流式細(xì)胞儀在環(huán)境微生物學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用與實踐

翟利芳， 展思輝， 王 忠

（南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300350）

0 引 言

流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，將激光技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、流體力學(xué)及光電測量技術(shù)等綜合于一體的大型精密儀器［1-2］，其可對高速直線流動的細(xì)胞或者微生物顆粒進(jìn)行快速測定與分析，具有檢測速度快、數(shù)據(jù)采集量大，操作簡單快捷等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物學(xué)、微生物學(xué)等眾多研究領(lǐng)域［3-7］。其中，在微生物學(xué)領(lǐng)域，流式細(xì)胞儀可以快速檢測環(huán)境中各種細(xì)菌、病毒顆粒、特殊細(xì)菌、藻細(xì)胞及水中微生物活體、群落結(jié)構(gòu)等，這些都是環(huán)境微生物學(xué)實驗研究的對象［8-9］，因此將流式細(xì)胞儀應(yīng)用到環(huán)境微生物學(xué)實驗教學(xué)中對學(xué)生科研素質(zhì)的培養(yǎng)及教學(xué)質(zhì)量的提升至關(guān)重要。課題組將流式細(xì)胞技術(shù)引入環(huán)境微生物學(xué)實驗教學(xué)過程對環(huán)境微生物進(jìn)行測定，使學(xué)生利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)探究解決環(huán)境污染問題的有效途徑，極大激發(fā)學(xué)生對環(huán)保綜合探究性實驗的興趣。

1 流式細(xì)胞儀工作原理與特點

1.1 工作原理

流式細(xì)胞儀是用以測量在高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色或自帶熒光特性的細(xì)胞或顆粒產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對細(xì)胞或顆粒的物理、生理、免疫、分子生物學(xué)形狀及功能狀態(tài)進(jìn)行定性或定量檢測的一種現(xiàn)代分析儀器［10］。分析型流式細(xì)胞儀主要由液流系統(tǒng)、激光光源及光學(xué)系統(tǒng)、信號檢測數(shù)據(jù)獲取分析及電子系統(tǒng)共3 個部分組成。

將待測單細(xì)胞懸液經(jīng)不同熒光物質(zhì)染色，通過液壓系統(tǒng)送入流動室，細(xì)胞在鞘液的包裹下形成單行排列的細(xì)胞流，以一定流速經(jīng)過激光聚焦區(qū)。在激光束的照射下，細(xì)胞或顆粒產(chǎn)生特定的散射光和熒光信號，激發(fā)產(chǎn)生的信號通過波長選擇性濾光片后，經(jīng)熒光探測器接收并轉(zhuǎn)化為電信號，最終通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為可被計算機(jī)識別的數(shù)字信號。計算機(jī)通過相應(yīng)的軟件對采集的數(shù)字信號進(jìn)行分析處理，輸出散點、密度或等高線圖及數(shù)據(jù)表格等形式［11］?；竟ぷ髟砣鐖D1 所示。

圖1 基本工作原理

1.2 儀器特點

教學(xué)中心所配備流式細(xì)胞儀型號為Accuri C6 Plus，該儀器配有488 nm、640 nm 兩個激光器；4 個光電倍增管（PMT）檢測器，檢測器呈X 環(huán)抱型設(shè)計；根據(jù)流動動力學(xué)聚焦原理實現(xiàn)5 ～40 μm 液流寬度可調(diào)，負(fù)壓上樣。該儀器日常使用的應(yīng)用范圍非常廣泛，遍布免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)以及癌癥研究、水生物研究、生物工藝等，具有以下功能和特點：

（1）創(chuàng)新的直觀軟件操作系統(tǒng)CFlow，可自動進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取及圈門等數(shù)據(jù)分析。

（2）跨越7 個數(shù)量級的超寬動態(tài)范圍，無需調(diào)節(jié)檢測器電壓。

（3）配備BD CSampler Plus 自動進(jìn)樣器提供可靠、易用自動化操作，支持48 孔板、96 孔板以及標(biāo)準(zhǔn)φ12 mm×75 mm管的24 管架。

1.3 上機(jī)培訓(xùn)

實驗教學(xué)中將環(huán)境微生物學(xué)實驗教學(xué)內(nèi)容與流式細(xì)胞儀應(yīng)用結(jié)合起來，從流式細(xì)胞儀對環(huán)境水樣中死/活細(xì)菌進(jìn)行鑒別并計數(shù)、微生物的分離與鑒定、微生物生長的測定、微生物生化特征測定等方面的應(yīng)用進(jìn)行講解。主要包括4 個方面的內(nèi)容：

