10 313例新生兒聽(tīng)力與耳聾易感基因聯(lián)合篩查結(jié)果分析*

李茜，王諾揚(yáng)，童鳴，陳燦明，曹偉，胡蘇瑋，劉琍（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院揚(yáng)州市婦幼保健院 .醫(yī)學(xué)遺傳中心，.五官科，江蘇揚(yáng)州 225002）

聽(tīng)力障礙是我國(guó)常見(jiàn)的出生缺陷疾病之一，嚴(yán)重影響患兒的語(yǔ)言及認(rèn)知發(fā)育。據(jù)統(tǒng)計(jì)，聽(tīng)力障礙發(fā)病率約為1‰～3‰［1］，其中約50%～60%病因與遺傳因素密切相關(guān)［2］。隨著新生兒聽(tīng)力篩查在臨床上的廣泛開(kāi)展，越來(lái)越多先天性耳聾的患兒得到了及時(shí)的診斷與干預(yù)。但與此同時(shí)，筆者也發(fā)現(xiàn)，新生兒聽(tīng)力篩查難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致可能患有遲發(fā)性聽(tīng)力損失的新生兒及攜帶藥物致聾敏感基因的新生兒。因此，對(duì)新生兒進(jìn)行聽(tīng)力和耳聾易感基因聯(lián)合檢測(cè)可以彌補(bǔ)新生兒聽(tīng)力篩查的不足，同時(shí)降低先天性耳聾的漏檢率。本研究對(duì)揚(yáng)州地區(qū)10 313例新生兒進(jìn)行聽(tīng)力與耳聾易感基因聯(lián)合篩查，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年3月至2020年12月在揚(yáng)州市婦幼保健院出生并接受聽(tīng)力與耳聾易感基因聯(lián)合篩查的活產(chǎn)新生兒共計(jì)10 313例，其中男嬰5 384例，女嬰4 929 例，于出生后72 h 進(jìn)行研究。本研究通過(guò)揚(yáng)州市婦幼保健院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（No.2020019），所有受檢新生兒的家長(zhǎng)均被詳細(xì)告知聽(tīng)力篩查及耳聾易感基因檢測(cè)的相關(guān)知識(shí)，充分理解同意后填寫知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑 TC-96／G／H（b）C 基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技公司），HB-2012A 導(dǎo)流雜交儀（廣東凱普生物科技公司），3500Dx基因分析儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）。離心柱法核酸提取試劑及耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒（廣東凱普生物科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 耳聾易感基因檢測(cè) 新生兒出生72 h 時(shí)采集足跟血3～5滴，制成每個(gè)血斑直徑8 mm的血斑卡，待其自然風(fēng)干形成干血片后，參照離心柱法核酸提取試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作程序提取基因組DNA，采用耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒對(duì)4個(gè)耳聾基因的13 個(gè)位點(diǎn)，包 括 GJB2 基因 （c.35delG，c.176del16，c.235delC，c.299delAT，c.155delTCTG），SLC26A4 基因（c.2168A＞G，c.919-2A＞G，c.1229C＞T），GJB3 基因（c.538C ＞T），線粒體 12SrRNA （m.1555A ＞G，m.1494C＞T）和 線 粒 體 tRNA （m.7445A ＞ G，m.12201T＞C）進(jìn)行檢測(cè)。耳聾基因檢測(cè)過(guò)程中PCR擴(kuò)增、雜交、顯色等步驟均依照檢測(cè)試劑盒及相關(guān)儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 耳聾易感基因測(cè)序 采用 Sanger 測(cè)序技術(shù)對(duì)單個(gè)位點(diǎn)雜合突變的聽(tīng)力損失患兒進(jìn)行耳聾相關(guān)基因測(cè)序驗(yàn)證。使用 PCR 反應(yīng)對(duì) SLC26A4、GJB2、GJB3 及 mtDNA 基因的 43 個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，并采用特異性引物進(jìn)行Sanger測(cè)序檢測(cè)。特異性引物的設(shè)計(jì)是專門針對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)，并覆蓋該位點(diǎn)上、下游的序列。標(biāo)本檢測(cè)得到的序列與NCBI提供的 SLC26A4 基因參考序列（NG＿008489.1）／（NM ＿000441.1）、GJB2 基因參考序列（NM＿004004.5）、GJB3 基因參考序列（NM＿001005752.1）及mtDNA 基因參考序列（NC＿01292）進(jìn)行比對(duì)和注釋。突變的表述參照Human Genome Variation Society（HGVS）version 15.11 進(jìn)行。

