牛乳主要過敏原αS1-酪蛋白的純化鑒定及其多克隆抗體的制備

何圣發(fā)，龍彩云，王 嬌，熊 夢，趙江強(qiáng)，燕 燕，董亞萍，李 欣，陳紅兵

（1.贛南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與健康管理學(xué)院，江西贛州 341000；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；3.贛州市疾病預(yù)防控制中心，江西贛州 341000；4.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西南昌 330047；5.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌 330047）

牛乳具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，深受人們喜愛，但作為“八大過敏性食物”之一，由于攝入牛乳蛋白而引起的食物過敏現(xiàn)象也引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[1?4]。牛乳中有30 多種蛋白質(zhì)可能會導(dǎo)致過敏，其中αS1-酪蛋白不僅含量最高，其致敏性也更強(qiáng)[5?7]。因此，αS1-酪蛋白被認(rèn)為是牛乳中最重要的過敏原之一，可作為檢測食品中是否含牛乳蛋白的一個重要標(biāo)志物。而αS1-酪蛋白的純化及其特異性多克隆抗體的制備是建立αS1-酪蛋白檢測方法的物質(zhì)基礎(chǔ)。

αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白在牛乳中含量分別為12～15、3～4、9～11 和3～4 mg/mL，分子量分別為23.6、25.2、24.0 和19.0 kDa，等電點(diǎn)分別為4.9～5.0、5.2～5.4、5.1～5.4 和5.4～5.6[7]。這些理化性質(zhì)為各種酪蛋白的分離純化和鑒定提供了重要依據(jù)。例如，DEAE Sepharose Fast Flow、QSepharose 等陰離子交換層析（pH=7.0）是分離純化酪蛋白的常用方法[8?12]，根據(jù)αS1-酪蛋白的等電點(diǎn)最低及蛋白含量最高，可大致判斷αS1-酪蛋白的出峰時間最晚，且峰面積較大。另外，由于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）通常能較準(zhǔn)確地指示蛋白質(zhì)的分子量，因此是鑒定蛋白質(zhì)最常用的方法[13?15]。然而，研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白在SDS-PAGE中的遷移速度要比理論值更慢，尤其是由于αS1-酪蛋白的水合粒徑較大，導(dǎo)致其在SDS-PAGE 中位于34.5 kDa，遠(yuǎn)高于其實(shí)際分子量[16]。Treweek 等[17]通過質(zhì)譜技術(shù)證明αS1-酪蛋白在SDS-PAGE 中的位置高于αS2-酪蛋白。但目前有些研究僅根據(jù)各酪蛋白的分子量及其在SDS-PAGE 中的理論分布來判斷純化結(jié)果，導(dǎo)致各研究結(jié)果存在較大差異[8?11]。另外，雖然有少數(shù)研究通過質(zhì)譜、標(biāo)準(zhǔn)品對照等方法對純化的αS1-酪蛋白進(jìn)行鑒定，但未給出純化樣品的SDS-PAGE 圖[12,17?18]，從而無法給相關(guān)的純化研究提供準(zhǔn)確、直觀的參考。因此，有必要在充分利用各酪蛋白理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，結(jié)合其他技術(shù)方法對分離純化的αS1-酪蛋白進(jìn)行綜合準(zhǔn)確鑒定，以確保純化獲得的αS1-酪蛋白的可靠性，并提供分離純化的色譜圖和SDS-PAGE 圖，為相關(guān)研究提供科學(xué)、直觀的參考。

