毛菊苣子-毛菊苣根配伍的體外抗肝纖維化作用研究

阿達來提·木合塔爾，臧薇，李茜，趙耀，王楊靜楠，楊建華，胡君萍*（. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 83007；. 河北廊坊市藥品檢驗所，河北 廊坊 065000；3. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054）

《中國藥典》2020年版收載的菊苣是指菊科菊苣屬植物菊苣（Cichorium intybus）或者毛菊苣（Cichorium glandulosum）的干燥地上部分或根，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫作用[1]。毛菊苣廣泛分布于中國新疆，在新疆地區(qū)其根、種子、全草都可入藥[2]。毛菊苣根具有保肝、降血糖和降血脂等作用，毛菊苣種子主治濕熱性疾病，如肝臟阻塞、濕熱性腎炎、小便不利和全身性水腫等，其黃酮類成分還具有保肝、抗氧化和抗菌作用[3]。毛菊苣根和種子在許多成方制劑中也有應(yīng)用，其用藥配伍也有獨特之處，如毛菊苣子-根在護肝布祖熱方、炎消迪娜爾方、復(fù)方木尼孜其方中的比例分別為2∶1、1∶2 和1∶1，這種同一植物不同藥用部位以不同比例配伍使用在維吾方劑中較為常見[4]。研究顯示，毛菊苣子-毛菊苣根配伍后的保肝護肝作用優(yōu)于單一藥材，不同配伍比例的肝保護作用亦不同[5-7]；課題組進一步研究發(fā)現(xiàn)，毛菊苣根和種子中所含化學(xué)成分及微量元素存在較大差異[8-9]，但兩者配伍組方治療肝病的規(guī)律和機制尚不明確。因此本文探討了毛菊苣子-毛菊苣根配伍前后體外抗肝纖維化活性及其機制，以期為揭示毛菊苣在護肝方劑中配伍規(guī)律提供數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

毛菊苣種子（批號：20171201）、毛菊苣根（批號：20170704）（新疆和田縣中醫(yī)院）由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院胡君萍教授鑒定為毛菊苣Cichorium glandulosum的干燥種子和根。

1.2 細胞

大鼠肝星狀細胞（HSC-T6 細胞）（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究院惠贈）。

1.3 試藥

1640 培養(yǎng)基（批號：0013819）、胎牛血清（批號：1922693）、0.25%胰酶-EDTA 消化液（批號：0052419）（BI 公司）；磷酸緩沖鹽溶液（PBS，北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：N50807）；雙抗（青霉素-鏈霉素）（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：N20401）；CCK-8 試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AI08014117）；碘化丙啶/核糖核酸酶染色溶液（批號：9183478）、FITC 偶聯(lián)Annexin-V 凋亡檢測試劑盒（批號：9154818）（比歐聯(lián)科供應(yīng)鏈管理有限公司）；PDGF-BB（PeproTech，批號：101704）；大鼠透明質(zhì)酸檢測試劑盒（批號：05/2019）、大鼠Ⅳ型膠原檢測試劑盒、大鼠層粘連蛋白檢測試劑盒（上海酶聯(lián)）；大鼠Ⅲ型前膠原檢測試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司）；RIPA 細胞裂解液、BCA 蛋白測定試劑盒、蛋白上樣緩沖液、SDSPAGE 凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；甘氨酸（批號：56-40-6）、SDS（批號：151-21-3）、Tris（批號：77-86-1）、瓊脂糖（批號：1183GR500）（德國Biofroxx 公司）；脫脂奶粉（美國BD 公司，批號：N/A）；一抗稀釋液（Biosharp 生物科技有限公司，批號：210217）；溴化乙錠（批號：D0129）、焦炭酸二乙酯（批號：D1135）、Loading buffer（批號：D0214）、DNA marker DL2000（批號：D0237）（碧云天生物技術(shù)研究所）；熒光定量試劑盒[TB Green RT-PCR Kit II 寶生物工程（大連）有限公司]；辣根過氧化酶標(biāo)記二抗、JNK（美國CST 公司）；彩色蛋白預(yù)染marker（10 ～180 kDa）（賽默飛世爾科技有限公司）；PVDF 膜（美國Milipore 公司）；ECL 試劑盒（Biosharp 生物科技有限公司）；DAB 顯色試劑盒、通用SP 試劑盒、檸檬酸鹽、PBS 緩沖鹽、中性樹膠（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.4 儀器

