鱘魚軟骨制品的工藝優(yōu)化及其對人軟骨細(xì)胞炎癥的調(diào)控

劉恒閣，徐新星，白 帆，汪金林，高瑞昌，劉 康, ，趙元暉,

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開發(fā)有限公司，浙江衢州 324002；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

鱘魚是現(xiàn)存起源最早的脊椎動物之一，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值和科研價值，我國的鱘魚市場需求仍在不斷擴(kuò)大[1]。然而，鱘魚產(chǎn)業(yè)逐步發(fā)展至今，主要加工方向仍為魚子醬產(chǎn)品，加工過程中魚骨和龍筋等副產(chǎn)物利用率較低[2]。在鱘魚的軟骨和龍筋中含有豐富的膠原蛋白、硫酸軟骨素、氨基葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)，其在緩解骨性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)疼痛等方面具有潛在價值[3]。骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）又稱骨質(zhì)增生性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎等，是一種進(jìn)行性慢性發(fā)展的骨關(guān)節(jié)疾病，亦是導(dǎo)致下肢殘疾的起因之一[4]。軟骨細(xì)胞的損傷和退化是造成骨性關(guān)節(jié)炎的重要原因之一[5?8]。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素、Ⅱ型膠原蛋白及氨基葡萄糖都可作用于軟骨細(xì)胞，對其產(chǎn)生刺激，導(dǎo)致其分泌多聚體糖蛋白，并且可以減少對軟骨細(xì)胞有毒的一些細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)一步潤滑保護(hù)骨關(guān)節(jié)[9?13]。

目前，關(guān)于鱘魚的研究大部分為對魚肉營養(yǎng)成分和風(fēng)味機(jī)制的探究，而關(guān)于魚骨的研究主要報道有魚骨酶解加工工藝的優(yōu)化以及酶解物的抗腫瘤活性等探究，國內(nèi)外以鱘魚魚骨為原料的產(chǎn)品開發(fā)及其對骨性關(guān)節(jié)炎的活性影響報道較少[14?17]。因此，本文以鱘魚魚骨為研究對象，對其進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)以及骨關(guān)節(jié)炎緩解作用的探究。

本實驗選用鱘魚軟骨為原料制成食品，探究產(chǎn)品的最佳制備條件，并考察其對人軟骨細(xì)胞炎癥的調(diào)控作用，為鱘魚有效成分預(yù)防及緩解骨性關(guān)節(jié)炎在細(xì)胞層面提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雄性人工養(yǎng)殖西伯利亞鱘和史氏鱘雜交鱘魚魚骨、龍筋、花膠 杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司；8 周齡雌性SD 大鼠40 只，體重均為（180±20）g 濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）2019-0003；冰糖、蜂蜜 市售；健力多Ⅱ型膠原氨糖軟骨素片 湯臣倍健股份有限公司；雙抗（青鏈霉素） Invitrogen 公司；乙腈（色譜純）、阿爾新藍(lán)染液、單糖標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma 公司；DMEM 培養(yǎng)液、特級胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、MTT、羥脯氨酸含量檢測試劑盒、前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）ELISA 試劑盒、白細(xì)胞介素6（Interleukin 6，IL-6）ELISA 試劑盒、白細(xì)胞介素8（Interleukin 8，IL-8）ELISA 試劑盒、環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）ELISA 試劑盒、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，INOS）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）含量測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；人軟骨肉瘤細(xì)胞株（SW1353 細(xì)胞） 武漢普諾賽生命科技有限公司。

LC-20AD 高效液相色譜儀 日本島津公司；IX73 倒置顯微鏡 日本Olympus 公司；Multiskan FC 全自動酶標(biāo)儀、HERAcell 150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Sorvall Stratos 低溫高速離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司；LE2002E 電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；LGJ-10C 真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；F-50 微型反壓滅菌釜山東創(chuàng)美機(jī)械科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱘魚軟骨制品的制備 鱘魚軟骨制品的總體制備工藝如圖1 所示。參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行預(yù)實驗，確定了鱘魚軟骨制品各原料添加量的基本配比為鱘魚骨筋液的配比為魚骨:龍筋:水=4:1:12，熬煮過程中骨筋液、花膠、蜂蜜、冰糖和水的配比為骨筋液:花膠:蜂蜜:冰糖:水=16:6:3:1:74，不再進(jìn)行后續(xù)單因素實驗。