1.3.3 聽(tīng)力篩查評(píng)估及診斷 正常新生兒于出生48～72 h時(shí)采用耳聲發(fā)射法（oto-acoustic emission，OAE）進(jìn)行初次聽(tīng)力篩查；危重新生兒出生于48 h后采用自動(dòng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)（automatic auditory brainstem response，AABR）進(jìn)行聽(tīng)力篩查。初篩不通過(guò)者1個(gè)月后進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩采用OAE 與AABR 聯(lián)合檢測(cè)。復(fù)篩未通過(guò)者，于3月齡采用聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位法（auditory brainstem response，ABR）進(jìn)行聽(tīng)力診斷。ABR 為正負(fù)交替極性刺激的click 音，極間電阻＜2 kΩ，疊加次數(shù)2 006 次。將電極置于前額正中發(fā)際處，雙側(cè)乳突為參考電極，鼻根部為地極。選擇起始刺激強(qiáng)度，以10 dB 遞降，至V 波消失時(shí)上升5 dB 刺激觀察V波以獲得反應(yīng)閾。V波反應(yīng)閾（正常聽(tīng)力級(jí)，下同）≦30 dBnHL為正常；以V波反應(yīng)閾＞30 dBnHL作為聽(tīng)力損失指標(biāo)，分為輕度（31～50 dBnHL）、中度（51 ～70 dBnHL）、重度（71～90 dBnHL）以及極重度（＞91 dBnHL）［3］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用 χ2檢驗(yàn)，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳聾易感基因檢測(cè)結(jié)果 10 313 例新生兒共檢出耳聾基因突變577 例，檢出率為5.59%。4 種基因單個(gè)位點(diǎn)突變攜帶者共565 例，檢出率約為5.48%，其中 GJB2 基因突變攜帶率約為 3.03%，SLC264A基因突變攜帶率約為1.89%，GJB3基因突變攜帶率約為0.24%，線粒體DNA 突變攜帶率約為0.32%（表1）。除此之外，另有復(fù)合雜合突變／雙基因雜合突變12例，攜帶率約為0.12%。

表1 10 313例新生兒耳聾易感基因單個(gè)位點(diǎn)突變攜帶率

2.2 聽(tīng)力篩查及評(píng)估結(jié)果 10 313 例新生兒中，有8 999例（87.26%）通過(guò)了聽(tīng)力初篩。968 例進(jìn)行了復(fù)篩，790例（81.61%）通過(guò)了復(fù)篩。經(jīng)聽(tīng)力學(xué)評(píng)估最終確診為聽(tīng)力損失者38 例，聽(tīng)力障礙發(fā)生率為 0.37%。

2.3 新生兒聽(tīng)力與耳聾易感基因聯(lián)合篩查結(jié)果10 313 例新生兒中，耳聾易感基因篩查陽(yáng)性577例，經(jīng)聽(tīng)力篩查初篩及復(fù)篩，最終確診聽(tīng)力損失16例，聽(tīng)力障礙發(fā)生率為2.77%。耳聾易感基因篩查未見(jiàn)異常9 736例，經(jīng)聽(tīng)力初篩和復(fù)篩最終確診聽(tīng)力損失22 例，聽(tīng)力障礙發(fā)生率為0.23%。二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝ 96.257，P＜0.01）。577 例基因篩查陽(yáng)性新生兒中，565 例為單個(gè)位點(diǎn)突變，12例為復(fù)合雜合突變／雙基因雜合突變，各基因突變頻率及聽(tīng)力損失情況見(jiàn)表2、表3。

