軟骨素裂解酶的研究進展

肖夢圓，武瑞赟，李平蘭

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，精準(zhǔn)營養(yǎng)與食品質(zhì)量重點實驗室，教育部功能乳品重點實驗室，北京 100083）

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺交替連接的帶負(fù)電荷的線性多糖[1]，具有多種生理活性，如治療骨關(guān)節(jié)炎、修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨、抗氧化、延緩衰老、抗凝血、抗血栓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤及增強免疫力等功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)[2?3]。由于CS 分子量和電荷密度較大，吸收率較低，極大地限制了其功效的發(fā)揮，研究發(fā)現(xiàn)降低CS 分子量后，可以明顯提高CS 的生物利用率[4]。

軟骨素裂解酶（chondroitinase，Chase）是一類可降解CS 等糖胺聚糖的裂解酶，可以制備高活性的低分子量CS，且本身也具有多種生物活性和藥用價值，如修復(fù)脊髓損傷、減輕腰椎間盤突出的癥狀、治療瘢痕疙瘩、抑制腫瘤發(fā)展以及治療弱視等[5]。Chase 來源于微生物，由產(chǎn)酶菌株發(fā)酵獲得，目前的研究主要集中于Chase 的基因克隆和重組表達(dá)方面。為了深入理解低分子量CS 和Chase 的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢，促進Chase 的進一步開發(fā)利用，本文介紹了CS及低分子量CS 的生物活性，Chase 的來源、種類、發(fā)酵生產(chǎn)、表征以及催化機制，歸納總結(jié)了Chase 重組表達(dá)和應(yīng)用方面的研究進展。

1 硫酸軟骨素簡介

糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）是一類由氨基己糖和己糖醛酸交替連接而成的直鏈多糖，包括硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、硫酸角質(zhì)素（keratan sulfate，KS）和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS），GAGs 在動物體內(nèi)通常以蛋白聚糖的形式存在[6]。作為GAGs 的主要種類，CS 是一類從動物組織中提取出的GAGs，廣泛存在于脊椎動物結(jié)締組織的細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中，如骨、軟骨、皮膚、韌帶和肌腱[7]，在保持關(guān)節(jié)軟骨的彈性、抗炎、止血、調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞黏附分化和增殖等生命活動中具有至關(guān)重要的作用[8]。CS 的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示[9]，以D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，GlcUA）和N-乙酰-D-半乳糖胺（N-acetyl-D-galactosamine，GalNAc）通過β-1,3 糖苷鍵連接為基本二糖單位，二糖單位之間通過β-1,4 糖苷鍵連接，分子量約10～100 kDa[10]。GlcUA 和GalNAc 殘基在不同位置都能攜帶不同數(shù)量的硫酸基團，根據(jù)硫酸化程度的不同，CS 分為多種類型，包括CS-A（GlcUAβ1-3GalNAc（4S））、CSC（GlcUAβ1-3GalNAc（6S））、CS-D（GlcUA（2S）β1-3GalNAc（6S））、CS-E（GlcUAβ1-3GalNAc（4S,6S））等。CS-B 又稱硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS），其二糖單位與CS-A 的二糖單位不同，為L-艾杜糖醛酸（L-iduronic acid，IdoUA）和GalNAc，IdoUA 和GalNAc 通過α-1,3 糖苷鍵連接，GalNAc 的4 位攜帶一個硫酸基團[11]。

圖1 硫酸軟骨素的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic unit of chondroitin sulfate