圖1 鱘魚軟骨制品的制備工藝流程Fig.1 Preparation process of sturgeon cartilage products

操作要點：參考文獻(xiàn)[19]并加以修改，將新鮮鱘魚宰殺后取魚骨和龍筋，于40 ℃下蒸煮10 min 以脫去殘留的魚肉，將洗凈的魚骨、龍筋及水按上述質(zhì)量比加入微型反壓滅菌釜，通過熱液化使原料充分壓化至液態(tài)，將液態(tài)物料過200 目篩網(wǎng)后，將鱘魚骨筋液、泡發(fā)花膠及水按上述質(zhì)量比混合熬煮，待物料整體均勻透明無分層后，加入蜂蜜與冰糖調(diào)味，過200 目篩網(wǎng)后熱罐裝并殺菌。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 不同熱液化工藝對鱘魚軟骨制品的影響稱取鱘魚軟骨濕基18.8 g，鱘魚龍筋4.7 g、泡發(fā)花膠30 g、蜂蜜15 g、冰糖5 g、水426.4 g，根據(jù)1.2.1的方法制備鱘魚軟骨制品，按鱘魚骨筋液的熱液化溫度120 ℃，混合熬煮時間30 min，熬煮溫度80 ℃，分別于10、15、20、25、30 min 的熱液化時間下進(jìn)行制備，探究不同熱液化時間對鱘魚軟骨制品感官品質(zhì)的影響，確定最佳熱液化時間。

按照上述條件，控制鱘魚骨筋液的熱液化時間20 min，混合熬煮時間30 min，熬煮溫度80 ℃不變，分別于100、110、120、130、140 ℃的熱液化溫度下進(jìn)行制備，探究不同熱液化溫度對鱘魚軟骨制品感官品質(zhì)的影響，確定最佳熱液化溫度。

1.2.2.2 不同熬煮工藝對鱘魚軟骨制品的影響 按1.2.1 條件制備鱘魚軟骨制品，按鱘魚骨筋液的熱液化時間20 min，熱液化溫度120 ℃，混合熬煮溫度80 ℃，分別于10、20、30、40、50 min 的熬煮時間下進(jìn)行制備，探究不同熬煮時間對鱘魚軟骨制品感官品質(zhì)的影響，確定最佳熬煮時間。

按照上述方法，控制鱘魚骨筋液的熱液化時間20 min，熱液化溫度120 ℃，混合熬煮時間30 min 不變，分別于60、70、80、90、100 ℃的熬煮溫度下進(jìn)行制備，探究不同熬煮溫度對鱘魚軟骨制品感官品質(zhì)的影響，確定最佳熬煮溫度。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，以感官品質(zhì)為評價指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交試驗用以確定制備鱘魚軟骨制品的最佳工藝條件，試驗因素設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factor and level of orthogonal experimental

1.2.4 感官評定方法 參考大鯢膠原蛋白多肽口服液的感官評價標(biāo)準(zhǔn)，修改制定鱘魚軟骨制品的評價標(biāo)準(zhǔn)[18]。由9 人構(gòu)成感官評價小組（小組成員均受過專業(yè)感官評價培訓(xùn)），根據(jù)表2 對產(chǎn)品從顏色、性狀、氣味和滋味三個方面進(jìn)行測評。評分等級分為：46～60、31～45、16～30、0～15。

表2 感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard

1.2.5 理化、微生物及主要營養(yǎng)成分指標(biāo)測定 鱘魚軟骨制品的各項理化指標(biāo)測定方法如下：甲基汞的測定方法參照GB 5009.17-2014 食品中總汞及有機(jī)汞的測定中的第二法；多氯聯(lián)苯的測定方法參照GB 5009.190-2014 食品中指示性多氯聯(lián)苯含量的測定中的第二法；N-二甲基硝銨的測定方法參照GB 5009.26-2016 食品中N-亞硝胺類化合物的測定中的第一法；鉛的測定方法參照GB 5009.12-2017 食品中鉛的測定中的第一法；鉻的測定方法參照GB 5009.123-2014 食品中鉻的測定；鎘的測定方法參照GB 5009.15-2014 食品中鎘的測定；苯甲酸的測定方法參照GB 5009.28-2016 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定中的第一法；無機(jī)砷的測定方法參照GB 5009.11-2014 食品中總砷及無機(jī)砷的測定中的第二篇第一法。