除了利用目標(biāo)蛋白的理化性質(zhì)對其進(jìn)行鑒定外，免疫學(xué)方法、質(zhì)譜方法等技術(shù)可進(jìn)一步為蛋白質(zhì)的鑒定提供有力保障。其中，免疫學(xué)技術(shù)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性來鑒別抗原蛋白，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)[19?21]?？贵w是免疫學(xué)鑒定抗原蛋白的關(guān)鍵，在未獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)而無法制備相應(yīng)抗體時，可以通過化學(xué)合成或原核表達(dá)等方法制備含目標(biāo)蛋白質(zhì)某些序列或全部序列的多肽或蛋白質(zhì)，并制備相應(yīng)的抗體[22?25]，再利用這些抗體對純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。另外，將質(zhì)譜技術(shù)與酶解和液相色譜等方法聯(lián)合，得到蛋白質(zhì)譜圖后，通過檢索數(shù)據(jù)庫，可以靈敏、準(zhǔn)確、高通量地鑒定蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，廣泛用于蛋白質(zhì)等物質(zhì)的鑒定與檢測[26?28]。

本研究將通過DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析對牛乳酪蛋白的各蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離，基于4 種酪蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)合SDS-PAGE、免疫學(xué)方法和質(zhì)譜技術(shù)等方法對純化的αS1-酪蛋白進(jìn)行綜合鑒定，并制備特異性識別αS1-酪蛋白的兔多克隆抗體（polyclonal antibody againstαS1-casein，pAb-αS1-CN），為αS1-酪蛋白免疫學(xué)檢測方法的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為其他過敏原蛋白的純化與鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8 周齡的雄性新西蘭大白兔 贛州蓉江新區(qū)潭東鎮(zhèn)天予養(yǎng)殖場；牛乳酪蛋白、α-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（HRP-IgG）二抗 美國Sigma公司；DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子柱材 美國GE 公司；TMB 底物試劑盒、預(yù)染蛋白Markers美國Thermo Fisher Scientific 公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、透析袋（分子截留量3500 Da）北京索萊寶科技有限公司；40%的丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液（29:1） 上海生工生物工程股份有限公司；96 孔酶標(biāo)板 無錫耐思生命科技股份有限公司。

ST16R 高速冷凍離心機(jī)、Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司；TH-500 梯度混合儀、BT-100 恒流泵、HD-3 紫外檢測儀、HD-A 層析圖譜采集分析儀、BS-100 自動部分收集器、層析柱（1.6 cm×50 cm） 上海滬西分析儀器廠有限公司；PB-30 pH計(jì)德國Sartorius 公司；Mini-PROTEAN Tetra 小型垂直電泳儀 美國Bio-Rad 公司；Amersham Imager 600 超靈敏多功能成像儀 美國GE 公司；FreeZone 2.5 L 立式冷凍干燥機(jī) 美國Labconco 公司；PL9620G 全自動洗板機(jī) 北京普朗新技術(shù)有限公司；MT60-4 恒溫微孔板振蕩器 深圳市優(yōu)米儀器設(shè)備有限公司；MS-H-ProT磁力攪拌器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 陰離子交換層析分離純化牛乳αS1-酪蛋白 稱取1 g 牛乳酪蛋白溶于50 mL 平衡緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，含有3.3 mol/L 尿素、20 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、0.12% [V/V]β-巰基乙醇，pH7.0），調(diào)pH 至7.0。采用DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析分離純化αS1-酪蛋白。先用平衡緩沖液平衡離子交換柱，然后加入10 mL 酪蛋白（20 mg/mL）。采用平衡緩沖液洗脫未被吸附的雜質(zhì)，流速為2 mL/min；然后用含0.02～0.5 mol/L NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行連續(xù)洗脫，流速為1.5 mL/min。收集洗脫樣品，6 mL/管。

1.2.2 SDS-PAGE 分析蛋白質(zhì)純度 SDS-PAGE 用來分析離子交換層析所得蛋白質(zhì)的組分與純度。SDS-PAGE 電泳采用4%的濃縮膠和12%的分離膠，凝膠厚度為1.0 mm，樣品上樣量為18 μL，Markers 上樣量為3 μL。電泳采用恒流模式，濃縮膠電泳條件為10 mA、30 min，分離膠電流為20 mA，直至溴酚藍(lán)跑至分離膠底端。電泳結(jié)束后，進(jìn)行剝膠、考馬斯亮藍(lán)染色、甲醇乙酸溶液脫色等程序。脫色完全后，利用Amersham Imager 600 進(jìn)行凝膠成像，通過ImageJ 軟件分析蛋白純度。

