廣西人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G位點(diǎn)多態(tài)性分布*

翁銀花，陳杰，谷嬉嬉，羅艷萍，劉潮，藍(lán)艷，韋葉生（.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西桂林 5400，.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西百色 533000）

MicroRNAs（MiRNAs）是一種在物種間高度保守的內(nèi)源性小非編碼RNA，長(zhǎng)度約為18 ～25 個(gè)核苷酸，其在體內(nèi)主要通過與靶mRNA 3′非翻譯區(qū)（3′UTR）互補(bǔ)位結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA 降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。因此，也被稱為內(nèi)源性關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［1］。據(jù)報(bào)道，人類基因組中有已知超過2 500 種MicroRNA能特異性調(diào)節(jié)基因表達(dá)，它們參與多種細(xì)胞的過程，如細(xì)胞增殖、分化以及代謝等［2］。miR-365 作為MicroRNA家族中被研究最廣泛的重要成員之一，研究表明，miR-365不僅參與眾多生物的復(fù)雜調(diào)控，還被證實(shí)其異常表達(dá)與肝癌［3］、胰腺癌［4］、非小細(xì)胞肺癌［5］以及糖尿?。?］等疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。近期研究表明，miR-365基因存在位點(diǎn)多態(tài)性，這種多態(tài)性可能對(duì)miR-365 的表達(dá)調(diào)控有一定的影響，這一發(fā)現(xiàn)可能成為某些腫瘤早期診斷的指標(biāo)和治療的新靶點(diǎn)［7］。然而，目前關(guān)于廣西人群miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G位點(diǎn)遺傳多態(tài)性的相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本研究采用SNPscan 技術(shù)對(duì)廣西地區(qū)健康人群miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G基因位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)，進(jìn)一步分析其基因型和等位基因與不同地區(qū)人群在多態(tài)性方面存在的差異，為后期與miR-365 基因位點(diǎn)相關(guān)的易感性疾病的預(yù)防與治療和群體遺傳學(xué)等方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2021年1月至6月于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢中心體檢的健康者血液樣本 294 例，男 175 例，女 119 例，年齡（54.9±8.2）歲，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均正常，排除自身免疫、腫瘤、心腦血管疾病以及血脂異常等疾病。各研究對(duì)象均屬健康的廣西獨(dú)立個(gè)體，且個(gè)體間均無親緣關(guān)系。本研究方案獲得桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 QT-1漩渦混合器 （上海琪特分析儀器公司），TD5A-WS 臺(tái)式低速離心機(jī) （長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器公司），DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司），F(xiàn)R-110 紫外分析裝置、FR-250電泳儀（上海復(fù)日科技公司），多用途水平電泳槽（北京百晶生物科技公司），2720 型Thermal Cycler 擴(kuò)增儀、3130型genetic analyze分析儀（美國(guó)ABI公司）。人類基因組DNA全血提取試劑盒（北京天根生化科技公司），SNPscanTM分型試劑盒、Tag DNA ligase（50 U／μL）、Tag DNA ligase Buffer（10X）購(gòu)自上海天昊生物科技公司，10× PCR buffer、dNTP mix （2.5 mmol／L）、Takara HotStart Taq （5 U／μL）均購(gòu)自日本 TaKaRa 公司，MgCl2（25 mmol／L，上海生工公司）、Hi-Di、GeneScanTM-500 染料（美國(guó) ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA 樣本制備及濃度、純度鑒定 采集各研究對(duì)象空腹靜脈血3 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，混勻后取200 μL 全血標(biāo)本，按照人類基因組DNA全血提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA 樣本提取，余下的樣本分裝于相應(yīng)儲(chǔ)存管內(nèi)，置于－70 ℃儲(chǔ)存。取1 μL DNA樣本，使用紫外分光光度儀檢測(cè)吸光度（A260nm／A280nm）值，取比值為 1.7 ～ 2.0，濃度為30～50 ng／μL的合格DNA樣本用于后續(xù)基因分型試驗(yàn)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 通過NCBI查找miR-365基因rs121224 和rs178553 位點(diǎn)的堿基序列，采用Primer Premier 3.0軟件對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1），引物委托上海天昊公司合成。