微生物指標(biāo)測定方法如下：沙門氏菌的測定方法參照GB 4789.4-2016 食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗；金黃色葡萄球菌的測定方法參照GB 4789.10-2016 食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗中的第二法；副溶血性弧菌的測定方法參照GB4789.7-2013食品微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗。

參考陸劍峰等[20]的方法，按照羥脯氨酸檢測試劑盒的說明測定羥脯氨酸含量，再乘以換算系數(shù)11.1，即可得膠原蛋白含量；硫酸軟骨素和氨基葡萄糖的測定方法參照GB/T 20365-2006 硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定。

1.2.6 鱘魚軟骨制品對人軟骨細(xì)胞的影響

1.2.6.1 動物實驗 參考文獻(xiàn)并略作修改：選用8 周齡雌性SD 大鼠40 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為空白血清組（生理鹽水）、陽性對照組（Ⅱ型膠原氨糖軟骨素片）、鱘魚軟骨制品低、中、高劑量組五組，每組8 只。根據(jù)大鼠給藥劑量與正常人給藥量換算系數(shù)6.3，參考大鼠胃容積每百克0.9 mL 灌胃干預(yù)[21]。

鱘魚軟骨制品灌胃劑制備：將本實驗研發(fā)的鱘魚軟骨制品低溫凍干濃縮成粉狀，以蒸餾水控制灌胃劑濃度為每毫升含藥1 g。按照大鼠與人體的受藥量公式換算每只動物的灌胃量低、中、高三組分別為100、250、500 mg/kg。

陽性對照組灌胃劑制備：將健力多Ⅱ型膠原氨糖軟骨素片磨碎成粉狀，使用蒸餾水溶解，劑量為大鼠每日每千克250 mg。

空白血清組灌胃劑制備：用同體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.6.2 含藥血清的制備 參考文獻(xiàn)[22]的培養(yǎng)方法，將上述每組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，生活狀態(tài)無異常后，受試物灌胃1 個月，取血前禁食水，于第32 d灌胃后等待2 h，以8%的水合氯醛根據(jù)動物體重每百克0.5 mL 進(jìn)行腹腔注射麻醉，腹主動脈取血法收集血液，各組血液于4 ℃靜置4～5 h，于4000 r/min的參數(shù)下低溫低速離心15 min，離心后的上清過0.22 μm 濾膜除菌分裝，?80 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.3 含藥血清中羥脯氨酸及單糖組成的測定羥脯氨酸的具體測定方法按照羥脯氨酸含量檢測試劑盒說明進(jìn)行。血清樣品水解及標(biāo)準(zhǔn)品衍生參考楊大俏等[23]的方法進(jìn)行，使用液相色譜法對血清的單糖組成進(jìn)行分析，色譜柱選用Gracesmart C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A 為100 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液，流動相B 為乙腈，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，于250 nm 下檢測。以各單糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)分別計算線性回歸方程，各單糖在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，詳細(xì)結(jié)果見表3。

表3 各單糖成分的線性回歸方程和范圍Table 3 The linear equations and linear ranges of each monosaccharide

1.2.6.4 人軟骨肉瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[24]的培養(yǎng)方法，將人軟骨肉瘤細(xì)胞（SW1353）在含10%特級胎牛血清（FBS）和1×104U/mL 雙抗（青鏈霉素）的DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至80%以上時，用胰酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔2 d 換液，細(xì)胞傳至三代左右時可進(jìn)行實驗。實驗前，將細(xì)胞提前分組，分別為空白血清組、鱘魚軟骨制品低、中、高濃度組、陽性對照組、空白對照組和無IL-1β（白細(xì)胞介素1β）處理組。