CS 具有多種生物活性，如修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨、抗氧化、延緩衰老、抗凝血、抗血栓、降血脂、抗動脈粥樣硬化及抗腫瘤等，但CS 的高分子量和高電荷密度，導(dǎo)致其生物利用率較低，限制了其生物功效的發(fā)揮。越來越多的證據(jù)表明，低分子量CS 具有黏度小、溶解性好、易吸收等優(yōu)點，可有效克服CS 生物利用率低的缺點。目前，低分子量CS 主要通過酸降解法、氧化降解法、超聲降解法、輻射降解法以及酶解法獲得[10]。酸降解法會將CS 的硫酸基團去除，從而影響其產(chǎn)物的生物活性；氧化降解法用到的氧化劑多為有毒試劑；超聲降解法和輻射降解法，要求較高級的實驗設(shè)備以及工藝較復(fù)雜。相比之下，酶解法具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、操作簡便、作用底物專一、產(chǎn)物分子量可控性高、過程無污染、對CS 的降解產(chǎn)物影響小的優(yōu)點，因此具有更高的性價比和優(yōu)勢[9]。Wang 等[12]從雞皮和軟骨組織中提取純化出CS 并酶解，發(fā)現(xiàn)酶解后低分子量的CS 對DPPH 的清除率和鐵離子還原能力顯著提高，也增強了Caco-2 細(xì)胞對鐵的吸收，其原因可能是CS 分子量降低和羥基基團數(shù)量增加。Li 等[13]比較了美鰩軟骨CS 降解前后的治療肥胖的效果發(fā)現(xiàn)，CS 可以抑制胰腺脂肪酶活性，減少腸道脂肪的吸收，較高分子量的CS 對脂肪酶的抑制活性高于較低分子量的CS；低分子量CS會影響脂肪細(xì)胞的增殖、分化和代謝，改善肥胖，抑制體重、肝臟重量和脂肪組織重量的增加，維持較低的食物消耗，抑制甘油三酯的腸道吸收，調(diào)節(jié)血清內(nèi)毒素水平。

2 軟骨素裂解酶

2.1 軟骨素裂解酶的催化機制

Chase 是一類來源于微生物的，能將硫酸軟骨素、軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖和寡糖的裂解酶。Chase 作用于GlcUA 和GalNAc二糖單位之間的β-1,4 糖苷鍵，通過β-消除的方式將CS 裂解為不飽和二糖及寡糖，并在產(chǎn)物的非還原端形成4,5-不飽和糖醛酸，裂解機理如圖2 所示[14]。Chase 降解CS 的裂解過程一般包括三個階段：a.中和位于糖醛酸上的羧基，降低pKa 以穩(wěn)定隨后形成的烯醇式陰離子中間體；b.廣義堿奪去位于糖醛酸C-5 處的質(zhì)子，形成底物的共軛堿碳負(fù)離子；c.從羧基發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，1,4 糖苷鍵斷裂，離去基團離去，在糖醛酸C4 和C5 之間形成雙鍵[15]。

圖2 軟骨素裂解酶的催化機制Fig.2 The catalytic mechanism of chondroitinase by elimination cleavage

2.2 軟骨素裂解酶的種類和來源

Chase 根據(jù)酶切方式可分為內(nèi)切型Chase 和外切型Chase，內(nèi)切型Chase 隨機斷裂CS 多糖鏈內(nèi)部的β-1,4 糖苷鍵，先生成分子質(zhì)量較大的寡糖，再生成分子質(zhì)量較小的寡糖，最后生成二糖；外切型Chase 從CS 多糖鏈的末端依次斷裂β-1,4 糖苷鍵并釋放不飽和二糖[16]。來源于肝素黃桿菌的Chase 表現(xiàn)內(nèi)切活性，而來源于金黃節(jié)桿菌的Chase 為外切型酶。Lunin 等[17]通過比對兩者的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)外切型Chase（金黃節(jié)桿菌）在N 端有兩段氨基酸的插入，這兩段氨基酸形成了含有α-螺旋的環(huán)，這些環(huán)將開放的裂縫轉(zhuǎn)變?yōu)樯钋唬钋坏拇笮∠拗屏薈S 的結(jié)合，只能容納2～3 個單糖，因此表現(xiàn)為外切活性。

