中華鱉酶解產物的理化性質及促成骨細胞增殖活性分析

林澤鑫，楊美蓮，吳 超，洪華貴，杜 明,

（1.大連工業(yè)大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，教育部海洋食品精深加工協同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034；2.江西神農氏生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限公司，江西鷹潭 335200）

中華鱉（Pelodiscus sinensis），又名水魚、團魚、甲魚，屬于卵生兩棲類爬行動物，外形似龜，背部沒有條紋，呈軍綠色，是一種高蛋白、低脂肪的水產品[1]。中華鱉的營養(yǎng)豐富且風味獨特，經研究，中華鱉可增強人體的免疫力，降低血糖血脂，且具有抗氧化活性[2?5]，含多糖、維生素、?；撬岷偷V物質等，人體必需氨基酸組成合理[6]。

中華鱉全身的利用價值極高，目前，國內對中華鱉加工方面的研究主要有對中華鱉裙邊膠原蛋白的制備、鑒定[7]；對酶解法制備中華鱉蛋白條件的優(yōu)化及分析[8]。張丹等[9]分析了中華鱉蛋白質含量、氨基酸組成，并評價中華鱉氨基酸的營養(yǎng)價值，馬夢嬌等[1]對中華鱉腿肉蛋白的結構組成及理化性質進行了分析，以上研究均證明了中華鱉是良好的蛋白質來源。Li 等[2]使用胃蛋白酶利用鱉甲制備膠原蛋白作為哺乳動物膠原蛋白的新替代品，并對其理化性質進行了分析，研究發(fā)現其有較高的熱穩(wěn)定性。

本研究以中華鱉蛋白質為原料，充分利用肌肉、裙邊、骨和鱉甲，提高了原料利用率。使用酶解法制備多肽混合物，并研究其理化性質和促成骨細胞增殖活性，為甲魚蛋白的深入研究開發(fā)提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍中華鱉 江西神農氏生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限公司提供；MC3T3-E1 成骨細胞 中國科學院上海細胞庫；MTT 生化試劑 美國Sigma 公司；二甲基亞砜 美國Gibso 公司；堿性蛋白酶（酶活為2×105U/g）、胃蛋白酶（酶活為5×105U/g） 北京Solarbio 公司；胰蛋白酶（酶活為2.5×105U/g） Amresco 公司；TEMED 生化試劑 美國Bio-Rad 公司。

Eon 酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；SKD-1000 全自動凱式定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；SCIENTZ-10ND 冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司；CF16RN 離心機 日本日立公司；LC-10Avp 高效液相色譜 日本島津公司；3000HSA 激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；J1500 圓二色光譜儀 日本JASCO 分光公司；F2700 熒光光譜儀日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中華鱉的預處理 將冷凍中華鱉自然解凍。根據處理方式的選擇，便于工廠加工處理，將解凍后的中華鱉分為骨和肉、殼和裙邊兩級。分級后的骨和肉用破壁器粉碎2 min，煮沸15 min；分級后的殼和裙邊依據熱壓提取法[10]，在電壓力鍋中按照115.34 ℃，70 kPa，料液比1:3 處理對中華鱉的殼和裙邊進行軟化。處理后仍無法軟化的胸骨，背甲放入60 ℃烘箱烘干4 h，粉碎，與軟化的部分混合，再次使用破壁機打碎1 min，使原料分布均勻。

1.2.2 中華鱉蛋白質含量的測定 將分級處理后的中華鱉分別在凍干機中凍干成粉，采用GB 5009.5-2016 中的自動凱氏定氮法[11]測定中華鱉蛋白質含量。

1.2.3 中華鱉蛋白質的酶解 對中華鱉的肌肉、裙邊分別進行酶解，酶的最適條件如表1 所示，料液比為1:3。按5000 U/g 酶添加量解蛋白2 h，每5 min記錄一次pH 變化。酶解結束后將pH 調至7.0，在100 ℃條件下滅酶10 min，冷卻后在10000×g 下離心15 min，取上清，500 Da 透析袋透析48 h，凍干成粉，分裝后放入干燥皿，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 酶的最適pH 和溫度Table 1 Optimal pH and temperature for enzymes

1.2.4 排阻色譜法測定酶解產物分子量分布 通過尺寸排阻色譜分析不同酶解條件制備的酶解產物的分子量[12]。使用純凈水稀釋樣品至5 mg/mL，0.22 μm水系膜過濾，色譜柱型號為TSK gel G2000SWXL，安捷倫1260 高效液相色譜。流動相為45%的乙腈，0.1%三氟乙酸的水溶液，將流速設置為0.5 mL/min，70 min，等梯度洗脫，柱溫設定25 ℃，進樣量采用10 μL，于214 nm 處進行檢測。

