602干預后Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表達情況

圖4 免疫印跡實驗檢測活動期翼狀胬肉組和MIA602干預組中GHRH-R、Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表達情況 與活動期翼狀胬肉組相比，aP<0.05。

3 討論

翼狀胬肉的發(fā)生與進展被認為與環(huán)境變化密切相關(guān)，尤其是紫外線、干燥、粉塵等因素[4]。不利的環(huán)境因素會持續(xù)刺激眼表分泌各類炎癥因子，如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、腫瘤生長因子-β1和血管內(nèi)皮生長因子等，持續(xù)的炎癥反應(yīng)破壞了角膜緣干細胞，導致結(jié)膜上皮細胞向角膜侵蝕，形成翼狀胬肉[5-6]。關(guān)于翼狀胬肉的嚴重程度，傳統(tǒng)的文獻多根據(jù)翼狀胬肉體部的厚度或透明度來分期，雖然可以直觀反映翼狀胬肉的大小及纖維化程度，但是卻很難反映翼狀胬肉的侵襲性。因此，臨床上結(jié)合血管化程度，將原發(fā)性翼狀胬肉分為靜止期和活動期，更充分地體現(xiàn)翼狀胬肉的增殖和侵襲速度[3]。本研究結(jié)果顯示，相較于靜止期，典型的活動期翼狀胬肉多表現(xiàn)為頭部突起，頸部寬大，角膜侵蝕較深，表面血管明顯充盈等。在組織培養(yǎng)中也顯示，活動期翼狀胬肉組中PECs的增殖和遷移速度顯著快于靜止期翼狀胬肉組，而靜止期翼狀胬肉組中PECs的增殖和遷移速度則與正常結(jié)膜無明顯差別。這說明早期治療時將翼狀胬肉控制在靜止期是避免患者視力損害和手術(shù)治療的重要方式。

炎癥反應(yīng)在翼狀胬肉的發(fā)病機制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥環(huán)境下，PECs能夠激發(fā)出類似干細胞的特性，并分泌MMPs和MMPs抑制劑，分解細胞外基質(zhì)，促使細胞增殖和遷移。但是MMPs及其抑制劑很少表達于翼狀胬肉成纖維細胞或正常結(jié)膜上皮細胞[7]。因此，尋找PECs接受炎癥信號的媒介，抑制炎癥反應(yīng)對PECs的持續(xù)激活，是治療翼狀胬肉的重要途徑。本課題組早期研究從14例翼狀胬肉患者的翼狀胬肉上皮組織中檢測到高表達的GHRH-R蛋白[8]。GHRH-R被認為是調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的重要受體，尤其是關(guān)于腫瘤細胞的研究[9]。為了進一步確認GHRH-R在翼狀胬肉進展中的作用及機制，本研究將翼狀胬肉分期后進行實驗，結(jié)果顯示，與正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組比較，活動期翼狀胬肉組中GHRH-R和p-ERK1/2蛋白表達水平均升高，Caspase-3蛋白表達水平降低。靜止期翼狀胬肉組GHRH-R蛋白表達雖然也有一定程度的增加，但p-ERK1/2和Caspase-3蛋白的表達與正常結(jié)膜組無明顯差別。這提示活動期翼狀胬肉GHRH-R蛋白顯著高表達，促使PECs增殖，同時抑制其凋亡，從而使翼狀胬肉具有更強的生長和侵襲能力。

GHRH-R蛋白在生物體內(nèi)可以調(diào)控胰島β細胞的存活[9]，以及促進心臟保護[10]和傷口愈合[11]，該作用與GHRH相關(guān)激酶的激活有關(guān)，包括MAPKs、ERK1/2和Caspase-3[12]。ERK1/2是MAPK通路的關(guān)鍵組成部分，ERK1/2磷酸化后進入細胞核，激活下游轉(zhuǎn)錄因子和細胞核激酶，調(diào)控基因進入復制周期，促使細胞增殖[13-14]。Caspase-3則是細胞殺傷機制中的重要組成部分，通過剪切DNA參與細胞凋亡的誘導[14-15]。為了確認GHRH-R是否通過介導ERK1/2和Caspase-3影響PECs，本研究使用GHRH-R拮抗劑MIA602干預活動期翼狀胬肉，結(jié)果顯示，GHRH-R蛋白被MIA602阻斷后，p-ERK1/2的表達明顯下降，而Caspase-3的表達則顯著增加，PECs的增殖速度明顯減緩，并且出現(xiàn)細胞凋亡。因此，阻斷GHRH-R可有效地抑制ERK1/2活化和促進Caspase-3表達，從而抑制活動期翼狀胬肉PECs的生存和增殖。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，GHRH-R在翼狀胬肉的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是在活動期翼狀胬肉，其機制可能是GHRH-R通過激活ERK1/2和抑制Caspase-3表達促使PECs的生存和增殖，阻斷GHRH-R可有效地調(diào)控PECs的增殖和凋亡，從而抑制翼狀胬肉生長。本實驗的結(jié)果可為臨床翼狀胬肉的早期預防和治療提供新的研究方向和治療靶點。

致謝：感謝香港中文大學彭智培教授和朱偉杰教授對本研究提供的針對性意見和修正。