表1 miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G位點(diǎn)的引物序列

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 連接反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，包括 8.0 μL DNA 樣本，10.0 μL 2×連接緩沖液，0.8 μL 連接探針混合液，0.2 μL 耐熱 DNA 聚合酶，1 μL 滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足，共20.0 μL。連接反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 1 min，58 ℃ 4 h，循環(huán) 4 次；94 ℃2 min，72 ℃保存。連接多重 PCR 擴(kuò)增體系（20.0 μL）包括 2 μL 1×GC-Ⅰ緩沖液，2.5 mmol Mg2＋，0.2 mmol dNTP，1.0 U 耐熱 DNA 聚合酶，1 μL DNA樣本，0.2 μL多重PCR引物，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至 20 μL。多重 PCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 2 min；94 ℃20 s，62 ℃ 40 s（每個(gè)循環(huán)降低 0.5 ℃），72 ℃1.5 min，循環(huán) 9 次；94 ℃ 20 s，57 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，循環(huán) 25 次；68 ℃ 80 min；4 ℃ 保存。將PCR 產(chǎn)物稀釋10 倍后，取1 μL 與0.5 μL Liz500 分子量?jī)?nèi)標(biāo)，8.5 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性 5 min，純化后的PCR 產(chǎn)物上ABI3730XL 測(cè)序儀檢測(cè)，收集的原始數(shù)據(jù)用 Gene-Mapper（Applied Biosystems，USA）4.1 軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行。根據(jù)基因型符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），證明所選取樣本具有群體代表性。rs121224C／G和rs178553A／G位點(diǎn)基因型及等位基因頻率采用直接計(jì)算法計(jì)算，采用χ2檢驗(yàn)計(jì)算不同地區(qū)人群的分布差異，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 廣西地區(qū)人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G 分 型 檢 測(cè) 結(jié) 果 rs121224C／G 和rs178553A／G 位點(diǎn)基因型符合 Hardy-Weinberg 定律（χ2值分別為 0.097，0.082，P 值分別為 0.755 和0.774），證明所選取的樣本有效。測(cè)序結(jié)果顯示，rs121224C／G 位點(diǎn)有 3 種基因型，分別為 CC（27.9%）、GC（49.0%）和 GG（23.1%），C 和 G 等位基因頻率分別為 52.4%和 47.6%。rs178553A／G 位點(diǎn)包含 AA（22.4%）、AG（49.0%）和 GG（28.6%）3種基因型，A 和 G 等位基因頻率分別為46.9%和53.1%?；蛐头中徒Y(jié)果見圖1。

圖1 rs121224位點(diǎn)（A）及rs178553位點(diǎn)（B）測(cè)序結(jié)果

2.2 不同性別間 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G 多態(tài)性的比較 廣西地區(qū)人群miR-365基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G 位點(diǎn)分別以 GC（49.0%）和 AG（49.0%）基因型為多見；最高基因頻率分別為 C（52.4%）和 G（53.1%）。不同性別間 rs121224C／G、rs178553A／G 位點(diǎn)基因型和等位基因比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2 廣西地區(qū)人群miR-365基因 rs121224、rs178553 多態(tài)性在不同性別間的比較

2.3 廣西地區(qū)人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G多態(tài)性與其他地區(qū)人群比較 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，廣西地區(qū)體檢健康者rs121224C／G 位點(diǎn)基因型、等位基因頻率與 HapMap公布的CEU、YRI人群比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），但與HCB和JPT 地區(qū)人群比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；rs178553A／G 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與HapMap公布的CEU、JPT和YRI 地區(qū)人群比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與HCB地區(qū)人群比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、表 4。

