烏司他丁在缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

趙書馨，張雄，蘇晨林，李霽，于鋒（中國(guó)藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京 211198）

組織短暫缺血，恢復(fù)血液灌注后，組織損傷不僅沒(méi)有得到有效的緩解甚至進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，稱為缺血再灌注損傷[1]。缺血再灌注損傷幾乎發(fā)生在每個(gè)器官中，自從1960年心肌缺血再灌注損傷的定義被提及之后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了在腦、腎、肺、腸道等器官中的缺血再灌注損傷[2]。缺血再灌注損傷涉及局部和全身作用的病理生理機(jī)制，主要是通過(guò)兩個(gè)階段發(fā)展：在局部缺血期間，主要發(fā)生的是缺氧損傷，能量的消耗，由于能量缺乏直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)某些狀態(tài)的改變，例如細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)紊亂、水解酶激活和細(xì)胞膜通透性增加等。隨后在再灌注過(guò)程中，主要發(fā)生炎癥因子的釋放和細(xì)胞凋亡等生理反應(yīng)[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷涉及多種生物學(xué)過(guò)程，主要由自由基產(chǎn)生的增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）超載和炎癥因子的過(guò)度激活等原因造成[4]。

絲氨酸蛋白酶抑制劑是蛋白酶家族的重要成員，主要參與蛋白的合成和降解過(guò)程，并且參與炎癥和腫瘤的抑制等。抑肽酶、rhKD/APP、烏司他丁等絲氨酸蛋白酶抑制劑具有保護(hù)器官缺血再灌注損傷的能力[5]。尤其是近幾年對(duì)于烏司他丁在缺血再灌注損傷中的研究更為深入，已證實(shí)其在心臟、腎臟和肺等器官的缺血再灌注損傷中具有良好的保護(hù)作用。器官的缺血再灌注損傷有望成為烏司他丁新的臨床適應(yīng)證。

烏司他丁由143 個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量約為67 000，其序列包括兩個(gè)Kunitz 型結(jié)構(gòu)域，在血漿中主要以中間α-抑制劑和前α-抑制劑兩種前體形式存在[6]。中間α-抑制劑和前α-抑制劑的主要合成部位是肝臟，在腎臟、胰腺、腸和胃中雖然也會(huì)產(chǎn)生，但濃度要低得多[7]。烏司他丁作為廣譜蛋白水解酶，可在體內(nèi)外抑制多種絲氨酸蛋白酶[8]。臨床治療方面，烏司他丁已被廣泛用于治療急性胰腺炎、敗血性休克、器官衰竭等疾病。烏司他丁通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、調(diào)節(jié)酶活性、抗血液凝固等來(lái)預(yù)防和治療疾病[9]。本文針對(duì)烏司他丁通過(guò)不同的信號(hào)通路緩解不同器官的缺血再灌注進(jìn)行系統(tǒng)性的匯總分析，以期望為臨床用藥提供參考。

1 烏司他丁與缺血再灌注損傷

1.1 烏司他丁與肺缺血再灌注損傷

肺移植等手術(shù)和術(shù)后環(huán)境中常常伴隨著肺缺血再灌注損傷的發(fā)生，急性肺損傷、肺部切除和創(chuàng)傷性休克也可以誘發(fā)肺缺血再灌注損傷形成[10]。肺缺血再灌注損傷的主要原因之一是氧自由基過(guò)剩，而其根本原因是氧化和抗氧化系統(tǒng)的不平衡致使大量活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的增加。實(shí)驗(yàn)研究表明，與肺缺血再灌注損傷模型組相比，烏司他?。?.2×104U·kg-1）能夠通過(guò)調(diào)節(jié)丙二醛（MDA）的表達(dá)來(lái)緩解氧化損傷，進(jìn)而對(duì)肺組織起到保護(hù)作用[11]。此外，烏司他?。?×104U·kg-1）能顯著降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白介素-6（IL-6）的表達(dá)[12]，表明其通過(guò)抑制炎癥因子的釋放，保護(hù)肺組織免受缺血再灌注的損傷。另有研究表明，烏司他丁（1×104U·kg-1）能通過(guò)抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）緩解肺缺血再灌注損傷，使肺血?dú)馄琳系耐ㄍ感越档?，肺部組織形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)，相應(yīng)的肺部檢測(cè)指標(biāo)也得到了改善[13]。用于肺移植的肺保存液中的成分被認(rèn)為是在缺血期間使肺損傷最小化的關(guān)鍵，合理保存肺器官?gòu)亩档头谓M織缺血再灌注損傷的發(fā)展也是近幾年來(lái)探索的熱點(diǎn)[14]。研究表明，往保存液中的添加烏司他丁能夠緩解肺缺血再灌注損傷的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)對(duì)兔子進(jìn)行原位肺缺血再灌注損傷的造模處理，使用烏司他丁處理的保存液中用于肺保護(hù)，肺部組織的髓過(guò)氧化物酶（MPO）、MDA 水平明顯降低，且實(shí)驗(yàn)兔血清中TNF-α水平降低，炎癥因子的釋放和中性粒細(xì)胞的遷移得到了有效的抑制[15]。以上研究表明，烏司他丁在肺缺血再灌注損傷中能夠通過(guò)降低氧化損傷，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用。