Chase 根據(jù)其作用底物可以分為Chase ABC、Chase AC、Chase B 等。

2.2.1 軟骨素裂解酶ABC Chase ABC 的作用底物為CS-A、CS-B、CS-C 和HA，可生成ΔDi-4s、ΔDi-6s、ΔDi-0s 不飽和二糖及寡糖。根據(jù)酶切方式，Chase ABC 又可分為Chase ABC Ⅰ和Chase ABCⅡ，其中Chase ABC Ⅰ具有內(nèi)切活性，將CS 降解為不飽和寡糖及二糖，Chase ABC Ⅱ具有外切活性，從CS 的末端依次降解釋放不飽和二糖[18]。Chase ABC 最初在普通變形桿菌（Proteus vulgarisNCTC 4636）中發(fā)現(xiàn)[19]，隨后發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌（Proteus mirabilisWP-1）[20]、多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicronATCC 29148）[21]、彭氏變形桿菌（Proteus penneriGT38）[22]、少動鞘氨醇 單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）[23]、弧菌（Vibriosp.FC509）[24]和不動桿菌（Acinetobactersp.C26）[25]代謝產(chǎn)物中也含有Chase ABC。

來源于普通變形桿菌的Chase ABC 為內(nèi)切型酶（Chase ABC Ⅰ），其晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，如圖3（a）所示[26]。Chase ABC Ⅰ由3 個結(jié)構(gòu)域組成，N 端結(jié)構(gòu)域為雙層β-折疊和一個短的α-螺旋，中間結(jié)構(gòu)域為15 個α-螺旋，C 端結(jié)構(gòu)域為4 個反平行的β-折疊[27]。底物結(jié)合位點在中間結(jié)構(gòu)域，經(jīng)過定點突變的方法，發(fā)現(xiàn)Chase ABC Ⅰ的催化位點為His501、Tyr508、Arg560 和Glu653，其中His501 在催化過程中起到廣義堿的作用奪取糖醛酸C5 上的質(zhì)子，Glu653 參與催化位點氫鍵網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，Arg560起到中和糖醛酸羧基，穩(wěn)定催化過程中形成的烯醇式陰離子中間體的作用，Tyr508 作為質(zhì)子供體，使離去基團質(zhì)子化[26]。來源于多形擬桿菌的Chase ABC 為外切型酶（Chase ABC Ⅱ），其晶體結(jié)構(gòu)如圖3（b）所示，Chase ABC Ⅱ的晶體結(jié)構(gòu)與Chase ABC Ⅰ非常相似，由位于N 端的雙層β-折疊、位于中間區(qū)域的雙層（α/α）5圓環(huán)和位于C 端的4 個反平行β-折疊組成[28]。通過定點突變實驗，確定Chase ABC Ⅱ的催化位點為His454、Tyr461、Arg512 和Glu628[27]。Chase ABC Ⅰ和Chase ABC Ⅱ的N 端有Ca2+結(jié)合位點，當(dāng)催化體系中有Ca2+存在時，Chase ABC Ⅰ和Chase ABC Ⅱ的催化效率大大提高。

圖3 Chase ABC Ⅰ（a）和Chase ABC Ⅱ（b）的晶體結(jié)構(gòu)Fig.3 The crystal structures of Chase ABC Ⅰ (a) and Chase ABC Ⅱ (b)

2.2.2 軟骨素裂解酶AC Chase AC 的作用底物為CS-A、CS-C、軟骨素和HA，生成ΔDi-4s、ΔDi-6s 不飽和二糖及寡糖。Chase AC 最早是在肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinumATCC 13125）中發(fā)現(xiàn)，該Chase AC 是具有內(nèi)切活性的Chase AC Ⅰ[29]。隨后，Hiyama 等[30]從土壤中篩選到產(chǎn)胞外Chase AC（Chase AC Ⅱ）的金黃節(jié)桿菌（Arthrobacter aurescens），Chase AC Ⅱ的切割方向為從CS 鏈的還原端到非還原端[31]。隨著對Chase AC 來源的研究越來越深入，人們陸續(xù)篩選出氣單胞菌（Aeromonassp.）[32]、糞便擬桿菌（Bacteroides stercorisHJ-15）[33]、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobriaYH311）[34]、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescensGT596）[35]、節(jié)桿菌（Arthrobactersp.MAT3885[36]和Arthrobactersp.CS01[37]）發(fā)酵可產(chǎn)生Chase AC。