DMI6000B 型倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；Galaxy-170R 型CO2培養(yǎng)箱（英國New Brunswick 公司）；KS18 型超凈工作臺、MuLtiskan-G0 型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；KG-SX-500 型高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY 公司）；EPICS-XL/XL-MCL流式細胞儀（美國Beckmann 公司）；MuLtiskan全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple 公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell 系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；BCD-238WF 型超低溫冰箱（中國海爾集團）。

2 方法

2.1 樣品制備

取毛菊苣種子（S 組）、根（R 組）以及兩者配伍1∶1（S1R1 組）、1∶2（S1R2 組）和2∶1（S2R1 組）藥材分別以10 倍量蒸餾水煎煮2 次，每次1.5 h，合并煎煮液，減壓濃縮，得到干燥浸膏，具體信息見表1。將浸膏研磨成細粉，分別稱取0.25 g，用3 mL 的1640 完全培養(yǎng)基溶解，再用0.22 μm 的微孔濾膜過濾除菌，使其成為終濃度為83 mg·mL-1的樣品母液，置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 毛菊苣樣品分組Tab 1 Samples of Cichorium glandulosum at different compatibilities seed and root

2.2 細胞培養(yǎng)及體外肝纖維化細胞模型的建立

將HSC-T6 細胞用1640 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HSC-T6 細胞，以5×104個·mL-1接種于96 孔板內(nèi)，待細胞24 h 貼壁后，吸棄上清液，設(shè)空白組（完全培養(yǎng)基），對照組（含細胞以及1640 完全培養(yǎng)基），不同濃度PDGF-BB 干預(yù)組（將PDGF-BB 用1640 完全培養(yǎng)基進行溶解使其終質(zhì)量濃度為5、25、125、250 ng·mL-1），每孔加入100 μL 的PDGF-BB。每組設(shè)3 個復(fù)孔。置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 和48 h 后，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入新鮮的1640 完全培養(yǎng)基，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，放回培養(yǎng)箱避光孵育1 h 后，在酶標(biāo)儀于450 nm 下測定各孔OD值，取其平均值計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝[（OD給藥組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）]×100%。

2.3 不同配比藥材對HSC-T6 細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的HSC-T6 細胞，以5×104個·mL-1接種于96 孔板內(nèi)，設(shè)空白組（1640 完全培養(yǎng)基）、對照組（不加任何藥物的HSC-T6 細胞組）、模型組（含25 ng·mL-1的PDGF-BB 培養(yǎng)液）、不同比例藥材水提液組（含25 ng·mL-1的PDGF-BB 培養(yǎng)液和不同配比藥材），每組設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL 的CCK-8試劑，放回培養(yǎng)箱避光孵育1 h 后，在全波長酶標(biāo)儀上于450 nm 波長處測定每孔OD值，計算細胞的生長抑制率。抑制率（%）＝[（OD對照組-OD加藥組）/（OD對照組-OD空白組）]×100%。

2.4 不同配比藥材對HSC-T6 細胞肝纖維化的影響

取對數(shù)生長期的HSC-T6 細胞以5×104個·mL-1的密度接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，設(shè)空白組（1640 完全培養(yǎng)基）、對照組（不加任何藥物的HSC-T6 細胞組）、模型組（含25 ng·mL-1的PDGF-BB 培養(yǎng)液）、不同比例藥材水提液組（含25 ng·mL-1的PDGF-BB 培養(yǎng)液和不同配比藥材），每組設(shè)3 個復(fù)孔，放入5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 后，取出96 孔板，吸出上清液，用試劑盒測定細胞上清液中透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）等肝纖維化指標(biāo)。

2.5 不同配比藥材對HSC-T6 細胞凋亡的影響

將對數(shù)生長期的HSC-T6 細胞，調(diào)整濃度為5×105個·mL-1，接種于6 孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，吸棄上清液，實驗組分別加入含25 ng·mL-1的PDGF-BB 的不同配伍比例藥材培養(yǎng)液2 mL，對照組加入不含藥物的完全培養(yǎng)液2 mL，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 后，收集細胞，實驗組細胞加入100 μL Binding Buffer 和FITC 標(biāo)記的Annexin-V 和PI 各5 μL，室溫避光反應(yīng)5 min后加入400 μL Binding Buffer，濾膜過濾，上流式細胞儀檢測。

