染色體微陣列分析在脈絡(luò)叢囊腫胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用*

王森林，王朝紅，李景然，孫玉秀，龐宇，朱健生，蔡昭方（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省婦幼保健院 .醫(yī)學(xué)遺傳中心，.婦產(chǎn)科，合肥 230000）

脈絡(luò)叢囊腫（choroid plexus cysts，CPC）是指位于胎兒顱內(nèi)一側(cè)或雙側(cè)脈絡(luò)叢內(nèi)充滿腦脊液的假性囊腫，是孕中期產(chǎn)前超聲檢查常見(jiàn)的軟指標(biāo)之一。研究證實(shí)，胎兒CPC 與染色體異常存在相關(guān)性，會(huì)導(dǎo)致不良的妊娠結(jié)局［1］。目前，傳統(tǒng)的染色體顯帶核型分析是診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，可檢測(cè)非整倍體、結(jié)構(gòu)重排和片段較大的染色體畸變，但其分辨率較低，不能檢測(cè)出＜5 Mb的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）［2］。染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）是一種高分辨率、高通量的全基因組篩查技術(shù)，主要用于檢測(cè)染色體微缺失和微重復(fù)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)到基因組拷貝數(shù)的不平衡變異［3］。因此，本研究擬采用CMA技術(shù)和染色體核型分析技術(shù)對(duì)187例羊水樣本進(jìn)行分析，旨在探討CMA 技術(shù)在CPC胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值，以期為產(chǎn)前遺傳咨詢及胎兒預(yù)后評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2017年4月至2020年11月在安徽省婦幼保健院經(jīng)超聲診斷為胎兒CPC 的孕婦187例。年齡為19～44歲，中位年齡29歲，平均孕周（20.23±1.26）周。納入標(biāo)準(zhǔn)［4］：?jiǎn)位钐?，孕中期超聲胎兒脈絡(luò)叢內(nèi)出現(xiàn)直徑≥2 mm、邊界清晰的無(wú)回聲區(qū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：多胎妊娠，孕婦感染急性期。本研究經(jīng)安徽省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批準(zhǔn)文號(hào)：2016（09）］，在檢測(cè)前告知 CMA 和核型分析的優(yōu)勢(shì)和局限性，患者或家屬知情同意且自愿選擇后，同時(shí)進(jìn)行羊水細(xì)胞核型分析和染色體微陣列分析。根據(jù)不同指標(biāo)，將187例CPC胎兒分為3組：孤立性CPC 胎兒157 例，CPC 合并超聲軟指標(biāo)18例和CPC合并超聲結(jié)構(gòu)異常12例。

1.2 試劑與儀器 原位載玻片培養(yǎng)盒（杭州寶榮公司），羊水細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco 公司），DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國(guó)Qiagen公司），全基因組擴(kuò)增試劑盒、Illumina Infinium HD assay 試劑盒（美國(guó)Illumina 公司）。染色體分散儀（美國(guó) Thermotron 公司），GLS-120 全自動(dòng)染色體核型掃描捕獲系統(tǒng)（德國(guó)Leica 公司），雜交爐、洗滌工作站、芯片掃描儀（美國(guó)Affymetrix 公司），Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本的采集 孕婦于妊娠 18 ～ 26 周，由產(chǎn)前診斷中心在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取孕婦胎兒羊水34 mL。其中24 mL經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行傳統(tǒng)染色體G顯帶核型分析，10 mL用于CMA檢測(cè)。

1.3.2 核型分析 取上述 24 mL 羊水，經(jīng) 258×g 室溫離心10 min，棄上清，保留0.5 mL細(xì)胞懸液，加1 mL羊水培養(yǎng)基至離心管內(nèi)，混勻后吸取懸液接種至原位培養(yǎng)盒，移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)40～48 h，再加入3 mL 新鮮羊水培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，從培養(yǎng)盒一側(cè)輕吸培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。原培養(yǎng)盒中加入5 mL羊水培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d 后，加入20 μg／mL 秋水仙素 0.1 mL，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)30 min，棄上清，低滲處理（加入5 mL 預(yù)熱的10 g／L檸檬酸鈉，37 ℃恒溫靜置30 min），預(yù)固定（加入5 mL 5%冰醋酸，室溫靜置7 min），漂洗（加入5 mL 固定液），固定（加入5 mL 固定液，室溫靜置20 min），取出玻片至吸水紙上瀝去多余的固定液，放入分散儀中晾干，再放入鼓風(fēng)干燥箱中2 h，1.5 g／L 胰蛋白酶消化 14 ～18 s，生理鹽水清洗后，Giemsa染色，沖洗晾干后，采用GSL-120自動(dòng)掃描儀捕獲羊水核型。使用Cytovision核型分析軟件（德國(guó)Leica公司）計(jì)數(shù)20個(gè)中期細(xì)胞核型，并分析5個(gè)核型，如有異常核型，增加計(jì)數(shù)量。核型結(jié)果按照國(guó)際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名系統(tǒng)（ISCN 2016）進(jìn)行描述［5］。