1.2 烏司他丁與肝臟缺血再灌注損傷

造成肝臟缺血再灌注損傷的原因有很多，如鈣穩(wěn)態(tài)失衡，產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS）和線粒體功能出現(xiàn)障礙等[16]。烏司他丁對(duì)于肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)目前已有較多的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸林格保存液中補(bǔ)充烏司他?。?×103U·mL-1）可有效降低肝酶釋放，其機(jī)制是通過(guò)增加抗凋亡基因B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2），降低促凋亡基因半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和BAX（Bcl-2 assaciated X protein）的表達(dá)來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用，烏司他丁可使肝臟免受肝臟缺血再灌注損傷的影響，且呈現(xiàn)劑量依賴性，并能顯著延長(zhǎng)肝移植中肝供體的存活時(shí)間[17]。自噬的發(fā)生通常是由于蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)度降解繼而引發(fā)細(xì)胞死亡[18]。與常見的缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制不同，烏司他丁通過(guò)激活張氏肝細(xì)胞的自噬功能，進(jìn)而起到保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)張氏肝細(xì)胞進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理，發(fā)現(xiàn)烏司他丁在體外以劑量依賴形式抑制缺氧復(fù)氧損傷，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)自噬，上調(diào)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（ULK1）、自噬蛋白1 和微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC-3）的表達(dá)；然而，一旦自噬被抑制，缺氧復(fù)氧損傷將會(huì)加重。表明烏司他丁誘導(dǎo)的缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞自噬是保護(hù)性代償反應(yīng)[19]。

烏司他丁除單獨(dú)用于肝臟缺血再灌注損傷治療，也常與其他藥物聯(lián)用來(lái)治療該疾病，有研究表明烏司他丁聯(lián)合粉防己堿、維拉帕米等藥物可以對(duì)肝臟缺血再灌注損傷起到較好的保護(hù)作用，且聯(lián)合用藥的作用效果較單用更好[20-21]。以上研究說(shuō)明，烏司他丁單獨(dú)及聯(lián)合用藥具有治療肝臟缺血再灌注損傷的作用。

1.3 烏司他丁與腦缺血再灌注損傷

大腦是最容易缺氧的器官，腦組織的缺血再灌注會(huì)加劇神經(jīng)細(xì)胞壞死和腦組織水腫。細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、自由基產(chǎn)生、興奮性氨基酸毒性和炎癥反應(yīng)與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，以上因素都可能引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[22]。Toll 樣受體4（TLR4）介導(dǎo)的核因子-κB（NF-κB）參與觸發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎癥反應(yīng)[23]。烏司他?。?×103U/100 g）治療后腦水腫和梗死體積顯著減少，并抑制TLR4 和NF-κB 的表達(dá)，說(shuō)明烏司他丁可以通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮穩(wěn)定有效的神經(jīng)保護(hù)作用[24]。此外，烏司他丁（3×105U·kg-1）可以重新激活Nrf2/血紅素加氧酶1（HO-1）的表達(dá)；從分子途徑可發(fā)現(xiàn)，Nrf2 抑制劑的治療可阻斷烏司他丁對(duì)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥的抑制作用，更加深入地論證了烏司他丁對(duì)于氧化應(yīng)激的治療作用；另外，高表達(dá)的ROS、MDA 也被顯著抑制[25]。然而，烏司他丁對(duì)缺血再灌注損傷的改善并不能歸因于單一的分子途徑，其還可以通過(guò)抑制凋亡相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)，進(jìn)而緩解缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)研究表明，對(duì)沙鼠進(jìn)行缺血誘導(dǎo)后，烏司他丁的治療能抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而改善缺血誘導(dǎo)的短期記憶障礙[26]。另外，烏司他丁還可以下調(diào)腦組織c-Jun氨基末端激酶（JNK）的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，這與抑制JNK 的傳導(dǎo)路徑有關(guān)[27]。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）作為MMPs 的主要成員之一，其過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)血腦屏障被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致腦缺血惡化。腦缺血再灌注損傷會(huì)激活MMPs 水平，特別表現(xiàn)為MMP-9 水平升高[28]。研究發(fā)現(xiàn)烏司他?。?×103U/100 g）可以顯著地逆轉(zhuǎn)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的MMP-9 的過(guò)度表達(dá)，減輕緊密連接蛋白-1 和occludin 的降解，表明烏司他丁可促進(jìn)缺血性腦組織中血腦屏障完整性的恢復(fù)[29]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注模型組大鼠通過(guò)伊文思藍(lán)（EB）染色呈現(xiàn)明顯可見的藍(lán)色，再灌注6 h 可發(fā)現(xiàn)EB 含量顯著升高，并且在24 h 達(dá)到峰值；給予烏司他丁后腦組織中EB 染色面積明顯減小，說(shuō)明烏司他丁顯著降低了大鼠腦缺血再灌注損傷中血腦屏障的通透性[30]。綜上，烏司他丁可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、降低炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激以及改善血腦屏障的通透性來(lái)發(fā)揮腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1.4 烏司他丁與心肌缺血再灌注損傷