來源于肝素黃桿菌的Chase AC Ⅰ的晶體結(jié)構(gòu)如圖4（a）所示，由位于N 端的α-螺旋和位于C 端的β-折疊兩個結(jié)構(gòu)域組成，N 端是不完整的雙層（α/α）5圓環(huán)，包含了催化位點和大部分的底物結(jié)合位點，C 端是由4 個反平行的β-折疊組成[38]。Chase AC Ⅰ的催化中心包括His225、Tyr234、Arg288 和Glu371，其中His225 或者Tyr234 在催化過程中起到廣義堿的作用奪取糖醛酸C5 上的質(zhì)子，Arg288起到中和糖醛酸羧基，穩(wěn)定催化過程中形成的烯醇式陰離子中間體的作用[14]。來源于金黃節(jié)桿菌的Chase AC Ⅱ的晶體結(jié)構(gòu)如圖4（b）所示，與Chase AC Ⅰ的晶體結(jié)構(gòu)相似，C 端由4 個反平行的β-折疊組成，N 端由13 個α-螺旋組成，其中10 個α-螺旋形成不完整的雙層（α/α）5圓環(huán)，在環(huán)面一側(cè)有一凹槽，形成活性位點和底物結(jié)合位點[17]。Chase AC Ⅱ的催化位點為Tyr242、His233、Arg296 和Glu407，Tyr242在催化過程中奪取糖醛酸C5 的質(zhì)子。與Chase ABC 不同的是，Chase AC 的活性不受Ca2+的影響。

圖4 Chase AC Ⅰ（a）和Chase AC Ⅱ（b）的晶體結(jié)構(gòu)Fig.4 The crystal structures of Chase AC Ⅰ (a) and Chase AC Ⅱ (b)

2.2.3 軟骨素裂解酶B Chase B 僅能降解CS-B 和HA，生成ΔDi-0s 不飽和二糖及寡糖。目前商品化的Chase B 來源于肝素黃桿菌，且具有內(nèi)切活性。由于Chase B 作用底物有限，因此對其藥用價值的研究比較少[39]。Chase B 的晶體結(jié)構(gòu)與Chase ABC 和Chase AC 的晶體結(jié)構(gòu)完全不同，如圖5 所示，由13 個卷曲的β-螺旋組成[40]。定點突變技術(shù)分析表明，Lys250、Arg271、His272 和Glu333 參與了酶的催化，Glu333 可能作為廣義堿奪取糖醛酸C5 質(zhì)子[41]。Chase B 必須在Ca2+的存在下才能發(fā)揮活性，原因可能是Ca2+起到中和IdoUA 羧基而穩(wěn)定隨后形成的烯醇式陰離子中間體的作用。

圖5 Chase B 的晶體結(jié)構(gòu)Fig.5 The crystal structure of Chase B

2.3 軟骨素裂解酶的發(fā)酵生產(chǎn)和表征

Chase 最初的生產(chǎn)方式是由原始產(chǎn)酶菌株發(fā)酵獲得，產(chǎn)酶菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，經(jīng)過硫酸銨沉淀、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、高效液相色譜等一系列步驟分離純化出Chase。Chase 研究的早期，生產(chǎn)Chase 的菌株大多為胞內(nèi)生產(chǎn)形式[29,33,35]。胞內(nèi)生產(chǎn)需要對菌株進行細(xì)胞破碎，釋放目的蛋白Chase，破碎過程會對酶的活性造成一定損失，同時消耗額外能源。因此，近年來國內(nèi)的研究主要集中在篩選以胞外分泌形式生產(chǎn)Chase 的菌株，胞外分泌的菌株將Chase 直接釋放到發(fā)酵液中，無需對細(xì)胞進行破碎，節(jié)約能源同時減少酶活的損失，缺點在于發(fā)酵液成分復(fù)雜，Chase 的分離純化較為困難。已篩選到可胞外分泌Chase ABC 的菌株有Sphingomonas paucimobilis[23]、Acinetobactersp.C26[25]等，此外Arthrobacter aurescens[30]、Aeromonas sobriaYH311[34]、Arthrobactersp.MAT3885[36]、Arthrobactersp.CS01[37]等可分泌產(chǎn)生Chase AC。菌株發(fā)酵生產(chǎn)Chase 的過程，受碳源、氮源、發(fā)酵液pH、發(fā)酵溫度、通氧量等因素的影響，通過對上述影響因素進行優(yōu)化，可提高Chase 的產(chǎn)量和酶活。但菌株產(chǎn)Chase 需要CS 作為碳源進行誘導(dǎo)，原因可能是CS 脅迫菌株產(chǎn)生Chase，降解利用CS 以滿足自身生長繁殖。