2.6 不同配比藥材對HSC-T6 細胞相關(guān)蛋白表達的影響

采用Western blot 法檢測各組細胞上清液中Ras、ERK1、ERK2、C-fos、JNK 蛋白的表達。將細胞蛋白裂解后，BCA 法進行蛋白定量。待測樣品蛋白上樣總量為30 μg，上樣體積控制在4 ～8 μL，預(yù)染蛋白marker 的上樣量為2 μL，用于分辨蛋白分子量條帶。樣品經(jīng)過SDS-PAGE 垂直電泳后進行PVDF 膜凝膠轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)膜成功后浸入5%脫脂奶粉的封閉液中60 min，1×TBST 清洗3 次，每次5 min，加入一抗孵育過夜。次日用1×TBST 清洗3 次，每次15 min，加入辣根酶標(biāo)記二抗（1∶2000 稀釋），室溫孵育60 min。二抗孵育結(jié)束后，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中曝光，使用Image J 軟件對掃描后的圖像進行分析，通過對目標(biāo)條帶積分來計算積分下面積，并與內(nèi)參β-actin 進行比較，結(jié)果以相對表達值表示。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先經(jīng)方差齊性檢驗，若方差齊再進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 模型建立的濃度和時間篩選

PDGF-BB 對HSC-T6 細胞干預(yù)之后，采用CCK-8 法分別于24 h 和48 h 檢測細胞增殖情況。結(jié)果顯示，加入PDGF-BB 24 h 后，各組細胞存活率隨著PDGF-BB 濃度增加而增加；干預(yù)48 h 后，各組細胞雖然呈現(xiàn)增殖，但增殖率較低，且無劑量依賴性。故選擇體外PDGF-BB 誘導(dǎo)HSC-T6 細胞肝纖維化模型建立的劑量和時間分別為25 ng·mL-1和24 h。結(jié)果見圖1。

圖1 不同造模濃度和時間下HSC-T6 的細胞存活率（ ±s，n ＝3）Fig 1 Survival rate of HSC-T6 cells induced by different PDGF-BB concentrations and time（ ±s，n ＝3）

3.2 不同配比藥材對HSC-T6 細胞增殖的影響

由圖2可知，與模型組相比，給予不同配比藥物水提液干預(yù)對細胞增殖均有不同程度的抑制作用（P＜0.01），R 組的抑制率高于S 組（P＜0.01），說明毛菊苣根對HSC-T6 細胞增殖的抑制活性強于種子。與S 組相比，S1R1 組、S1R2 組、S2R1 組的抑制率也較高（P＜0.01），說明配伍后藥物的細胞增殖抑制作用強于單味藥種子。與R 組相比，S1R2 組和S2R1 組對細胞增殖抑制率較高（P＜0.01）。

圖2 不同配伍比例藥材對HSC-T6 細胞增殖的影響（ ±s，n ＝3）Fig 2 Effect of different compatibility drug ratios on the proliferation of HSC-T6 cells（ ±s，n ＝3）

3.3 不同配比藥材對HSC-T6 細胞肝纖維化指標(biāo)的影響

與對照組比較，模型組細胞上清液中透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）等肝纖維化指標(biāo)均顯著增高（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組肝纖維化指標(biāo)均有顯著性降低（P＜0.01），其中，S1R2 組和S2R1 組降幅更大，說明毛菊苣種子、根以及兩者配伍后均具有體外抗肝纖維化作用，且配伍后作用更強。結(jié)果見圖3。

圖3 不同配伍比例藥材對HSC-T6 細胞肝纖維化指標(biāo)的影響（x ±s，n ＝3）Fig 3 Effect of different compatibility drug ratios on the liver fibrosis indexes for HSC-T6 cells（x ±s，n ＝3）

3.4 不同配比藥材對HSC-T6 細胞凋亡的影響

與對照組相比，模型組給予PDGF-BB 干預(yù)后，其凋亡率降低（P＜0.01）。與模型組相比，給予不同配伍比例藥材水提液后，其凋亡率均有所增加，其中，S1R2 組的凋亡率最高[（46.8±0.15）%]，其次為S2R1 組，S 組的凋亡率最低[（14.8±0.35）%]。結(jié)果圖4。

圖4 不同配伍比例藥材對HSC-T6 細胞增殖凋亡的影響Fig 4 Apoptosis Effect of different compatibility drug ratios on the proliferation and apoptosis of HSC-T6 cells