心肌缺血再灌注損傷是由再灌注治療導(dǎo)致的急性心肌梗死。與其他類型的缺血再灌注損傷類似，氧自由基的損傷、炎癥因子的活化釋放及細(xì)胞凋亡損傷等機(jī)制皆會(huì)導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生[31]。研究表明，ERK 信號(hào)傳導(dǎo)途徑在心肌缺血再灌注引起的損傷中表現(xiàn)出保護(hù)性作用，其主要機(jī)制包括激活抗凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑和抑制促凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑。烏司他丁（2.5×103U·kg-1）通過(guò)降低炎癥因子的表達(dá)，激活p-ERK 的表達(dá)并抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而有效地緩解心肌缺血再灌注損傷[32]。同為MAPK 家族的p38/JNK，在烏司他丁治療心肌缺血再灌注損傷中也起著重要的作用。烏司他丁（1×104U·kg-1）可通過(guò)下調(diào)p38 和JNK 導(dǎo)致凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)而提高Bcl-2 水平，并且使Bax和caspase-3 水平下降[33]。因此，上述途徑的下調(diào)可能有助于抑制心肌缺血再灌注損傷中細(xì)胞的凋亡。另有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明烏司他丁改善了區(qū)域缺血再灌注損傷后的心功能和降低梗死面積大小可能是通過(guò)抑制MPO 活性和降低TNF-α的表達(dá)有關(guān)[34]。自噬在心肌缺血再灌注損傷中也較為重要。烏司他丁的預(yù)處理可以使小鼠心肌梗死面積減少，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)降低，此外，烏司他?。?×104U·kg-1）上調(diào)了p-Akt、p-mTOR 和p-P70S6K 蛋白表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，在烏司他丁治療前30 min使用mTOR 抑制劑雷帕霉素處理細(xì)胞，可使細(xì)胞活力增加，乳酸脫氫酶表達(dá)降低[35]。由此可以發(fā)現(xiàn)烏司他丁通過(guò)mTOR 激活調(diào)節(jié)自噬，對(duì)心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