Chase 屬于蛋白質(zhì)類，目前對于蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)已很成熟，如表1 所示，主要采用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析和凝膠層析進行Chase 的分離純化。由于Chase 分離純化過程較繁瑣，能耗較大，工業(yè)化成本較高，酶的比酶活雖然得到一定程度地提升，但分離純化過程中酶活損失較多。因此，探究新型Chase 分離純化方法對Chase 的發(fā)酵生產(chǎn)至關(guān)重要。

表1 軟骨素裂解酶的純化和表征Table 1 Purification and characterization of chondroitinase

Fu 等[42]從Sphingomonas paucimobilis中分離純化出Chase ABC，并測定了Chase ABC 的最適催化溫度和pH 分別為40 ℃、pH6.5，分子量為82.3 kDa。Zhu 等[43]從Acinetobactersp.C26 中純化出的Chase ABC 和來源于Sphingomonas paucimobilis中的Chase ABC 酶學(xué)性質(zhì)相似，最適催化溫度42 ℃，最適催化pH5.0～6.0，分子量為76 kDa。但是來源于黃桿菌RC-9 的Chase ABC 的酶學(xué)性質(zhì)與上述兩種Chase ABC 的性質(zhì)略有不同，最適催化溫度較低（32.5 ℃），最適催化pH 偏堿性（8.0），分子量相對較低，為41 kDa[44]。通過測定Chase 的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)Chase 的分子量大多為70～100 kDa，在偏中性（pH6～8）條件下表現(xiàn)較高的酶活力，其最適催化溫度為37～42 ℃，接近人體的溫度，有利于其在臨床治療中的應(yīng)用。

2.4 軟骨素裂解酶的基因克隆和重組表達(dá)

Chase 的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是利用Chase 產(chǎn)生菌株發(fā)酵獲得，但是分離純化步驟繁瑣，酶的產(chǎn)量和純度較低，極大地限制了Chase 的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，Chase 重組表達(dá)技術(shù)日趨成熟，利用重組表達(dá)體系生產(chǎn)Chase 具有低成本、高效率、短周期的優(yōu)點，重組Chase 已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究中。早在2001 年，Pojasek 等[46]在大腸桿菌中表達(dá)了來源于肝素黃桿菌的Chase AC 和Chase B，并經(jīng)過一步親和層析分離純化出Chase AC 和Chase B，比酶活分別為541 U/mg（蛋白質(zhì)）和84.6 U/mg（蛋白質(zhì)）；Gu Kenan 等[29]利用肝素黃桿菌發(fā)酵產(chǎn)生Chase AC 和Chase B，通過魚精蛋白沉淀、陰離子交換層析、羥基磷灰石層析和凝膠滲透色譜分離純化Chase AC，純化后的Chase AC 比酶活為111 U/mg（蛋白質(zhì)），通過陽離子交換層析、硫酸纖維素層析、羥基磷灰石層析和凝膠滲透色譜分離純化Chase B，純化后的Chase B 比酶活為278 U/mg（蛋白質(zhì)），Chase B 的比酶活是重組Chase B 比酶活的3 倍，但分離純化過程繁瑣，酶活損失嚴(yán)重（回收率18.9%）。