表2 565例單個(gè)位點(diǎn)突變頻率及聽(tīng)力損失情況

表3 GJB2或SLC26A4基因純合／復(fù)合雜合／雙基因雜合突變者聽(tīng)力診斷及干預(yù)的情況

2.4 3例聽(tīng)力重度受損患兒的家系分析結(jié)果 家系1：先證者出生時(shí)雙耳聽(tīng)力篩查通過(guò)，父母聽(tīng)力正常。耳聾易感基因檢測(cè)提示 SLC26A4 基因c.919-2A＞G雜合突變。至3 周歲時(shí)患兒出現(xiàn)呼之不應(yīng)，反應(yīng)遲鈍等癥狀，診斷為雙耳聽(tīng)力極重度損失。對(duì)先證者行耳聾易感基因GJB2、SLC26A443、GJB3及線粒體基因43 位點(diǎn)全測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該患兒為SLC26A4 基因 c.919-2A＞G／c.1988G＞A 復(fù)合雜合突變（圖1A），結(jié)合患兒“雙側(cè)前庭導(dǎo)水管水腫”的臨床表型，建議聽(tīng)力正常的父母行SLC26A4基因Sanger測(cè)序驗(yàn)證，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn) SLC26A4 c.919-2A＞G 雜合變異遺傳自母親，SLC26A4 c.1988G＞A雜合變異遺傳自父親。

家系2：先證者出生時(shí)雙耳聽(tīng)力篩查通過(guò)，耳聾易感基因檢測(cè)提示SLC26A4基因c.919-2A＞G雜合突變。至4周歲時(shí)患兒出現(xiàn)聽(tīng)力衰減，口齒不清等癥狀，顳骨CT 螺旋掃描提示雙側(cè)前庭導(dǎo)水管呈喇叭口樣擴(kuò)張。結(jié)合患兒的臨床表型，建議患兒及聽(tīng)力正常的父母行SLC26A4 基因測(cè)序家系驗(yàn)證，經(jīng)Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)患兒為SLC26A4基因c.919-2A＞G／c.2086C＞T 復(fù)合雜合突變（圖 1B），其中 c.919-2A＞G雜合變異遺傳自母親，c.2086C＞T 雜合變異遺傳自父親。

家系3：先證者出生時(shí)雙耳聽(tīng)力初篩及復(fù)篩均未通過(guò)，耳聾易感基因檢測(cè)提示為SLC26A4 基因c.919-2A＞G雜合突變。至2 月齡時(shí)患兒出現(xiàn)呼之不應(yīng)，反應(yīng)遲鈍等癥狀，聽(tīng)力診斷為雙耳聽(tīng)力重度損失。先證者母親為耳聾患者，對(duì)其行耳聾易感基因檢測(cè)，提示先證者母親存在 SLC26A4 基因c.919-2A＞G雜合突變。結(jié)合家系信息，建議先證者及其母親行SLC26A4基因Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該患兒及母親均為SLC26A4基因c.919-2A＞G單個(gè)位點(diǎn)雜合突變（圖1C）。