1.2.6.5 細(xì)胞炎癥模型造模 參考文獻(xiàn)[25]的方法，將細(xì)胞用胰酶消化并重懸成細(xì)胞密度1×108個/mL的細(xì)胞懸液，每孔接種10 μL 到6 孔板上，依次每孔加2 mL 完全培養(yǎng)基（DMEM 培養(yǎng)基含血清及雙抗）。完全貼壁后，PBS 漂洗，按上述1.2.6.4 分組每孔加1.8 mL 含10%含藥血清的DMEM 培養(yǎng)基（無IL-1β處理組每孔加2 mL 培養(yǎng)基），培養(yǎng)箱中孵育30 min，除無IL-1β處理組外，每孔各加0.2 mL 的IL-1β（10 μg·L?1）處理48 h，造模完畢。

1.2.6.6 阿爾新藍(lán)染色 細(xì)胞造模24 h 后，PBS 洗液漂洗3～5 次，每孔加1.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min 后，PBS 洗液漂洗3～5 次，各孔加0.5 mL 1%阿爾新藍(lán)染液過夜。棄染液后，每孔加1.5 mL 75%乙醇溶液潤洗，棄去乙醇，加去離子水洗滌3～5 次，自然晾干，鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.6.7 MTT 法檢測細(xì)胞增殖活力 將細(xì)胞用胰酶消化并重懸成細(xì)胞密度1×104個/mL 的細(xì)胞懸液，于96 孔板中培養(yǎng)至貼壁，棄去培養(yǎng)基，按分組加入含藥血清培養(yǎng)基，孵育30 min 后每孔加入IL-1β過夜，避光配置5 mg/mL 的MTT 溶液，每孔加20 μL，孵育4 h 后，各孔分別加200 μL DMSO，將96 孔板置于恒溫低速搖床上低速振蕩15 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm 處檢測吸光度。

1.2.6.8 ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子的表達(dá)水平 參考文獻(xiàn)的方法，將造模完備的細(xì)胞以含藥血清干預(yù)后培養(yǎng)24 h，收集每孔培養(yǎng)液，具體測定方法按照NO、INOS、IL-6、COX-2 和PGE2 檢測試劑盒說明進(jìn)行[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文實驗均重復(fù)4 次以上，采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗計量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用Origin 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過單因素和雙因素方差分析進(jìn)行比較，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 不同熱液化條件對鱘魚軟骨制品的影響 由圖2 可知，鱘魚軟骨制品的感官品質(zhì)受到鱘魚骨筋液熱液化溫度和時間的影響。當(dāng)熱液化溫度達(dá)到120 ℃時，產(chǎn)品感官評分最高，隨后評分隨溫度的升高而降低。同時，隨著處理時間的增加，產(chǎn)品感官評分也在逐漸上升，20 min 后，評分開始下降。這是由于熱液化溫度和時間過低均會導(dǎo)致鱘魚魚骨和龍筋的液化不完全，大部分物料殘存在設(shè)備中沒有被壓化，從而使產(chǎn)品濃度降低[26]。此外，產(chǎn)品后續(xù)制作中又被過度稀釋，其特有的鱘魚風(fēng)味、順滑口感等都會受到不良影響；而液化溫度和時間過高則會導(dǎo)致物料在設(shè)備中過分受熱，使部分物料呈焦糊狀態(tài)，導(dǎo)致產(chǎn)品原有的獨特風(fēng)味難以體現(xiàn)，還附有令人難以接受的焦糊口感和色澤。因此，控制熱液化溫度在110～130 ℃和熱液化時間在15～25 min 范圍內(nèi)，產(chǎn)品可以呈現(xiàn)較好的感官品質(zhì)。

2.1.2 不同熬煮條件對鱘魚軟骨制品的影響 由圖3可知，鱘魚軟骨制品的感官品質(zhì)受到不同熬煮條件的影響。感官評分隨著熬煮溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時，產(chǎn)品的感官評分最高，之后隨溫度的繼續(xù)升高而降低。同時，隨著熬煮時間的增加，產(chǎn)品的感官評分也在逐漸上升，30 min 后，評分開始明顯下降。這是由于熬煮溫度和時間過低會導(dǎo)致物料混合不均勻，美拉德反應(yīng)不完全，使產(chǎn)品的性狀質(zhì)地不均一，出現(xiàn)分層現(xiàn)象；而熬煮溫度和時間過高則會導(dǎo)致美拉德反應(yīng)過度，物料呈焦糊狀，最終產(chǎn)品呈現(xiàn)棕黑色，口感過于甜膩且焦糊風(fēng)味嚴(yán)重[26]。因此，控制熬煮溫度在70～90 ℃和熬煮時間在20～40 min 范圍內(nèi)，產(chǎn)品可以呈現(xiàn)較好的感官品質(zhì)。