1.3.3 樣本 DNA 提取 取各孕婦羊水 10 mL，置于離心管中，580×g 離心10 min，棄上清液。按照QIAamp DNA Blood Mini Kit 說(shuō)明書提取基因組DNA，Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，取吸光度（A260nm／A280nm）值為 1.8 ～ 2.0 的樣本，置－20 ℃保存。

1.3.4 CMA 檢測(cè) 按照美國(guó) Affymetrix 公司提供的CytoScanTM750k 芯片的標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)孕婦羊水細(xì)胞DNA 進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)用Affymetrix Chromosome Analysis Suite（ChAS）2.0 軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。通過(guò)檢索 DGV （http：／ ／dgv.tcag.ca／），DECIPHER（https：／ ／decipher.sanger.ac.uk ／），ISCA（http：／ ／dbsearch.clinicalgenome.org／search／），Clin-Gen（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／projects／dbvar／clingen／），ClinVar（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／clinvar／），OMIM（https：／ ／omim.org／），PubMed （https：／ ／pubmed.ncbi.nlm.nih.gov／）等公共數(shù)據(jù)庫(kù)，綜合所得報(bào)道信息判讀CNVs 的臨床意義。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)指南［6］，將CNVs分為三大類 5 級(jí)：（1）致病性 CNVs（pathogenic CNVs，pCNVs）；（2）良性 CNVs（benign CNVs）；（3）臨床意義不明 CNVs（variants of unknown significance CNVs，VOUS CNVs）；（4）可能致病性 CNVs（likely pathogenic CNVs）；（5）可能良性 CNVs（likely benign CNVs）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，率的比較采用 χ2檢驗(yàn)，以 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 187 例CPC 胎兒常規(guī)染色體核型分析結(jié)果傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)檢出染色體異常12 例，檢出率為 6.42%（12／187），其中 18－三體 9 例、21－三體2例和性染色體異常 1 例（47，XXX）。見(jiàn)表1。

表1 12例CPC胎兒的異常核型分析結(jié)果

2.2 187 例 CPC 胎兒 CMA 結(jié)果 在 187 例 CPC胎兒中，CMA技術(shù)檢出的12 例染色體非整倍體異常與傳統(tǒng)核型分析結(jié)果一致。此外，CMA 技術(shù)還檢出異常CNVs 16例，額外的檢出率為8.56%（16／187）。16 例異常 CNVs 中，致病性 CNVs 5 例，VOUS CNVs 11 例。5 例致病性 CNVs 中，2 例1q21.1q21.2 區(qū)域存在片段缺失，大小分別為 1.80 Mb 和 1.89 Mb，1 例 17q12 區(qū)域存在 1.46 Mb 缺失，2 例 Xp22.31 區(qū)域存在 1.68 Mb 缺失。8 例 VOUS CNVs中，1例18p11.32區(qū)域存在512 Kb重復(fù)，1例2p15p14 區(qū)域存在 1.62 Mb 重復(fù)，1 例 7q31.32 區(qū)域存在 245 Kb 缺失，1 例 6q26 區(qū)域存在 1.21 Mb 重復(fù)，1 例 5q11.2 區(qū)域存在 514 Kb 重復(fù)，1 例 Xq26.1區(qū)域存在701 Kb重復(fù)，1例15q13.1q13.2區(qū)域存在1.40 Mb 重復(fù)，1 例 11q14.3 區(qū)域存在 1.23 Mb 重復(fù)，1 例2q13 區(qū)域存在1.71 Mb 重復(fù)，1例Xp22.31區(qū)域存在 1.38 Mb 重復(fù)，1 例 13q12.12 區(qū)域存在1.68 Mb重復(fù)。見(jiàn)表 2。

表2 16例核型正常CPC胎兒的異常CMA結(jié)果

2.3 不同類型CPC胎兒染色體異常的比較 孤立性CPC胎兒組157例，pCNVs 檢出8 例，檢出率為5.10%（8／157）；CPC 合并超聲軟指標(biāo)異常胎兒組18 例，pCNVs檢出 2 例，檢出率為 11.11%（2／18）；CPC合并超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒12 例，pCNVs 檢出7例，檢出率為 58.33%（7／12）。3 組檢出率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝38.33，P ＝0.000）。

3 討論

胎兒CPC 是妊娠中期重要的超聲軟指標(biāo)之一，約有1%～2%的胎兒會(huì)檢出CPC［7］。產(chǎn)前超聲檢查胎兒出現(xiàn)CPC 時(shí)，常提示其存在染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)較高，尤其是18－三體［8］。目前染色體核型分析作為常用的產(chǎn)前診斷技術(shù)，僅能檢出較大片段的染色體結(jié)構(gòu)異常，無(wú)法為臨床產(chǎn)前咨詢和胎兒預(yù)后評(píng)估提供更全面更詳細(xì)的信息。