1.2.3 牛乳αS1-酪蛋白的鑒定 首先，按照課題組前期報(bào)道的方法[24]，制備了特異性識別αS1-酪蛋白9 個IgE 表位的多克隆抗體，然后以該多克隆抗體為一抗，通過間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）分析各峰樣品的免疫學(xué)反應(yīng)性。用包被液將各峰尖樣品進(jìn)行梯度稀釋（不稀釋、10 倍、100 倍、1000 倍），以包被液作為空白對照，每孔100 μL，3 個平行，4 ℃包被過夜。用PBST（PBS，含0.05% Tween-20）洗滌3 次后，每孔依次加入250 μL 3%的明膠、100 μL 一抗（稀釋2 萬倍）、100 μL HRP-IgG（稀釋1 萬倍），均于37 ℃、400 r/min振蕩孵育1 h（若無特殊說明，ELISA 的孵育條件均為37 ℃、400 r/min 振蕩孵育），每次孵育完后均用PBST 洗滌3 次。然后每孔加入100 μL TMB 工作試劑，孵育15 min 后，每孔加入50 μL 2 mol/L 的H2SO4終止反應(yīng)。最后，450 nm 測吸光值（optical density at 450 nm，OD450nm）。

另外，進(jìn)一步通過質(zhì)譜技術(shù)對αS1-酪蛋白進(jìn)行鑒定。將間接ELISA 確定為αS1-酪蛋白的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，染色、脫色后，將最粗的條帶切下，送上海生工生物工程股份有限公司（武漢）進(jìn)行MALDITOF-TOF 質(zhì)譜鑒定。

1.2.4 牛乳αS1-酪蛋白的冷凍干燥 對綜合鑒定為αS1-酪蛋白的樣品進(jìn)行透析和冷凍干燥。首先，按照說明書處理透析袋：剪取合適長度的透析袋，先用2%（W/V）NaHCO3和1 mmol/L EDTA（pH8.0）煮沸10 min，再用1 mmol/L 的EDTA（pH8.0）煮沸10 min，每次煮完后均用超純水徹底清洗透析袋。接著將αS1-酪蛋白樣品倒入透析袋中，用流動的自來水透析過夜除鹽，然后在磁力攪拌下用超純水透析2 次，每次3 h。然后，通過離心收集透析所析出的沉淀，并放入?80 ℃進(jìn)行冷凍。將αS1-酪蛋白樣品進(jìn)行冷凍干燥。最后，通過SDS-PAGE 分析凍干樣品的純度，其余樣品保存于?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 兔抗牛乳αS1-酪蛋白多克隆抗體的制備與特異性分析 按照課題組前期報(bào)道的方法[24]，制備pAb-αS1-CN 并分析其特異性。選取2 只8 周齡的新西蘭大白兔，雄性，分別標(biāo)記為兔A 和兔B，飼養(yǎng)于動物房。喂養(yǎng)不含牛乳蛋白的食物，喂養(yǎng)一周無異常后，開始免疫，每次免疫前，耳緣靜脈取血，用于監(jiān)測抗體效價(jià)變化。用PBS 將αS1-酪蛋白配成2 mg/mL的溶液，將等體積的αS1-酪蛋白溶液和弗氏佐劑混合進(jìn)行乳化，初次免疫用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑。采用背部皮下多點(diǎn)注射，每只兔子每次免疫 1 mL（1 mgαS1-酪蛋白）。每兩周免疫一次。免疫過程中，通過間接ELISA 監(jiān)測血清效價(jià)變化，當(dāng)效價(jià)不變或出現(xiàn)下降時結(jié)束免疫。免疫結(jié)束后，通過頸動脈采血，先將血液置于室溫1 h，然后置于4 ℃過夜，最后4500 g 離心5 min，收集上清液（血清），于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