大腸桿菌（E.coli）表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、分子操作簡便、生長周期短、可實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)發(fā)酵等優(yōu)點，是表達(dá)重組蛋白常用的宿主[47]，目前Chase主要在大腸桿菌宿主中重組表達(dá)。重組Chase 在表達(dá)宿主內(nèi)過表達(dá)時快速合成和空間有限等原因，容易發(fā)生錯誤折疊或形成不溶性的包涵體，從而影響重組Chase 的產(chǎn)量和活性[48]。因此，改善重組Chase的折疊和溶解性對Chase 的活性至關(guān)重要，目前主要通過選擇和優(yōu)化信號肽、共表達(dá)分子伴侶、引入融合標(biāo)簽以及敲除細(xì)胞膜相關(guān)基因和定點突變等途徑改善重組Chase 折疊和溶解性，提高重組Chase 的產(chǎn)量和活性。

2.4.1 選擇和優(yōu)化信號肽 信號肽是一段較短的特定氨基酸序列，引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運到膜外或周質(zhì)空間，對蛋白質(zhì)的折疊過程有影響，可促進蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)，避免包涵體的形成。Lu 等[49]在E.coliBL21 （DE3）中表達(dá)了來源于Proteus vulgarisATCC33420 的Chase ABC Ⅰ，并在Chase ABC Ⅰ的N 端引入信號肽PelB，實現(xiàn)了重組Chase ABC Ⅰ的可溶性表達(dá)，優(yōu)化E.coliBL21 （DE3）表達(dá)Chase ABC Ⅰ的培養(yǎng)基成分后酶活可達(dá)17.55 U/mL（發(fā)酵上清液）。Wang 等[50]在E.coliBL21 （DE3）中表達(dá)了來源于Proteus vulgarisIFO3988 的Chase ABC Ⅰ，并引入信號肽PelB、OmpA 和PhoA，發(fā)現(xiàn)信號肽的引入使Chase ABC Ⅰ以分泌形式表達(dá)，結(jié)果表明引入信號肽可使Chase ABC 主要以分泌型表達(dá)，避免細(xì)胞破碎引起的酶活損失，Chase 產(chǎn)量和活性明顯提高。

2.4.2 共表達(dá)分子伴侶 細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)分子可以識別正在合成的多肽或部分折疊的多肽，并與多肽的某些部位相結(jié)合，從而幫助這些多肽轉(zhuǎn)運、折疊或組裝，這一類分子本身并不參與最終產(chǎn)物的形成，因此被稱為“分子伴侶”。分子伴侶可有效改善重組目的蛋白的折疊、溶解性和跨膜運輸。Fang 等[51]在E.coliBL21 （DE3）中表達(dá)了來源于Arthrobactersp.CS01 的Chase AC Ⅱ，共表達(dá)了分子伴侶DnaKDnaJ-GrpE、觸發(fā)因子（trigger factor，TF）和GroELGroES，研究發(fā)現(xiàn)共表達(dá)分子伴侶GroEs-GroEL 顯著提高了Chase AC Ⅱ的產(chǎn)量。Li 等[52]在大腸桿菌中表達(dá)了來源于Proteus vulgarisKCTC2579 的Chase ABC Ⅰ，同時為改善折疊和溶解性，共表達(dá)了相關(guān)的7 種分子伴侶，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)分子伴侶GroES 可以顯著提高Chase ABC Ⅰ的產(chǎn)量，且可以提高Chase ABC Ⅰ與底物CS-A 的親和力。

2.4.3 引入融合標(biāo)簽 融合標(biāo)簽是在重組目的蛋白的N 端或C 端進行融合表達(dá)的特定蛋白質(zhì)、多肽或寡肽標(biāo)簽。引入融合標(biāo)簽，如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）、小泛素樣修飾酶（SUMO）、硫氧還原蛋白（Trx），可提高重組目的蛋白的表達(dá)水平，增強溶解度。其中MBP 作為最受歡迎的融合標(biāo)簽之一，可顯著提高重組目的蛋白的溶解性，而且MBP 可與麥芽糖和直鏈淀粉特異性親和吸附方便進行分離純化，因此有越來越多的研究者將MBP 與Chase 融合表達(dá)，促進Chase 的可溶性表達(dá)。Chen 等[53]在表達(dá)來源于Proteus vulgaris KCTC2579 的Chase ABCⅠ時，引入融合標(biāo)簽MBP 與Chase ABC Ⅰ共表達(dá)，實現(xiàn)了Chase ABC Ⅰ的可溶性表達(dá)，并測定了MBPChase ABC Ⅰ的酶學(xué)性質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)MBP-Chase ABC Ⅰ的最適催化溫度和最適催化pH 分別為55 ℃、7.73，MBP-Chase ABC Ⅰ在30 ℃保溫210 min，酶活保留78%左右，MBP 提高了Chase ABC Ⅰ的熱穩(wěn)定性。