1.2.5 圓二光譜法分析酶解產物構象 根據蛋白質具有圓二色性，使用圓二色光譜儀在遠紫外區(qū)對酶解產物的構象掃描分析[13]。將多肽配制成0.25 mg/mL的溶液，CD 光譜儀使用0.1 cm 光程的石英池，通過改變波長λ，在190～250 nm 得到樣品的橢圓度。

1.2.6 內源熒光光譜分析酶解物結構變化 將多肽溶液濃度配制為2 mg/mL。將激發(fā)波長設置為290 nm，發(fā)射波長設置為250～400 nm，激發(fā)和發(fā)射的帶寬均設定為5 nm。使用熒光分光光度計測定不同酶解產物樣品的內置熒光光譜，用于觀察活性肽內部熒光基團的微活性進而得知多肽的結構變化[14]。

1.2.7 動態(tài)光散射分析酶解產物粒度 采用粒度分布儀，利用斯托克斯-愛因斯坦方程將顆粒的擴散與粒度結合起來，從而檢測出酶解產物中顆粒的粒度[15]。在酶解產物中加入10 mmol/L 碳酸緩沖液（pH7.0），將樣品溶液稀釋至2 mg/mL，0.22 μm 水系膜過濾，取1.2 mL 樣品進行測定。

1.2.8 酶解產物的氨基酸分析 用0.02 mol/L HCl將樣品稀釋至10 mg/mL，按體積比1:1 加丙酮，混勻。10000×g，10 min 離心后取1 mL 上清，旋蒸后用0.02 mol/L HCl 復溶，用于游離氨基酸測定。取10 mg 樣品于安培瓶中，加3 mL 6 mol/L 鹽酸，放入110 ℃烘箱水解22 h。取出1 mL 水解后的樣品，旋蒸，蒸干后用0.02 mol/L 鹽酸復溶，稀釋20 倍，用于總氨基酸測定。使用氨基酸分析儀對游離氨基酸和總氨基酸進行測定[16]。

1.2.9 MTT 法測定酶解產物促成骨細胞增殖活性MTT 法測定中華鱉多肽對MC3T3-E1 前成骨細胞的增殖情況[17?18]。將原代細胞傳代三次備用。在添加了1%的雙抗的α-MEM 培養(yǎng)基中加入10%體積分數的胎牛血清（FBS）作為細胞培養(yǎng)基。首先，于96 孔板中以密度為10000 個/孔對細胞進行接種，培養(yǎng)箱環(huán)境為5% CO2，37 ℃；培養(yǎng)24 h 后，空白對照組更換新鮮的完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入濃度為1、10 和100 μg/mL 的酶解產物（完全培養(yǎng)基配制），繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h。培養(yǎng)結束后，每孔細胞中加入10 μL 四甲基偶氮唑藍（MTT）溶液（濃度為5 mg/mL，PBS 溶解），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)基，避光加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），置于搖床搖動15 min。使用酶標儀在490 nm 處測吸光度值。計算每個孔中MC3T3-E1 細胞的活力作為活細胞的百分比。

1.3 數據處理

所有實驗數據均通過Excel 2016 進行統計分析。Origin 2021 進行圖形繪制。凱式定氮法測量中華鱉蛋白質含量，促成骨細胞增殖實驗有3 組平行。

2 結果與分析

2.1 中華鱉不同部位蛋白質含量

將中華鱉殼和裙邊、骨和肉兩部分分別進行勻漿后獲得的提取物經冷凍干燥獲得干粉。經凱式定氮法測得中華鱉殼和裙邊干粉蛋白含量為54.18%，骨和肉干粉蛋白質含量為80.38%。

2.2 中華鱉不同部位蛋白質酶解過程中pH 的變化規(guī)律

圖1～圖3 分別顯示了堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解骨和肉、殼和裙邊的pH 變化，以及酶解程度[19]。由圖1 可知，酶解的前5～10 min，由于酶切位點較多，酶解速率較快，pH 變化幅度較大，10 min后水解速率逐漸降低，100 min 后酶解速率逐漸降為0，曲線不再變化，堿性蛋白酶酶解骨和肉、殼和裙邊的pH 分別穩(wěn)定在7.17 和7.26；胃蛋白酶酶解骨和肉、殼和裙邊的pH 分別穩(wěn)定在2.70 和3.30（圖2）；胰蛋白酶酶解骨和肉、殼和裙邊的pH 穩(wěn)定在6.83和7.17（圖3）。堿性蛋白酶酶解效率較好，pH 變化幅度較大，胰蛋白酶在20 min 后酶解速率逐漸降低；而堿性蛋白酶、胃蛋白酶在50 min 后酶解速率逐漸保持不變。三種酶酶解殼和裙邊時，pH 均在前10 min內具有較大的變化幅度，推測殼和裙邊中的部分蛋白經過熱壓提取法處理后，具有更高的溶解性，與酶的結合更加敏感[20]，也有文獻指出在酶解草鱉時，pH 對酶解度有一定的影響[21]。