本研究中187例CPC胎兒CMA共檢出pCNVs 17 例，檢出率為 9.09%，與 Cai 等［9］報(bào)道的10.95%接近；與齊艷等［1］報(bào)道的3.62%存在一定的差異，這種情況不排除由樣本量不同而引起的偏差或與CPC胎兒合并其他超聲異常有關(guān)。由此可見(jiàn)，除了染色體核型異常外，pCNVs 也是CPC 胎兒常見(jiàn)的染色體異常。2 例為 1q21.1q21.2 區(qū)域存在微缺失，均涉及 1q21.1 缺失綜合征（1q21.1 deletion syndrome），主要表型包括智力低下、小頭畸形、先天性心臟異常等［10］，1 例為 17q12 區(qū)域存在微缺失，涉及腎囊腫與糖尿病綜合征（renal cysts and diabetes）綜合征，主要表型包括泌尿生殖系統(tǒng)異常（特別是腎囊腫、腎小球囊性腎病和腎發(fā)育不良）、糖尿病、自閉癥、神經(jīng)認(rèn)知障礙和精神分裂癥等［11］；2 例為Xp22.31 區(qū)域存在 1.68 Mb 缺失，該區(qū)域中 STS（300747）基因的缺失與X連鎖隱性遺傳的魚鱗?。╮ecessive X-linked ichthyosis）有關(guān)，主要表現(xiàn)為皮膚干燥、脫屑為主的角化障礙性皮膚病［12］。這5例pCNVs表現(xiàn)出CPC，豐富了這些病例的臨床表型。另外，17例pCNVs中有12例為染色體非整倍體異常，其中最常見(jiàn)的是18－三體，共有9例。孤立性CPC胎兒中出現(xiàn)2例18－三體，提示孤立性CPC胎兒發(fā)生18－三體的風(fēng)險(xiǎn)較高。CPC 胎兒出現(xiàn)2例21－三體和1例性染色體異常（47，XXX）。根據(jù)Bromley 等［13］的研究，21－三體胎兒也會(huì)出現(xiàn) CPC，但其出現(xiàn)的頻率與一般人群相近，即胎兒出現(xiàn)CPC不會(huì)增加21－三體的風(fēng)險(xiǎn)。目前沒(méi)有相關(guān)研究顯示胎兒CPC 與性染色體異常有相關(guān)性，本研究中出現(xiàn)的1例性染色體異常為偶發(fā)。

研究表明，VOUS CNVs 在所有檢出病例中占比約為4%［14］。本研究中 CMA 檢出 VOUS CNVs 11例，檢出率為5.88%，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果接近。11例VOUS CNVs中，對(duì)病例18 ～26進(jìn)行來(lái)源驗(yàn)證可知，其CNVs均來(lái)源其父母一方。病例27和28未進(jìn)行來(lái)源驗(yàn)證，經(jīng)隨訪嬰兒未見(jiàn)明顯表型異常。目前對(duì)人類基因組的研究和數(shù)據(jù)庫(kù)的積累，仍然無(wú)法對(duì)所有CNVs的臨床性質(zhì)進(jìn)行確切的判讀。因此，對(duì)VOUS病例應(yīng)進(jìn)行更詳盡的遺傳咨詢，必要時(shí)對(duì)胎兒父母進(jìn)行CMA 來(lái)源驗(yàn)證，防止孕婦產(chǎn)生心理負(fù)擔(dān)和造成不必要的引產(chǎn)。

本研究中12例CPC 胎兒的CMA 結(jié)果與常規(guī)核型分析結(jié)果一致，CMA 技術(shù)較核型分析技術(shù)額外檢出16例異常CNVs，額外檢出率為8.56%。因此，CMA技術(shù)在檢測(cè)CPC 胎兒染色體異常方面更為敏感，是對(duì)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)的有益和必要補(bǔ)充。合并超聲結(jié)構(gòu)異常的CPC胎兒pCNVs檢出率最高（58.33%），其次為孤立性 CPC 胎兒和合并超聲軟指標(biāo)異常CPC胎兒，分別為5.10%和11.11%，3組之間比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，CMA技術(shù)對(duì)于CPC 合并超聲結(jié)構(gòu)異常的胎兒是值得推薦的。然而由于本研究樣本較少，僅額外檢測(cè)出5個(gè)pCNVs。今后筆者將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，CMA 技術(shù)對(duì)CPC 胎兒染色體異常具有更高的敏感性，可作為傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)的補(bǔ)充，提高對(duì)CPC 胎兒異常CNVs 的檢出率，為臨床醫(yī)生進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢和胎兒預(yù)后評(píng)估提供更詳細(xì)和更全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。