2.4.4 敲除細(xì)胞膜相關(guān)基因 敲除或抑制與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜生物合成相關(guān)的基因，構(gòu)建重組滲漏菌株，增加膜的通透性，可實現(xiàn)重組目的蛋白的胞外分泌。Wang 等[50]克隆表達(dá)了來源于Proteus vulgarisIFO3988 的Chase ABC Ⅰ，將309 位的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，顯著提高了Chase ABC Ⅰ的酶活；在突變的基礎(chǔ)上，引入信號肽OmpA，并敲除脂蛋白編碼基因（lpp）改善細(xì)胞膜通透性，實現(xiàn)了Chase ABCⅠ的分泌型表達(dá)。

2.5 軟骨素裂解酶的應(yīng)用

2.5.1 軟骨素裂解酶在基礎(chǔ)研究的應(yīng)用 Chase 降解CS 等糖胺聚糖，生成二糖及寡糖，可用于構(gòu)建二糖和寡糖的文庫，研究糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。Chase 作為工具酶，可用于高效制備具有多種生物活性的CS 低聚糖[54]。Valcarcel 等[55]利用Chase 降解五種海洋來源CS，構(gòu)建了Chase 催化時間和產(chǎn)物平均分子量的預(yù)測模型，根據(jù)模型能夠有效推測出獲得確定分子量的CS 所需的催化時間，從而可以利用Chase 高效制備不同分子量的CS，有利于不同分子量CS 與其生物活性關(guān)系的研究。Chase 可用于檢測藥物及各種組織中CS 的含量，如鮑倫軍等[56]利用Chase 酶解-高效液相色譜的方法檢測魚翅中CS 的含量，共檢測了9 種具有代表性的魚翅產(chǎn)品，其CS 含量均在1.24%～3.12%，該方法具有準(zhǔn)確度和精密度較高的優(yōu)點。

2.5.2 軟骨素裂解酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 Chase 作用于硫酸軟骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）的能力決定了其生物活性。CSPGs是機體正常功能所必需的，CSPGs 水平的升高或降低會導(dǎo)致各種病理狀態(tài)，如脊髓損傷和玻璃體脫離等病理狀態(tài)是由CSPGs 水平升高引起的，Chase 可特異性地降解CSPGs，降低CSPGs 水平，從而使CSPGs 恢復(fù)正常水平，機體恢復(fù)正常功能[57]。因此，Chase 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。

修復(fù)脊髓損傷。脊髓發(fā)生原發(fā)性損傷后，神經(jīng)膠質(zhì)和非中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞侵入損傷部位，保護脊髓免受繼發(fā)性損傷，這導(dǎo)致了瘢痕的形成，從而抑制軸突再生。CSPGs 作為瘢痕的重要組成部分，在抑制軸突再生中發(fā)揮著重要作用。而CSPGs 主要是通過CS 側(cè)鏈抑制軸突再生，因此去除CS 糖鏈可使軸突再生，Chase 可降解CS 糖鏈，從而能夠促進軸突再生，修復(fù)脊髓損傷[58]。

減輕腰椎間盤突出。腰椎間盤突出癥是指纖維環(huán)斷裂及髓核突出使腰椎間盤組織局限性移位而壓迫鄰近的韌帶和神經(jīng)根導(dǎo)致腰痛及下肢疼痛的一種常見病[59]。Chase 可選擇性地降解椎間盤內(nèi)軟骨基質(zhì)中的蛋白聚糖，減輕椎間盤內(nèi)壓力，達(dá)到消除腰椎間盤突出的臨床癥狀。而且，Chase 對神經(jīng)、血管及周圍組織的較高安全性已經(jīng)得到充分證實，表明Chase 在治療腰椎間盤突出癥中的巨大潛力[60]。