圖1 堿性蛋白酶酶解中華鱉不同部位過程中pH 隨時間的變化情況Fig.1 Changes in pH with time during enzymatic hydrolysis of different parts of the Chinese soft-shelled turtle by alkaline protease

圖2 胃蛋白酶酶解中華鱉不同部位過程中pH 隨時間的變化情況Fig.2 Changes in pH with time during enzymatic hydrolysis of different parts of the Chinese soft-shelled turtle by pepsin

圖3 胰蛋白酶酶解中華鱉不同部位過程中pH 隨時間的變化情況Fig.3 Changes in pH with time during enzymatic hydrolysis of different parts of the Chinese soft-shelled turtle by trypsin

2.3 酶解產物分子量分布規(guī)律

酶解中華鱉蛋白的分子量分布如圖4 所示。對于骨和肉、殼和裙邊來說，經胰蛋白酶解后，分子量大于10000 Da 的比例分別為0.77%、0.09%，小于1000 Da 的比例分別為76.02%和76.88%。堿性蛋白酶酶解后，分子量大于10000 Da 的比例分別為0.19%、0.43%，小于1000 Da 的比例分別為68.93%和77.27%。胃蛋白酶酶解后，分子量大于10000 Da的比例分別為19.27%和35.05%，其中小于1000 Da的比例分別為47.33%和44.57%。

圖4 酶解中華鱉不同部位酶解物的分子量分布Fig.4 The molecular weight distribution of the hydrolysates from different parts of the Chinese soft-shelled turtle

酶解殼和裙邊得到的產物中分子量大于10000 Da和小于1000 Da 的比例略大于骨和肉。堿性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解產物分子量集中分布于1000 Da以下，胃蛋白酶酶解產物中分子量分布較為均勻。說明pH、酶的種類和溫度對酶解產物的分子量存在一定影響。小于1000 Da 的肽更容易被吸收利用，從這個角度出發(fā)，堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解產物中易被人體吸收的部分更多。

2.4 酶解產物中肽的二級結構變化規(guī)律

遠紫外區(qū)圓二色光譜分析結果顯示（圖5），六種肽混合物在200 nm 左右均有一個負峰，說明各酶解產物的二級結構均以無規(guī)則卷曲為主。通過對圓二色光譜的峰譜進行指認發(fā)現各酶解物中還存在一定的β折疊和β轉角結構，且兩者占比均為27%和9%左右，不同的酶解條件并未造成酶解物二級結構的顯著變化。β折疊與水解產物二級結構的展開程度有關，氫鍵是維持β折疊結構的作用力，在多肽結構中起關鍵作用，研究表明，蛋白質的β折疊與其凝膠性和持水性呈正相關[22?23]，該結果表明中華鱉酶解產物可能具有較好的凝膠性和持水性。

圖5 圓二色光譜分析結果Fig.5 Circular dichroic spectrum analysis results

2.5 酶解產物分子表面熒光變化規(guī)律

蛋白質的內源熒光性主要由芳香族氨基酸決定，其中色氨酸殘基為最主要的發(fā)色基團。酶解過程中多肽色氨酸殘基的熒光強度因酶解環(huán)境的pH、溫度、酶種類以及酶解部位的變化而改變[24]，通過蛋白自身所含有的內源熒光性色氨酸的特征峰峰譜位置，可以表征蛋白內部結構的松散程度，進而可以分析蛋白的三級結構。

如圖6 所示，胰蛋白酶處理的殼和裙邊制備的肽熒光強度最高，胰蛋白酶處理的骨和肉次之。然而，堿性蛋白酶處理殼和裙邊制備的肽熒光強度最低。這些結果表明，對于酶解制備的肽，堿性蛋白酶效果和其他酶效果相比，多肽的展開程度較大，色氨酸暴露發(fā)生淬滅反應，導致熒光強度降低。

圖6 內源熒光光譜分析結果Fig.6 Analysis results of endogenous fluorescence spectroscopy

從圖中可以看出，不同酶解條件下的酶解產物中，峰出現的位置均在293 nm 附近，表示微環(huán)境中色氨酸疏水性強弱并無明顯變化，酶解產物的高級結構之間并無明顯差別[25]。