表3 廣西地區(qū)人群miR-365 基因rs121224位點(diǎn)多態(tài)性與不同地區(qū)人群比較

表4 廣西地區(qū)人群miR-365 基因rs178553位點(diǎn)多態(tài)性與不同地區(qū)人群比較

3 討論

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）是人類基因組中占比最高的變異形式（90%），主要是指在基因水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，在人類基因組中平均每300 個(gè)堿基對(duì)中就有1 個(gè) SNP，SNP 是導(dǎo)致miRNA失調(diào)，影響個(gè)體疾病遺傳易感性的重要因素［8］。近年來，隨著全基因組計(jì)劃的研究不斷深入，基因位點(diǎn)上的SNP 與疾病的易感性成為研究的熱點(diǎn)［9-10］。有研究表明miR-SNP 與不同類型的癌癥有關(guān)，包括鱗狀細(xì)胞癌［11］、胃癌［12］和腦卒中［13］等。miRNA SNPs 是影響miRNA 的表達(dá)和功能的主要因素之一，Li 等［14］發(fā)現(xiàn)在中國(guó)漢族人群中pri-miR-218-2基因 rs11134527 位點(diǎn)的 A 等位基因可能是肺癌的危險(xiǎn)因素，而 pri-miR-143 基因rs4705343位點(diǎn)的T等位基因可能與非小細(xì)胞肺癌風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)亞洲和歐洲2 個(gè)種群之間等位基因頻率明顯不同，這一結(jié)果提示這些SNPs如果要用作于非小細(xì)胞肺癌新的標(biāo)志物，還應(yīng)增加對(duì)不同背景人群中 SNPs 進(jìn)行研究。miR-365作為MicroRNA的一位重要成員，在生命體中廣泛存在，關(guān)于miR-365 SNPs 與疾病的相關(guān)性不少文獻(xiàn)也有報(bào)道，Re 等［15］發(fā)現(xiàn)，在 miR-365b 基因rs121224中，具有CC 基因型和CG 基因型的胃癌患者胃蛋白酶原（PGⅡ）水平更高，這與胃癌患者感染幽門桿菌具有一定的相關(guān)性。Wu 等［16］發(fā)現(xiàn)中國(guó)北方人群miR-365b基因rs121224與飲酒亞組中的腸型胃癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，Borrmann Ⅲ～Ⅳ期腸型胃癌患者攜帶miR-365b 基因rs121224 位點(diǎn)CC 和GC基因型的預(yù)后相比 GG 基因型較差，這提示SNP 可能對(duì)不同背景胃癌患者中miR-365 的表達(dá)有一定的影響。既往研究表明同一疾病在不同區(qū)域人群中的易感性可能存在不同程度的差異，例如，腦卒中在我國(guó)東北地區(qū)的發(fā)病率較南部地區(qū)升高［17］。因此，研究遺傳多態(tài)性在不同背景人群間的分布差異將為今后在基因水平上診斷和治療某些疾病提供科學(xué)的理論依據(jù)。

本研究對(duì) miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G位點(diǎn)采用高通量SNPscan測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并與千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)公布的CEU、HCB、JPT 和YRI 人群的SNP 分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，并分析不同種族人群的差異。結(jié)果顯示，廣西地區(qū)人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在男女性別間的分布均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明兩位點(diǎn)的多態(tài)性與性別無關(guān)。進(jìn)一步與不同人群比較后發(fā)現(xiàn)，廣西地區(qū)人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G位點(diǎn)的基因型和等位基因與HCB 人群相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。廣西地區(qū)人群和HCB人群均屬中國(guó)人，地理位置較近，遺傳背景和物種進(jìn)化來源上存在一定的同源性，故基因型分布規(guī)律的相似度也越高。rs121224C／G位點(diǎn)與JPT人群比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但rs178553A／G 位點(diǎn)與JPT人群比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成這種結(jié)果的原因可能是廣西地區(qū)人群與JPT 人群均屬亞洲，距離較近，飲食文化存在諸多相似，遺傳背景差異小，但同時(shí)由于廣西的地理位置獨(dú)特，屬于多個(gè)民族聚集的地廣人稀地區(qū)，氣候變化和獨(dú)特的喀斯特地貌以及少數(shù)民族通婚現(xiàn)象的普遍存在也可能是導(dǎo)致遺傳背景差異大的原因之一。兩位點(diǎn)基因型和等位基因與CEU 和YRI 人群比較，存在不同程度的分布差異，這有可能是因?yàn)閺V西地區(qū)人群CEU和YRI人群與地處不同大洲，地理位置相差甚遠(yuǎn)，且隨著生活水平的提高、人口遷移、氣候環(huán)境和飲食習(xí)慣以及地方風(fēng)俗習(xí)慣的差異等眾多因素影響，在一定程度上阻礙了基因交流［18］。分析miR-365基因的SNP 在不同地區(qū)人群的分布特點(diǎn)，筆者發(fā)現(xiàn)miR-365 基因在不同地區(qū)和人群間的突變效應(yīng)存在差異性，這種差異性可能是導(dǎo)致同一疾病在不同背景人群中的易感性不同的原因之一，對(duì)人類群體遺傳學(xué)的研究可能起非常重要的作用。

綜上所述，本研究初步探討了廣西地區(qū)健康人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G 位點(diǎn)的多態(tài)性分布特征，通過比較發(fā)現(xiàn)在不同種族人群間存在不同程度的差異，本次研究結(jié)果豐富了miR-365基因多態(tài)性在人類群體遺傳學(xué)方面的研究，將為其后續(xù)相關(guān)疾病的易感性提供可參考的理論依據(jù)。然而，本研究尚存在不足，例如抽樣樣本量較少且樣本來源單一，可能存在一定的抽樣誤差。因此，后續(xù)我們將加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證分析miR-365基因與疾病的易感性，為群體遺傳學(xué)以及相關(guān)疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。