通過競爭抑制ELISA 法分析pAb-αS1-CN 的特異性。在A 板中包被合適濃度的αS1-酪蛋白，4 ℃過夜。PBST 洗滌3 次后，用3%的明膠封阻，同時取一塊新板B 進(jìn)行封阻，孵育1 h。對A 板和B 板進(jìn)行洗滌后，B 板每孔加入70 μL 的αS1-酪蛋白或其他過敏原蛋白（牛乳α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、蛋清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白），以及70 μL pAb-αS1-CN，3 平行，孵育1 h。然后，從B 板每孔中取100 μL加到A 板中，A 板孵育1 h。洗滌后，每孔加100 μL HRP-IgG 二抗，孵育1 h。其余步驟同1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8 繪制圖形，通過SPSS 17 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05（*）和P<0.01（**）表示數(shù)據(jù)間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳αS1-酪蛋白的分離純化

牛乳酪蛋白的DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析圖譜如圖1 所示，共有4 個峰（A、B、C 和D）。由于αS1-酪蛋白在酪蛋白中的等電點(diǎn)最低（4.9～5.0）、含量最高[7]，因此αS1-酪蛋白在pH=7 的緩沖液中所帶電荷最大，需要更高的離子濃度才能將其洗脫下來，將是最后出峰，且峰面積最大。因此，結(jié)合酪蛋白的理化性質(zhì)，可以初步推斷D 峰為αS1-酪蛋白（圖1）。

圖1 牛乳酪蛋白的DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析圖譜Fig.1 Chromatogram of bovine casein using DEAE Sepharose Fast Flow anion-exchange chromatography

通過SDS-PAGE 對DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析的樣品（圖1，1～9）及牛乳蛋白進(jìn)行組分分析，結(jié)果如圖2 所示。從圖2A 可知，A 峰樣品（泳道1 和2）和B 峰樣品（泳道4 和5）及泳道3 的條帶位于25～30 kDa，C 峰（泳道6 和7）和D 峰（泳道8 和9）樣品在35 kDa 左右，且C 峰樣品的位置略低于D 峰，B 峰和D 峰樣品的條帶較粗。在牛乳蛋白中，αS1-酪蛋白不僅含量最高，其水合粒徑也較大，在SDS-PAGE 中的移動速度較慢，導(dǎo)致αS1-酪蛋白在SDS-PAGE 中的實(shí)際位置（34.5 kDa）高于其實(shí)際分子量（23.6 kDa），也高于αS2-酪蛋白和β-酪蛋白的位置[7,16?17]。因此，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和αS1-酪蛋白的理化性質(zhì)，可以推測D 峰為αS1-酪蛋白，與陰離子交換層析圖譜的分析結(jié)果一致。另外，脫脂牛乳、牛乳酪蛋白和牛乳α-酪蛋白（Sigma 標(biāo)品）的電泳結(jié)果如圖2B 所示，根據(jù)牛乳（泳道1）、酪蛋白（泳道2）和α-酪蛋白（泳道3）中的主要蛋白成分及其含量與分子量[7]，可以初步推斷a～f 分別為α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、κ-酪蛋白、β-酪蛋白、αS2-酪蛋白和αS1-酪蛋白。由此可知，圖2B 中的αS1-酪蛋白（f 條帶）和αS2-酪蛋白（e 條帶）的位置分別與圖2A 泳道9（D 峰）和泳道7（C 峰）的條帶位置一致。綜上，通過綜合分析牛乳各蛋白的理化性質(zhì)（等電點(diǎn)和含量）及其在電泳圖中的位置并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，可以判斷D 峰為αS1-酪蛋白。

圖2 DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析分離牛乳酪蛋白和牛乳蛋白的SDS-PAGE 圖Fig.2 SDS-PAGE profile of bovine casein purified by DEAE Sepharose Fast Flow and milk proteins