3.5 不同配比藥材對Ras、ERK1、ERK2、C-fos、JNK 蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組Ras、ERK1、ERK2、C-fos、JNK 的表達較強（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組Ras、ERK1、ERK2、C-fos、JNK表達均有所下降（P＜0.05）；其中，S1R2 組和S2R1 組下降更明顯；R 組比S 組下調(diào)蛋白表達更為明顯，說明毛菊苣種子抑制蛋白表達的能力弱于毛菊苣根。結(jié)果見圖5。

圖5 不同配伍比例藥材水提液對ERK/Ras 信號通路中關(guān)鍵蛋白表達量的影響Fig 5 Effect of different compatibility of drug water extract on the protein expression in the ERK/Ras signaling pathway of HSC-T6 cells

4 討論

HSCs 是位于肝間質(zhì)的肝特異性細胞，也是肝纖維化的主要細胞類型[10]。各種病因（如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎等）導(dǎo)致肝臟發(fā)生損傷時，靜息態(tài)的HSC 活化并轉(zhuǎn)分化為促進瘢痕形成的肌成纖維細胞，并分泌細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）促進損傷修復(fù)，但過度的ECM 累積會導(dǎo)致肝臟纖維化[11]。血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）是一種促進HSC 活化的較強的有絲分裂因子，A 鏈和B 鏈組成PDGF 的3 種形式， 即PDGF-AA、PDGF-BB 和PDGF-AB。 有研究表明，PDGF-BB 是最強的刺激HSC 活化增殖的因子[12]。故本實驗中采用PDGF-BB 誘導(dǎo)大鼠HSC-T6 細胞活化增殖建立體外肝纖維化模型。

ECM 主要由HSC 活化產(chǎn)生，該活化過程以及肝纖維化的形成由多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與形成[13]。PDGF-BB 在肝纖維化過程中刺激Ras/Raf-1/MEK/ERK 級聯(lián)反應(yīng)。在MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，ERK 通路是較為經(jīng)典的一條，該途徑對細胞形態(tài)、遷移、代謝、增殖、分化和存活具有重要的調(diào)控作用，ERK1/2 可以通過磷酸化被一系列細胞生長因子激活[14-15]。激活的激酶有助于調(diào)節(jié)HSC 的增殖和ECM 的產(chǎn)生。此外，在靜止的或激活的HSC 中抑制JNK 活性可以阻止HSC激活。故本研究采用免疫印跡法檢測不同配伍比例毛菊苣子-毛菊苣根對PDGF-BB 誘導(dǎo)增殖的HSC-T6 細胞ERK/Ras 通路中Ras、ERK1/2、C-fos、JNK 相關(guān)蛋白的表達情況，結(jié)果顯示毛菊苣子-毛菊苣根在配伍前后抗肝纖維化作用機制與下調(diào)Ras、ERK1/2、C-fos、JNK 相關(guān)蛋白的表達和抑制MAPK 激活有關(guān)，并且配伍后對蛋白表達的影響也更為顯著。

在中醫(yī)藥領(lǐng)域，經(jīng)過長期的臨床實踐和循證醫(yī)學(xué)研究，已逐步建立起以辨證論治為特征的抗肝纖維化治療方案，并產(chǎn)生了許多抗肝纖維化中成藥和經(jīng)驗方，如扶正化瘀片（膠囊）、復(fù)方鱉甲軟肝片、安絡(luò)化纖丸、養(yǎng)血柔肝丸（湯）等[16]。在一些新疆地產(chǎn)民族藥方中，主藥均包含不同比例的毛菊苣子和毛菊苣根，但其功效不盡相同，如護肝布祖熱顆粒和炎消迪娜爾糖漿臨床用于治療肝病，而復(fù)方木尼孜其顆粒則用于調(diào)節(jié)體液及氣質(zhì)[4]。毛菊苣子和根不同配伍比例與臨床適應(yīng)證是否存在相關(guān)性值得關(guān)注。本研究結(jié)合肝纖維化四項指標(biāo)和細胞增殖、凋亡實驗結(jié)果綜合分析發(fā)現(xiàn)，毛菊苣子-毛菊苣根以1∶2 和2∶1 配伍后的抗肝纖維化活性強于單味藥材，推測配伍后藥材中的化學(xué)成分發(fā)生了變化，故其配伍的化學(xué)機制值得進一步研究。