圖3 不同熬煮條件對鱘魚軟骨制品感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of different boiling conditions on sensory quality of sturgeon cartilage product

2.2 正交試驗結(jié)果

通過單因素實驗，可知鱘魚軟骨制品的感官品質(zhì)受熱液化和熬煮工藝條件的影響較大，故而設(shè)計L9（34）正交試驗用以確定制備鱘魚軟骨制品的最佳工藝條件，并進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

結(jié)合表4 與表5，發(fā)現(xiàn)鱘魚軟骨制品感官品質(zhì)受熱液化溫度的影響較顯著（P<0.05），影響產(chǎn)品品質(zhì)因素的順序為熱液化溫度>熬煮時間>熬煮溫度>熱液化時間，此外分析K 值發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品的最優(yōu)化工藝條件是A2B2C2D2，即熱液化溫度120 ℃、熱液化時間20 min、熬煮溫度80 ℃、熬煮時間30 min。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis

2.3 驗證實驗

按照最優(yōu)化工藝條件A2B2C2D2進(jìn)行三次平行實驗，結(jié)果得到鱘魚軟骨制品的感官評分平均為（59.69±0.32）分，高于上述9 個實驗組合，由圖4 可以看出，在此條件下制備的鱘魚軟骨制品呈淺棕黃色，色澤透亮均勻，質(zhì)地透明，無分層現(xiàn)象，香味濃郁協(xié)調(diào)，無腥味，口感細(xì)膩順滑。

圖4 鱘魚軟骨制品外觀圖Fig.4 Appearance of sturgeon cartilage product

2.4 鱘魚軟骨制品的理化、微生物及主要營養(yǎng)成分指標(biāo)測定結(jié)果

參考動物性水產(chǎn)制品國標(biāo)，由表6、表7 可知，鱘魚軟骨制品的理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)[27]。

表6 鱘魚軟骨制品理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 6 Results of physical and chemical indexes of sturgeon cartilage product

表7 鱘魚軟骨制品微生物指標(biāo)檢測結(jié)果Table 7 Results of microbiological index detection of sturgeon cartilage product

由表8 可知，鱘魚軟骨制品中含有膠原蛋白、硫酸軟骨素及氨基葡萄糖三種主要營養(yǎng)物質(zhì)，含量分別為2.20、2.82 g/100 g 和1.17 g/100 g，推測其可能對后續(xù)軟骨細(xì)胞實驗造成影響。

表8 鱘魚軟骨制品主要營養(yǎng)成分檢測結(jié)果Table 8 Results of main nutrients of sturgeon cartilage product

2.5 含藥血清中羥脯氨酸和單糖組成測定結(jié)果

由圖5 可知，與空白對照組相比，各受試物組血清中的羥脯氨酸含量均顯著增加（P<0.05），說明攝入鱘魚軟骨制品可以促使血液中羥脯氨酸的分泌量顯著增加。產(chǎn)品組內(nèi)中濃度組血清的羥脯氨酸含量最高，參考陳俊等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，由于鱘魚軟骨制品中添加了蜂蜜和冰糖調(diào)味，因此，隨著產(chǎn)品濃度的增加，產(chǎn)品的含糖量也在增加，而長期的高糖飲食會導(dǎo)致氧化應(yīng)激、蛋白水解酶的產(chǎn)生以及晚期糖基化終末產(chǎn)物的積累，影響了Ⅱ型膠原蛋白的合成，而羥脯氨酸作為形成膠原蛋白的必需氨基酸，其分泌量也顯著降低[29]。

圖5 含藥血清中羥脯氨酸含量Fig.5 Hydroxyproline content in drug-containing serum

羥脯氨酸是Ⅱ型膠原蛋白的主要構(gòu)成成分之一，可以通過羥脯氨酸含量的變化推測Ⅱ型膠原蛋白含量的變化。Ⅱ型膠原蛋白可促使已經(jīng)去分化的軟骨細(xì)胞再次表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白和分泌糖胺聚糖。因此，由于每組血清中羥脯氨酸含量不同，推測各組含藥血清會對后續(xù)的軟骨細(xì)胞實驗造成不同的影響，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實驗。