2.2 牛乳αS1-酪蛋白的免疫學(xué)方法鑒定

結(jié)合牛乳酪蛋白的理化性質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)品對照，已初步判斷D 峰為αS1-酪蛋白。為了進(jìn)一步從免疫學(xué)角度確定αS1-酪蛋白的出峰位置，以αS1-酪蛋白的IgE 表位多克隆抗體為一抗，通過間接ELISA 分析了第22、49、66 和77 管樣品（圖1，A～D 的峰尖樣品）與一抗的免疫反應(yīng)性，結(jié)果如圖3 所示。由于所用的一抗能特異性識別αS1-酪蛋白的多個IgE 表位，因此能與該抗體反應(yīng)的樣品則含有αS1-酪蛋白。從圖3 可知，A 峰樣品基本未與一抗反應(yīng)，表明A 峰不含αS1-酪蛋白。未稀釋的B 峰樣品與一抗有明顯反應(yīng)，但稀釋10 倍后沒有反應(yīng)，表明B 峰含有微量αS1-酪蛋白。C 峰樣品在低稀釋度時，有較強(qiáng)烈的反應(yīng)，但稀釋1000 倍時只有極輕微的反應(yīng)，表明C 峰樣品中含有少量αS1-酪蛋白。而不同稀釋度的D 峰樣品均與一抗有強(qiáng)烈反應(yīng)，表明D 峰含有大量αS1-酪蛋白。另外，C 峰和D 峰樣品與一抗的反應(yīng)強(qiáng)度隨樣品稀釋度的增加呈先增強(qiáng)后減弱趨勢，產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是：a.高濃度的NaCl 和尿素會抑制抗原的包被效果[29]，NaCl 和尿素的濃度隨樣品稀釋度的增加而降低，因此這種抑制作用也會隨樣品稀釋度的增加而減弱；b.樣品中αS1-酪蛋白的濃度也隨樣品稀釋度的增加而降低。由于樣品中αS1-酪蛋白濃度和NaCl 與尿素濃度的降低對αS1-酪蛋白的包被效果具有相反作用，這可能導(dǎo)致C 峰和D 峰樣品中αS1-酪蛋白的包被量隨樣品稀釋度的增加呈先增加后降低的趨勢，從而產(chǎn)生此現(xiàn)象?？傊?，從免疫學(xué)角度進(jìn)一步證明D 峰為αS1-酪蛋白。

圖3 間接ELISA 分析陰離子交換層析樣品的免疫反應(yīng)性（n=3）Fig.3 Analysis of immunoreactivity of bovine casein purified by DEAE Sepharose Fast Flow by indirect ELISA（n=3）

2.3 牛乳αS1-酪蛋白的質(zhì)譜鑒定

雖然免疫學(xué)方法鑒定D 峰為αS1-酪蛋白，但為了確證圖2A 泳道9 中含量最高的條帶是否為αS1-酪蛋白，進(jìn)一步對該條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，在uniprot 數(shù)據(jù)庫中共搜索到7 個蛋白，其中αS1-酪蛋白的分值最高（4395），而其他6 種蛋白質(zhì)只有16～42 分，分值越高說明匹配度越高。二級質(zhì)譜共鑒定出αS1-酪蛋白的7 條多肽（圖4A～G），覆蓋αS1-酪蛋白43.22%的氨基酸序列（圖4H）。而從文獻(xiàn)報(bào)道[30]和BLAST 序列對比分析可知，αS1-酪蛋白只與大豆蛋白（如Gly m5、P34）存在少量相似的氨基酸序列。因此，質(zhì)譜結(jié)果可以確定圖2A 泳道9 為αS1-酪蛋白。

圖4 泳道9（圖2A）的二級質(zhì)譜圖及其在αS1-酪蛋白氨基酸序列中的覆蓋區(qū)域Fig.4 Mass spectra and amino acid sequences in αS1-casein of lane 9 （Fig.2A）