治療瘢痕疙瘩。當(dāng)機體缺乏彈性纖維（正常皮膚的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分）時，皮膚傷口愈合中會形成過度生長的、隆起于皮膚表面的紅色或紅褐色的異常瘢痕組織，稱為瘢痕疙瘩。Ishiko 等[61]將取自患者的瘢痕疙瘩組織移植到裸鼠身上，并將Chase ABC 注射到移植的瘢痕組織中，發(fā)現(xiàn)Chase ABC 可以顯著降低瘢痕疙瘩組織的體積，恢復(fù)彈性纖維的形成。因此，注射Chase 可作為治療瘢痕疙瘩的一種新療法。

抑制腫瘤的發(fā)展。CS 可以參與細(xì)胞間交流、傳導(dǎo)過程，進而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[57]。因此，CSPGs 經(jīng) Chase 降解后，側(cè)鏈的CS 基團暴露后作用于細(xì)胞，從而阻斷信號傳導(dǎo)過程，抑制腫瘤的發(fā)展[62]。

治療弱視。弱視的病理本質(zhì)為視覺皮質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)的發(fā)育異常，細(xì)胞外基質(zhì)在視覺發(fā)育關(guān)鍵期后期所發(fā)生的成分變化被認(rèn)為是導(dǎo)致視覺皮質(zhì)可塑性明顯降低的重要原因之一，其中CSPGs 含量的增加最受關(guān)注[63]。用Chase 從成熟的細(xì)胞外基質(zhì)中去除CSPGs 可促進視覺皮層的可塑性，促進雙眼視覺的重建[64]。但該研究仍處于起步階段，在批準(zhǔn)其用于弱視治療之前，仍需進行大量實驗。

2.5.3 軟骨素裂解酶在其他領(lǐng)域的應(yīng)用 Chase 還可用于皮革制造業(yè)。動物皮革中含有蛋白聚糖，用Chase 處理動物皮革，能特異性地降解蛋白聚糖中的糖胺聚糖鏈，從而使皮革結(jié)構(gòu)變得疏松，增強了皮革的透性和彈性，進而提高了皮革的質(zhì)量[65]。Chase 可以高選擇性地裂解CS，因此具有用來特異性的去除粗品肝素中CS 雜質(zhì)制備精品肝素的潛力。

3 結(jié)語

酶解后的低分子量CS 相較于未酶解的CS，生物利用率提高，能更好發(fā)揮CS 的功能。目前對低分子量CS 的生理活性研究廣泛，抗氧化、抗腫瘤、降血脂等功效都有所涉及，但研究較為籠統(tǒng)，酶解后CS 的分子量與生理活性的關(guān)系缺乏深入研究，低分子量CS 提高生理活性的機理研究較為缺乏。近年來已從多種菌株中獲得Chase，Chase 的分離純化方法也較成熟，但在分離純化過程中Chase 酶活損失嚴(yán)重，因此越來越多的研究者利用分子手段，構(gòu)建Chase 的重組表達(dá)載體，在宿主細(xì)胞中進行異源表達(dá)。雖然Chase 的重組表達(dá)存在重組蛋白錯誤折疊和溶解性差的困難，但越來越多的研究者通過引入信號肽、融合表達(dá)分子伴侶、引入融合標(biāo)簽和敲除細(xì)胞壁或細(xì)胞膜生物合成的相關(guān)基因等方法，改善了重組Chase 的溶解度，提高了Chase 的產(chǎn)量和酶活。目前對于Chase 的重組表達(dá)大多停留在實驗室階段，重組Chase 的純度和酶活性大多能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，但重組Chase 多采用親和吸附進行分離純化，成本較高，是制約Chase 工業(yè)化生產(chǎn)的主要瓶頸。因此，選擇合適的標(biāo)簽構(gòu)建融合表達(dá)載體實現(xiàn)Chase 高效快速的分離純化，是實現(xiàn)Chase 工業(yè)化生產(chǎn)亟需解決的問題之一。