圖1 各家系Sanger測(cè)序結(jié)果

3 討論

國(guó)內(nèi)多項(xiàng)耳聾分子流行病學(xué)研究顯示，GJB2、SLC26A4、GJB3及12SrRNA是遺傳性耳聾最常見(jiàn)的4個(gè)致病基因［4-5］。本研究共完成揚(yáng)州地區(qū)新生兒檢測(cè)10 313例，檢出577 例攜帶致病突變，突變率約為 5.59%，該數(shù)據(jù)低于承德地區(qū)［6］的研究結(jié)果（10.66%），但高于武漢［7］和東莞地區(qū)［8］的耳聾突變檢出率（3.00% ～3.53%），與西北地區(qū)［9］的耳聾突變檢出率相近（5.18%）。本研究中4 個(gè)基因突變檢出率由高到低依次為GJB2（3.03%）、SLC26A4（1.89%）、線 粒 體 12SrRNA （0.30%）和 GJB3（0.24%），與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相似［10-11］，位點(diǎn)突變頻率前 5位 依 次 為 GJB2 c.235delC （2.34%）、SLC26A4 c.919-2A＞G（1.47%）、GJB2 c.299 del AT（0.48%）、SLC26A4 c.2168A＞G（0.36%）及 12SrRNA m.1555A＞G（0.28%），與其他地區(qū)研究結(jié)果不盡相同［12，15］。本研究檢出 GJB2 c.235delC 突變攜帶率約為2.34%，高于紹興、昆明等地區(qū)文獻(xiàn)報(bào)道的攜帶率［13-14］，提示揚(yáng)州地區(qū)耳聾易感基因以 GJB2 c.235delC為主要突變熱點(diǎn)。SLC26A4 c.919-2A＞G為本地區(qū)另一主要突變熱點(diǎn)，本研究檢出195 例該位點(diǎn)突變，攜帶率為 1.47%，略低于遼寧［15］、淄博［16］等地區(qū)，但高于成都［17］、杭州［11］等地區(qū)。以上研究結(jié)果證實(shí)了我國(guó)耳聾易感基因突變頻率存在地域差異［18-20］，因此，了解本地區(qū)耳聾易感基因的突變頻率，有助于未來(lái)更準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)本地區(qū)耳聾出生缺陷防控。

本研究中577 例耳聾易感基因突變攜帶者的聽(tīng)力障礙發(fā)生率為2.77%，高于9 736 例耳聾易感基因篩查陰性者的聽(tīng)力障礙發(fā)生率（0.23%），可知耳聾易感基因突變攜帶者中更易出現(xiàn)聽(tīng)力損失。目前已知GJB2基因及SLC26A4基因突變以常染色體隱性遺傳為主，純合或復(fù)合雜合突變可導(dǎo)致聽(tīng)力損失，本研究檢出2 例GJB2 c.235del 純合突變攜帶者出現(xiàn)重度聽(tīng)力損失，4 例 SLC26A4 c.919-2A＞G純合突變攜帶者中有2例表現(xiàn)出極重度聽(tīng)力損失，此外，5 例GJB2 基因或SLC26A4 基因的復(fù)合雜合突變攜帶者也出現(xiàn)聽(tīng)力損失，并且聽(tīng)力損失程度與基因純合突變的聽(tīng)力損失程度相差無(wú)幾，證明基因復(fù)合雜合突變與純合突變具有同等效力，這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果基本一致［21-22］。值得注意的是，攜帶SLC26A4 c.919-2A＞G純合突變或復(fù)合雜合突變的耳聾患者均表現(xiàn)為極重度聽(tīng)力損失，這提示我們SLC26A4 c.919-2A＞G 突變導(dǎo)致的耳聾癥狀較其他基因突變可能更為嚴(yán)重。由于SLC26A4 基因突變攜帶者在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，可因外在因素造成進(jìn)行性聽(tīng)力損失，因而，本研究對(duì)2 例暫未出現(xiàn)聽(tīng)力損失的SLC26A4純合突變患兒發(fā)放生活指導(dǎo)卡片，并叮囑家長(zhǎng)在日常生活中注意避免如感冒、發(fā)熱、顱外傷或顱壓增高等突發(fā)損失，隨時(shí)關(guān)注幼兒聽(tīng)力變化。本研究中線粒體突變頻率位列第三，且以12SrRNA m.1555A＞G突變?yōu)橹?，與已報(bào)道的研究結(jié)論相近［23-24］。線粒體突變?yōu)槟赶颠z傳，其子代均為突變基因攜帶者，線粒體12SrRNA突變與氨基糖苷類抗生素（aminoglycoside antibiotic，AmAn）的應(yīng)用密切相關(guān)，使用氨基糖苷類抗生素可導(dǎo)致不可逆的聽(tīng)力損失。當(dāng)發(fā)現(xiàn)新生兒為線粒體突變攜帶者，則向其家長(zhǎng)發(fā)放氨基糖苷類藥物警示卡，并告知父母提高對(duì)氨基糖苷類藥物或其他耳毒性藥物的警惕，謹(jǐn)慎用藥，最大程度避免其成長(zhǎng)過(guò)程中因使用氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致的聽(tīng)力損失。截至目前，本研究線粒體突變攜帶者的后續(xù)隨訪聽(tīng)力均未見(jiàn)異常。另外，本研究25例GJB3基因雜合突變攜帶者亦未見(jiàn)聽(tīng)力損失。但GJB3基因突變可引起常染色體隱性或顯性遺傳的后天高頻感音神經(jīng)性耳聾［25］，因此對(duì)攜帶GJB3基因突變的新生兒可長(zhǎng)期隨訪其聽(tīng)力情況。