由表9 可知，與空白對照組相比，各受試物組血清中的氨基葡萄糖和葡萄糖的摩爾濃度比率均有較明顯的上升，而每組血清中葡萄糖醛酸和氨基半乳糖的摩爾濃度比率均較低，說明通過相應(yīng)受試物灌胃后可以促使血液中氨基葡萄糖和葡萄糖的比率升高，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實驗。由于葡萄糖醛酸和氨基半乳糖是構(gòu)成硫酸軟骨素的主要成分，說明硫酸軟骨素在攝入后被分解代謝，可能通過其它方式對機(jī)體產(chǎn)生作用[30]。

表9 含藥血清中單糖成分分析Table 9 Analysis of monosaccharide composition in drug-containing serum

氨基葡萄糖作為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分之一，具有可以有效地促進(jìn)軟骨蛋白聚糖的生成，抑制炎癥因子和炎癥介質(zhì)的擴(kuò)散，刺激軟骨細(xì)胞合成膠原蛋白等功效。因此，推測由于含藥血清中的氨基葡萄糖比率不同，后續(xù)的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果也會隨之受到影響，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.6 阿爾新藍(lán)染色結(jié)果

阿爾新藍(lán)染液可以將軟骨細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖染成藍(lán)色[31]，由圖6 可明顯看出，與空白對照組相比，除未造模組和陽性對照外，產(chǎn)品中濃度組的軟骨細(xì)胞染色范圍最廣顏色最深，說明IL-1β軟骨細(xì)胞促炎造模成功，且各組含藥血清對于處于炎癥狀態(tài)的軟骨細(xì)胞都有一定的緩解和保護(hù)作用，同時也證明了產(chǎn)品組血清可以有效地刺激軟骨細(xì)胞增殖和分泌蛋白聚糖。

圖6 軟骨細(xì)胞阿爾新藍(lán)染色Fig.6 Alcian blue staining of chondrocytes

2.7 MTT 法檢測軟骨細(xì)胞的增殖活力

如圖7 所示，與空白對照組相比，各組細(xì)胞活力均顯著上升（P<0.05），說明含藥血清對軟骨細(xì)胞沒有毒性。以造模后不加含藥血清的空白對照組細(xì)胞活力為100%計，除陽性對照組外，產(chǎn)品中濃度組的細(xì)胞增殖活力為156%，在受試物組間活力最高，說明產(chǎn)品組含藥血清可以顯著提升炎癥軟骨細(xì)胞增殖活力（P<0.05）。由上述2.5 和吳松等[32]的研究可知，軟骨細(xì)胞在高糖環(huán)境下培養(yǎng)，會引起氧化應(yīng)激程度加劇、細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，產(chǎn)品組的細(xì)胞增殖活力并無劑量依賴性。

圖7 不同組含藥血清對軟骨細(xì)胞活力的影響Fig.7 Effect of different groups of drug-containing serum on chondrocyte viability

2.8 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子的表達(dá)水平

由圖8（A）可知，與空白對照組相比，鱘魚軟骨制品組INOS 和NO 的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），說明鱘魚軟骨制品組含藥血清可以有效地抑制軟骨細(xì)胞表達(dá)INOS 和NO。鱘魚軟骨制品組內(nèi)中濃度血清組對INOS 表達(dá)的抑制效果最為顯著（P<0.05）；中濃度和高濃度血清組對NO 表達(dá)的抑制效果最為顯著（P<0.05），且兩組組內(nèi)無顯著性差異（P>0.05），此結(jié)果與上述2.5 和2.7 結(jié)果一致。NO 屬于活性氧，過量的NO 會導(dǎo)致低度炎癥的產(chǎn)生，有研究表明，由于軟骨細(xì)胞衰老、凋亡和發(fā)炎導(dǎo)致的骨性關(guān)節(jié)炎與NO 含量的不正常升高有著密切關(guān)系，NO 的升高可以有效抑制軟骨細(xì)胞的生長及其分泌膠原蛋白和蛋白聚糖的能力。INOS 屬于一種同工酶，可以通過在機(jī)體內(nèi)催化L-精氨酸氧化生成L-瓜氨酸的過程產(chǎn)生NO，從而損壞軟骨細(xì)胞，影響細(xì)胞的正常生理功能并促發(fā)炎癥[33?34]。