（1）結(jié)合實際儀器構(gòu)造講解流式細(xì)胞儀的組成，由液流、光學(xué)及電學(xué)系統(tǒng)3 個部分組成。

（2）逐一開啟穩(wěn)壓電源、儀器開關(guān)及計算機(jī)開關(guān)進(jìn)入開機(jī)程序，強(qiáng)調(diào)開/關(guān)機(jī)之前、過程中及儀器日常維護(hù)的注意事項。

（3）運行CFlow軟件，講解軟件界面組成、樣品檢測參數(shù)設(shè)置及常用術(shù)語、熒光補(bǔ)償原理及調(diào)節(jié)、檢測數(shù)據(jù)結(jié)果圖示及表格分析。

（4）以細(xì)胞計數(shù)實驗為例，藻/菌實驗樣品上機(jī)演示流式細(xì)胞儀在環(huán)境微生物檢測中應(yīng)用檢測方法。

通過上機(jī)培訓(xùn)環(huán)節(jié)，學(xué)生在掌握流式細(xì)胞儀基本原理的基礎(chǔ)上加深對儀器構(gòu)造的認(rèn)識，熟練掌握儀器使用方法，為后續(xù)實驗操作環(huán)節(jié)奠定基礎(chǔ)。

2 抗生素對銅綠微囊藻生長影響的測定

環(huán)境微生物學(xué)以微生物學(xué)的理論與技術(shù)為基礎(chǔ)，研究有關(guān)環(huán)境現(xiàn)象、環(huán)境質(zhì)量及環(huán)境問題，實驗對象涉及環(huán)境中各種菌、藻等微生物，皆可應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測［12-13］。課題組設(shè)計了“抗生素對銅綠微囊藻生長的影響測定實驗”，利用流式細(xì)胞儀測定某種抗生素進(jìn)入水體對藻類生物量的變化影響。通過流式細(xì)胞儀和血球計數(shù)板對經(jīng)過染毒處理的微藻進(jìn)行計數(shù)，評價某種抗生素對藻類生長影響，同時驗證流式細(xì)胞儀是否能夠比血球計數(shù)板更加準(zhǔn)確地對水體中微藻進(jìn)行計數(shù)。

2.1 實驗原理

近年來，因抗生素的濫用所造成的污染已經(jīng)成為主要環(huán)境問題之一，引發(fā)的生態(tài)安全和健康問題引起人們的普遍關(guān)注。藻類是最簡單的光合營養(yǎng)有機(jī)體，是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者。在一定環(huán)境條件下，如果某種有毒有害化學(xué)物質(zhì)及其復(fù)合污染物進(jìn)入水體，藻類的生命活動就會受到影響，生物量就會發(fā)生改變。通過測定藻類數(shù)量的變化，就可以評價抗生素對藻類生長的影響及對整個水生生態(tài)系統(tǒng)的綜合環(huán)境效應(yīng)。

銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa），屬于藍(lán)藻細(xì)菌，在環(huán)境中占據(jù)重要的生態(tài)位置，是水華爆發(fā)的主要藻類之一，故將其作為探究抗生素對環(huán)境中藻類影響的實驗藻種。以培養(yǎng)一定時間的銅綠微囊藻為對照，在完全相同培養(yǎng)條件下，加入一定濃度的抗生素污染物后，定時、定點取樣，直接測定水中藻濃度的變化。

2.2 實驗儀器與試劑

實驗儀器：電子天平、pH 計、光照培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、血球計數(shù)板、流式細(xì)胞儀、紫外可見分光光度計、滅菌鍋、單人凈化工作臺、光學(xué)顯微鏡等。

實驗試劑：四環(huán)素、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·H2O等配置培養(yǎng)基所需試劑等。

2.3 實驗步驟

（1）培養(yǎng)液的配制。將儲存母液混合、稀釋，按照BG11培養(yǎng)基［14］進(jìn)行配置，按一定體積分裝在各個三角瓶中經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min。吸取一定體積母液加到滅菌后的培養(yǎng)液中，搖勻，使成所需濃度。

（2）藻種預(yù)培養(yǎng)。將所得銅綠微囊藻藻種移至盛有培養(yǎng)基的三角瓶中，在實驗所設(shè)溫度和光強(qiáng)下，通氣或在三角瓶內(nèi)保留足夠空間培養(yǎng)，隔96 h 移種1 次，反復(fù)2 ～3 次，使藻種生長達(dá)到同步生長階段，以此作為實驗藻種。

（3）接種培養(yǎng)。將達(dá)到同步生長的藻種培養(yǎng)液充分搖勻，吸取一定體積加至各組培養(yǎng)液中。一般初始藻種濃度可采用（1 ～5）×106個/mL，接種量控制在10% ～20%。