本研究對(duì)3例SLC26A4 c.919-2A＞G雜合突變的耳聾患兒進(jìn)行了家系檢測(cè)。確認(rèn)了其中2 例患兒的病因是攜帶SLC26A4基因的復(fù)合雜合突變，再次支持了SLC26A4基因隱性遺傳的致病證據(jù)，也提示了孕前夫妻雙方進(jìn)行耳聾易感基因檢測(cè)的必要性。此外，尚有 1 例患兒經(jīng) Sanger 測(cè)序確認(rèn)為SLC26A4基因的單個(gè)位點(diǎn)雜合突變的攜帶者，且遺傳自同樣聽(tīng)力損失的母親。筆者推測(cè)該患兒的致聾病因有以下可能：一是SLC26A4基因存在不完全外顯；二是存在其他罕見(jiàn)的耳聾基因的突變。面對(duì)此種情況，耳聾基因靶向測(cè)序或全外顯子測(cè)序似乎是更適合的檢測(cè)方式。

本研究聽(tīng)力篩查與耳聾易感基因篩查聯(lián)合開(kāi)展，互為支持，互為補(bǔ)充，但依然存在一些不足之處。例如，由于人們對(duì)耳聾及耳聾易感基因認(rèn)知和接受程度不同，本研究2例GJB2 c.235delC雜合突變聽(tīng)障患兒、1 例 GJB2 c.299delAT 雜合突變聽(tīng)障患兒及1例SLC26A4 c.919-2A＞G雜合突變聽(tīng)障患兒的父母拒絕進(jìn)行進(jìn)一步基因診斷。此外，本研究中22例耳聾易感基因篩查陰性的新生兒在后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育中出現(xiàn)了聽(tīng)力損失，這也提示我們僅僅依靠聯(lián)合篩查并不能檢出全部的潛在聽(tīng)力損失者，后續(xù)針對(duì)耳聾基因的靶向測(cè)序或全外顯子測(cè)序可作為診斷聽(tīng)障患兒病因的臨床路徑的補(bǔ)充和完善。因此，如何改進(jìn)聽(tīng)障患兒的病因診斷路徑，加強(qiáng)對(duì)育齡夫妻的科普宣教，提高自愿受檢人群的比例，將成為筆者接下來(lái)的研究方向。

綜上所述，本研究對(duì)揚(yáng)州地區(qū)新生兒的聽(tīng)力與耳聾易感基因聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分析，證明耳聾易感基因檢測(cè)是預(yù)估新生兒先天性耳聾易感性的有效輔助手段，大規(guī)模開(kāi)展、聯(lián)合篩查可及早發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力損失患兒，有助于患兒早期診斷和早期干預(yù)，還可為突變攜帶者家庭提供婚育及再生育指導(dǎo)。目前本地區(qū)耳聾出生缺陷防控主要以出生后進(jìn)行篩查的三級(jí)防控為主，但僅在出生后進(jìn)行“亡羊補(bǔ)牢”不足以實(shí)現(xiàn)出生缺陷的閉環(huán)防控，因此，對(duì)有生育意愿的育齡夫婦應(yīng)廣泛宣教孕前檢查的重要性，將預(yù)防關(guān)口提前至孕前檢查，提早發(fā)現(xiàn)耳聾高危家庭，以期覆蓋全周期的耳聾出生缺陷防控。