1.5 烏司他丁與腎臟缺血再灌注損傷

腎臟缺血再灌注損傷通常會(huì)引起急性腎損傷、腎衰竭等多種腎臟相關(guān)疾病，因此治療腎臟缺血再灌注損傷是減少腎臟疾病的重要舉措。在腎臟缺血再灌注損傷期間，烏司他丁可以顯著降低尿素氮和肌酐水平，且TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)降低等[36]。細(xì)胞黏附分子的活化，可以通過(guò)激活多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)啟動(dòng)加劇細(xì)胞炎癥的發(fā)生[37]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷大鼠基礎(chǔ)腎臟功能損傷指標(biāo)皆有所上升，且對(duì)體內(nèi)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達(dá)的檢測(cè)能夠發(fā)現(xiàn)，隨著對(duì)大鼠再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，ICAM-1 表達(dá)也逐漸增加。證明了ICAM-1 在腎缺血再灌注損傷中至關(guān)重要，烏司他?。?.25×104U·kg-1）可顯著抑制缺血再灌注損傷后各個(gè)階段ICAM-1 表達(dá)的升高，對(duì)腎缺血再灌注損傷有一定程度的保護(hù)作用[38-39]。實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)造模組和給藥組大鼠體內(nèi)ATP，細(xì)胞內(nèi)pH（pHi）和細(xì)胞內(nèi)鈉（Nai）的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)造模組的pHi 值呈現(xiàn)出嚴(yán)重的酸中毒，給予烏司他?。?×104U·kg-1）后能較快地恢復(fù)ATP 的供應(yīng)，且Nai 的恢復(fù)比對(duì)照組更早[40]。另外，觀察腎小管超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，烏司他丁給藥后能顯著減輕線粒體膜和嵴的腫脹程度，且跨細(xì)胞鈉梯度得以恢復(fù)[41]，表明烏司他丁可能在缺血期間保護(hù)線粒體構(gòu)象，并促進(jìn)再灌注后離子泵的功能恢復(fù)。研究通過(guò)對(duì)缺血再灌注期間腎皮質(zhì)和髓質(zhì)組織氧分壓的測(cè)定來(lái)驗(yàn)證烏司他丁是否對(duì)腎臟缺血再灌注有保護(hù)作用，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，烏司他丁低劑量組和高劑量組的值完全恢復(fù)到缺血前的值，且各組之間的心肺參數(shù)沒(méi)有差異[42]。說(shuō)明烏司他丁改善了再灌注后的腎臟氧合而沒(méi)有改變心肺參數(shù)，從而起到對(duì)腎臟的保護(hù)作用。因此，烏司他丁能夠?qū)δI臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，但其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步的論證。

2 總結(jié)與展望

缺血再灌注損傷作為嚴(yán)重的生理疾病，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。烏司他丁能夠通過(guò)多種調(diào)控途徑治療器官的缺血再灌注損傷，總結(jié)如表1所示。

表1 烏司他丁治療器官缺血再灌注損傷的劑量及調(diào)控機(jī)制匯總Tab 1 Dose and regulation mechanism of ulinastatin for organ ischemia-reperfusion injury

根據(jù)目前的研究可知，TNF-α和IL-6 等促炎細(xì)胞因子水平升高導(dǎo)致缺血再灌注損傷的產(chǎn)生，MAPK和NF-κB 等分子信號(hào)通路介導(dǎo)了缺血再灌注損傷過(guò)程中的炎癥和氧化應(yīng)激，細(xì)胞的凋亡和自噬的發(fā)生在缺血再灌注損傷中亦較為常見。烏司他丁通過(guò)降低TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子而抑制炎癥反應(yīng)。在減輕炎癥的信號(hào)通路機(jī)制方面，烏司他丁通過(guò)抑制TLR4、NF-κB、HMGB1 等分子通路發(fā)揮保護(hù)作用。另外，烏司他丁通過(guò)上調(diào)Bcl-2、下調(diào)caspase 和Bax 抑制缺血再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡，下調(diào)p38 和JNK 信號(hào)通路的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。本文系統(tǒng)性地匯總了烏司他丁對(duì)于缺血再灌注損傷的不同保護(hù)機(jī)制，如抑制炎癥反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞的凋亡等。每一種作用機(jī)制都可以通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)，形成一個(gè)巨大的藥理學(xué)機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同劑量下烏司他丁對(duì)器官缺血再灌注損傷的作用機(jī)制不同，這對(duì)臨床中不同器官的損傷治療提供了劑量的參考，用藥時(shí)應(yīng)酌情考慮劑量因素的影響。另外，研究也多涉及烏司他丁的聯(lián)合用藥對(duì)于缺血再灌注損傷的治療，這為缺血再灌注損傷提供了新的治療思路。盡管目前烏司他丁對(duì)器官缺血再灌注損傷的研究已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題需進(jìn)一步的思考和解決。從目前的研究資料來(lái)看，烏司他丁對(duì)于腎、肺等器官的研究尚不深入，相關(guān)機(jī)制研究較少。而且，目前大部分研究仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，臨床研究較為缺乏。另外，已有研究表明絲氨酸蛋白酶抑制劑可以通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞釋放出來(lái)的絲氨酸蛋白酶來(lái)降低炎癥反應(yīng)，而烏司他丁作為絲氨酸蛋白酶抑制劑，通過(guò)維持酶的平衡來(lái)緩解缺血再灌注損傷的報(bào)道較為缺乏，這也為以后烏司他丁更為深入的研究提供了思路和方向。因此，烏司他丁對(duì)缺血再灌注損傷的治療保護(hù)的機(jī)制研究還有很長(zhǎng)的路要走，需要更多科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探索和證明。然而，不可否認(rèn)的是，烏司他丁是一種非常有前景的藥物，有望在器官缺血再灌注損傷的臨床治療方面發(fā)揮重大作用。