（4）實驗濃度的選擇。根據(jù)四環(huán)素對銅綠微囊藻生長影響的半數(shù)有效濃度（EC50）范圍［15-16］，設(shè)定對銅綠微囊藻96 h的EC50約為10 mg/L。設(shè)計藻液中抗生素濃度梯度為0、0.1、0.5、1、2、5、10、20 mg/L，各濃度組均設(shè)3 個平行樣。

（5）培養(yǎng)條件。在（24 ±2）℃，白色熒光燈光照下培養(yǎng)，光強(qiáng)（2 000 ±200）lx。三角瓶可放置搖床上震蕩（110 次/min）以便空氣交換。光暗比為12 h ∶12 h。

（6）生長測定。在藻類毒性實驗中，應(yīng)定時取樣測定藻類的生長情況，一般為24 h取樣一次。在96 h取樣測定污染物對藻類生長影響的EC50值，即與對照組相比，生長率下降50%的污染物濃度。

2.4 測試方法

本實驗采用血球計數(shù)板和流式細(xì)胞儀兩種測定方法對實驗中銅綠微囊藻的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，進(jìn)而判斷四環(huán)素對銅綠微囊藻生長的影響。

（1）血球計數(shù)板計數(shù)。取1 mL的微藻懸液于離心管中，加4%的戊二醛160 μL，靜置5 min；試驗采用25 ×16 格的血球計數(shù)板在顯微鏡下記錄右上、右下、左下、左上、中間5 個中號方塊中的微藻細(xì)胞數(shù)目。

（2）流式細(xì)胞儀計數(shù)。取0.5～1mL濃度在5×105～1×107個范圍內(nèi)的藻液，經(jīng)300目篩網(wǎng)過濾置于流式上樣管中；將上樣管置于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣針位置，設(shè)置參數(shù)：閾值設(shè)置80 000 on FSC-H，上樣時間30 s，高速進(jìn)樣；檢測。每一次進(jìn)樣速度重復(fù)3 次。

3 實驗結(jié)果分析

3.1 兩種測試方法結(jié)果對比

用血球計數(shù)板和流式細(xì)胞儀分別對同一濃度的微藻藻液進(jìn)行計數(shù)，觀察它們的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（見圖2）。兩種方法測定3 種不同濃度的微藻數(shù)量在平均值上相差不多，但從RSD（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）來看，血球計數(shù)板的RSD都在5%以上，樣品2 的測定結(jié)果RSD值高達(dá)9.8%。由此，可以看出采用血球計數(shù)板的方法易受操作細(xì)節(jié)及操作者主觀因素影響，精確性得不到保證，并且費時費力，不適用于大規(guī)模的細(xì)胞實驗；而流式細(xì)胞儀對不同濃度的微藻藻液RSD 都在2%以內(nèi)。由此可見，流式細(xì)胞儀比血球計數(shù)板的精確度高。

圖2 兩種測定方法精確度比較

3.2 四環(huán)素對微藻生長的影響

圖3所示為采用流式細(xì)胞儀分析技術(shù)測定的四環(huán)素對銅綠微囊藻生長抑制情況。由圖可見，隨著染毒時間的增加，四環(huán)素對銅綠微囊藻的抑制作用相應(yīng)增加，當(dāng)四環(huán)素濃度較高時這種趨勢更為明顯。低濃度處理（0.1 ～2 mg/L）時，四環(huán)素類抗生素對銅綠微囊藻生長影響很小，而高濃度處理（5 ～20 mg/L）時，其對銅綠微囊藻產(chǎn)生明顯的抑制作用。四環(huán)素濃度為20 mg/L，接觸時間為96 h時，其對銅綠微囊藻的最大抑制率達(dá)到了68.35%。由此可見，四環(huán)素對銅綠微囊藻的毒性濃度效應(yīng)非常明顯。

圖3 四環(huán)素對銅綠微囊藻生長抑制率的影響

4 結(jié) 語

流式細(xì)胞術(shù)作為一種新興儀器分析技術(shù)，在水環(huán)境微生物測定方面還處于發(fā)展階段，在環(huán)境微生物學(xué)實驗教學(xué)中引入該檢測技術(shù)是一次新的嘗試。流式細(xì)胞術(shù)的引入豐富了環(huán)境微生物學(xué)實驗教學(xué)內(nèi)容及方法，拓展學(xué)生實驗設(shè)計思維，不僅調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，而且大大提高了大型貴重儀器的利用率。流式細(xì)胞術(shù)在環(huán)境微生物學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用，實現(xiàn)了科研與教學(xué)的有機(jī)融合，使學(xué)生的探索與實踐能力得到顯著提升，使學(xué)生在很好掌握流式細(xì)胞術(shù)的基礎(chǔ)上可將其應(yīng)用到今后的科學(xué)研究中。