2.4 牛乳αS1-酪蛋白的凍干樣品純度分析

雖然綜合αS1-酪蛋白的理化性質(zhì)、免疫學(xué)反應(yīng)性、質(zhì)譜技術(shù)等方法的結(jié)果確定D 峰為αS1-酪蛋白，但D 峰左側(cè)樣品中仍然含有少量αS2-酪蛋白（圖2，泳道8）。因此，為了提高αS1-酪蛋白的純度，通過SDS-PAGE 分析第75～83 管樣品（D 峰，297～332 min）中αS1-酪蛋白的純度，結(jié)果如圖5A 所示。D 峰樣品中αS1-酪蛋白的純度隨出峰時間推移，純度先升高后下降，泳道1～3 中含有少量αS2-酪蛋白，而泳道8 和9 的αS1-酪蛋白含量較少。因此，收集78～81 管樣品（泳道4～7）進(jìn)行透析。另外，由于酪蛋白的水溶性較差[31]，當(dāng)透析除去尿素后，大部分αS1-酪蛋白會析出形成沉淀，只有少量αS1-酪蛋白和αS2-酪蛋白會溶解在水中。因此，為了進(jìn)一步除去αS2-酪蛋白，提高αS1-酪蛋白的純度，對透析后的樣品進(jìn)行離心，并收集沉淀進(jìn)行冷凍干燥。最終，200 mg 酪蛋白可分離獲得21.75 mgαS1-酪蛋白，按αS1-酪蛋白占酪蛋白的40%計(jì)算，αS1-酪蛋白的純化得率為27.19%。凍干樣品的純度如圖5B 所示，泳道1 基本是αS1-酪蛋白，幾乎不含αS2-酪蛋白和其他牛乳蛋白，ImageJ 軟件灰度分析顯示αS1-酪蛋白的純度高達(dá)94.26%。

圖5 αS1-酪蛋白透析前后的SDS-PAGE 圖Fig.5 SDS-PAGE profile of αS1-casein before and after dialysis

國內(nèi)外分離純化αS1-酪蛋白的部分研究結(jié)果如表1 所示，本文和Treweek 等[17]均采取了質(zhì)譜技術(shù)等方法從多方面綜合確證了所純化的蛋白質(zhì)為αS1-酪蛋白，也有些研究以標(biāo)準(zhǔn)品或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參考來鑒定所純化的αS1-酪蛋白[12,18]，但它們均未提供αS1-酪蛋白的電泳圖，未能給相關(guān)研究提供更直觀的參考。雖然大部分報(bào)道均認(rèn)為αS1-酪蛋白在SDSPAGE 中的位置高于αS2-酪蛋白，但αS1-酪蛋白的具體位置卻存在一定差異，結(jié)果如表1 所示。然而，也有部分研究僅根據(jù)酪蛋白分子量來判斷αS1-酪蛋白在SDS-PAGE 中的理論位置，并認(rèn)為αS1-酪蛋白（23.6 kDa）的位置低于αS2-酪蛋白（25.2 kDa）[9]或β-酪蛋白（24.0 kDa）[10]，結(jié)果均與其他研究報(bào)道的不一致（表1），表明僅依據(jù)分子量是難以準(zhǔn)確判斷αS1-酪蛋白的純化結(jié)果。此外，本研究所純化的αS1-酪蛋白的純度也高于大部分報(bào)道的純度（表1），并對其進(jìn)行了綜合鑒定（圖2～4），也展示了αS1-酪蛋白的陰離子交換層析圖譜（圖1）及其電泳圖（圖2 與圖5），可為相關(guān)研究提供直觀的參考。

表1 αS1-酪蛋白不同分離純化方法的對比Table 1 Comparison of different methods for purifying αS1-casein