圖8 不同組含藥血清對軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響Fig.8 Effect of different groups of drug-containing serum on cytokine expression in chondrocyte culture medium

由圖8（B）可知，與空白對照組相比，產(chǎn)品含藥血清組IL-8 的表達(dá)水平均無顯著性變化（P>0.05），而陽性對照組和未造模組中IL-8 的表達(dá)水平均有顯著性下降（P<0.05），說明產(chǎn)品組含藥血清對軟骨細(xì)胞IL-8 的表達(dá)水平并無顯著影響（P>0.05）。產(chǎn)品含藥血清組IL-6 的表達(dá)水平與對照組相比均有顯著下降（P<0.05），說明產(chǎn)品組含藥血清可以有效地抑制軟骨細(xì)胞表達(dá)IL-6。IL-6 和IL-8 都屬于復(fù)雜的炎癥趨化性細(xì)胞因子，它們在機(jī)體中可以通過調(diào)節(jié)和刺激細(xì)胞的生長分化等過程來起到促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用[35?36]。

由圖8（C）可知，產(chǎn)品含藥血清組COX-2 和PGE2的表達(dá)水平與空白對照組相比均顯著下降（P<0.05），說明產(chǎn)品組含藥血清可以抑制軟骨細(xì)胞表達(dá)COX-2和PGE2。產(chǎn)品組內(nèi)中濃度組的PGE2 表達(dá)水平最低，且與其它兩組相比具有顯著性差異（P<0.05），此結(jié)果與上述2.5 和2.7 的結(jié)果相符，推測是由于高濃度組含藥血清中葡萄糖含量最高，高糖環(huán)境導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度加劇和細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而使高濃度組含藥血清對PGE2 表達(dá)的抑制效果弱于中濃度組。COX-2 是炎癥反應(yīng)過程中的關(guān)鍵酶，COX-2的分泌會導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)一步釋放炎癥因子，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的合成，從而促發(fā)炎癥反應(yīng)并介導(dǎo)軟骨細(xì)胞蛋白多糖分泌功能紊亂。PGE2屬于類花生酸類物質(zhì)，PGE2 可以通過刺激軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞直接影響軟骨細(xì)胞的正常生長和分化，還可以通過誘導(dǎo)MMP 等分解代謝物質(zhì)，抑制軟骨細(xì)胞分泌膠原蛋白和蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)[37?38]。

3 結(jié)論

本研究通過熱液化鱘魚魚骨及龍筋，熬煮和調(diào)味等處理，成功研制出一種鱘魚軟骨制品，結(jié)合產(chǎn)品的感官評價通過正交試驗確定了影響產(chǎn)品品質(zhì)因素的順序為熱液化溫度>熬煮時間>熬煮溫度>熱液化時間，最佳制作條件為熱液化溫度120 ℃、熱液化時間20 min、熬煮溫度80 ℃、熬煮時間30 min，在此條件下，產(chǎn)品的感官評分為59.69 分。此基礎(chǔ)上，采用IL-1β構(gòu)建軟骨細(xì)胞炎癥模型，以受試物對SD 大鼠進(jìn)行灌胃后制備含藥血清，在細(xì)胞實驗水平探究了鱘魚軟骨制品對炎癥狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞生理功能的影響。結(jié)果表明，產(chǎn)品含藥血清對軟骨細(xì)胞不具備細(xì)胞毒性，并且可以有效地保護(hù)炎癥軟骨細(xì)胞的增殖能力。同時，產(chǎn)品含藥血清還可以顯著抑制炎癥軟骨細(xì)胞NO、INOS、IL-6、COX-2 和PGE2 的表達(dá)水平（P<0.05），從而起到舒緩炎癥反應(yīng)進(jìn)程并維持軟骨細(xì)胞分泌膠原蛋白和蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)的正常生理功能的作用。綜上，本研究可以豐富鱘魚魚骨及龍筋的食品營養(yǎng)學(xué)理論基礎(chǔ)，為今后鱘魚軟骨制品預(yù)防和緩解骨性關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。