2.5 兔抗牛乳αS1-酪蛋白多克隆抗體的免疫學(xué)性質(zhì)分析

首先，通過方正滴定法確定最佳抗原包被濃度和二抗稀釋倍數(shù)，αS1-CN 的包被濃度梯度為4、2、1、0.5 μg/mL；A 兔的二免血清稀釋梯度為5000 倍、1 萬倍、2 萬倍、4 萬倍、8 萬倍和16 萬倍，同時以A 兔的陰性血清作為陰性對照；二抗的稀釋梯度為5000 倍和1 萬倍，選取OD450nm值為1.0 左右的抗原濃度和二抗稀釋倍數(shù)為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工作濃度。根據(jù)表2 結(jié)果可知，當(dāng)αS1-酪蛋白的被濃度為0.5 μg/mL，一抗稀釋2 萬倍，二抗稀釋5000 倍時，OD450nm值為1.003。因此，αS1-酪蛋白的最佳包被濃度為0.5 μg/mL，二抗的最佳稀釋度為5000 倍。

表2 間接ELISA 確定αS1-酪蛋白最佳抗原包被濃度和二抗稀釋倍數(shù)Table 2 Determination of the best antigen coating concentration of αS1-casein and dilution multiple of HRP-IgG by indirect ELISA

根據(jù)方正滴定法確定的αS1-酪蛋白包被濃度和二抗稀釋度，利用間接ELISA 監(jiān)測A 兔和B 兔在免疫過程中抗血清效價(jià)的變化，結(jié)果如圖6 所示。經(jīng)過5 次免疫后，A 兔和B 兔的最終效價(jià)分別為128 萬和32 萬。A 兔的效價(jià)更高，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 A 兔和B 兔的血清效價(jià)Fig.6 The serum titre of rabbit A and rabbit B

以αS1-酪蛋白為包被抗原，以αS1-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、蛋清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白為競爭蛋白，通過競爭抑制ELISA 分析pAb-αS1-CN的特異性，結(jié)果如圖7 所示。αS1-酪蛋白半抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）為2.38 μg/mL，除了與大豆蛋白有輕微交叉反應(yīng)外，與其他4 種競爭蛋白均無交叉反應(yīng)。國內(nèi)外研究從氨基酸序列對比、動物實(shí)驗(yàn)、過敏患者血清實(shí)驗(yàn)等方面也證實(shí)αS1-酪蛋白與大豆蛋白（如Gly m 5、P34 等）存在交叉反應(yīng)[30,33?35]。在本研究中，當(dāng)大豆蛋白濃度為100 μg/mL 時的抑制率為14.41%，低于αS1-酪蛋白濃度為0.25 μg/mL 時的17.52%。由此可推測pAbαS1-CN 與大豆蛋白的交叉反應(yīng)率低于0.25%。因此，所制備的pAb-αS1-CN 具有高特異性。

圖7 pAb-αS1-CN 與食物過敏原蛋白的交叉反應(yīng)（n=3）Fig.7 Cross-reactivity of pAb-αS1-CN with food allergen proteins (n=3)

3 結(jié)論

本研究采用DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析對牛乳αS1-酪蛋白進(jìn)行了分離純化，結(jié)合酪蛋白的理化性質(zhì)、SDS-PAGE、免疫學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對純化的αS1-酪蛋白進(jìn)行了綜合鑒定，結(jié)果表明在4 種酪蛋白中，αS1-酪蛋白的出峰時間最晚、峰面積最大，在SDS-PAGE 中的位置最高。利用酪蛋白不易溶于水的特點(diǎn)，進(jìn)一步通過透析除去樣品中的微量αS2-酪蛋白，最終獲得了純度高達(dá)94.26%的αS1-酪蛋白，純化得率為27.19%。所制備的兔抗αS1-酪蛋白多克隆抗體除了與大豆蛋白存在輕微交叉反應(yīng)（<0.25%）外，與其他過敏原蛋白沒有交叉反應(yīng)，表明具有高特異性。本研究對純化的αS1-酪蛋白進(jìn)行了綜合確證，并獲得了高純度的αS1-酪蛋白及其高特異性多克隆抗體，將為αS1-酪蛋白免疫學(xué)檢測方法的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為其他過敏原蛋白的分離純化與鑒定提供參考方法。