2.6 動態(tài)光散射分析結果

由圖7 可知，每種酶解產物內顯示有兩種峰，集中分布于20 和200 nm 區(qū)域內，原因是酶解后蛋白質的分子結構發(fā)生改變，酶解產物的分子重新凝集，形成小的粒度分布區(qū)域[26]。

圖7 動態(tài)光散射分析結果Fig.7 Dynamic light scattering analysis results

不同酶解條件制備的肽有不同的粒徑分布情況。胰蛋白酶處理殼和裙邊、骨和肉制備的酶解產物粒徑較大，堿性蛋白酶、胃蛋白酶制備的酶解產物粒徑較小。謝雯雯等[27]研究發(fā)現，蛋白酶解混合物的粒徑對于鈣的吸收率有一定的影響，推測是由于隨著粒徑減小，與受體的接觸面積增大，加強了鈣的吸收。由此推測，堿性蛋白酶和胃蛋白酶制備的酶解產物可能相較于其他酶解物更能促進鈣的吸收。

2.7 酶解產物的總氨基酸分析

由表2 可知，在六種酶解產物中，胃蛋白酶酶解中華鱉骨和肉的總氨基酸含量最高，達到945.10 mg/g，其中必需氨基酸的總量占39.81%；胃蛋白酶酶解殼和裙邊的總氨基酸含量最低，僅有139.52 mg/g，但必需氨基酸比例仍有29.89%。胰蛋白酶酶解骨和肉、殼和裙邊的必需氨基酸占比分別為33.2%和23.82%。堿性蛋白酶酶解骨和肉、殼和裙邊的必需氨基酸占比分別為21.49%和30.9%。不同酶解產物中總氨基酸發(fā)生差別的原因是酶解后將溶液pH 調至7，離心取上清液，經透析，凍干兩步，部分氨基酸被除去。對三種酶解產物的總氨基酸分析發(fā)現，必需氨基酸中賴氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸含量較高，非必需氨基酸中甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量較高。膠原蛋白中甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸為主要氨基酸[28]，在骨中起到保護作用，因此也與骨質疏松的發(fā)生密切相關[29]，有文獻證明牦牛骨膠原蛋白肽可以顯著促成骨細胞增殖[30]，說明中華鱉酶解產物具有預防骨質疏松的潛力。

表2 中華鱉蛋白酶解物的總氨基酸含量Table 2 Total amino acid content of enzymatic hydrolysate of Chinese soft-shelled turtle protein

同時酶解產物中天冬氨酸和谷氨酸含量也較高，天冬氨酸為鳥氨酸循環(huán)的重要代謝產物，可降低血液中氮和CO2的量，從而消除疲勞。谷氨酸則主要用于制造化學調味料、香料、生物化學試劑等[31]，說明中華鱉酶解產物在食品領域及醫(yī)療領域都有潛在的應用前景。

2.8 酶解產物的游離氨基酸分析

由表3 可知，經過2 h 水解后，堿性蛋白酶水解殼和裙邊制備的功能性肽中游離氨基酸如苯丙氨酸含量較高；水解骨和肉制備的活性肽中酪氨酸和苯丙氨酸含量較高。胰蛋白酶的水解產物和胃蛋白酶處理骨和肉后苯丙氨酸含量較高。胃蛋白酶水解殼和裙邊后均沒有發(fā)現較高的游離氨基酸。出現上述現象的原因主要是不同酶的酶切位點不同以及不同部位氨基酸的含量差異。在六種酶解產物中，均未檢測出色氨酸和脯氨酸，可能原因是酶解物中這兩種氨基酸含量較低，未檢測到。主要風味物質中，苦味物質要多于甜味和香味物質，其中，堿性蛋白酶的酶解產物中苦味氨基酸要多于胰蛋白酶和胃蛋白酶，可能是由于酶切位點不同，從而導致堿性蛋白酶的酶解物中苦味氨基酸數量更多。

表3 中華鱉蛋白的酶解物游離氨基酸含量Table 3 Free amino acid content of enzymatic hydrolysate of Chinese soft-shelled turtle protein

2.9 成骨細胞增殖活性

由圖8 可知，使用三種不同酶酶解甲魚骨肉、殼和裙邊得到的六種酶解產物在1～100 μg/mL 下對MC3T3-E1 細胞無毒副作用。酶解產物作用于細胞24 h 時，中華鱉殼和裙邊的酶解物、堿性蛋白酶酶解骨和肉的酶解產物在100 μg/mL 下對成骨細胞均有一定的促增殖活性，胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解殼和裙邊的酶解產物在10 μg/mL 下對成骨細胞有一定的促增殖活性，與空白對照組相比，有顯著性差異（P<0.05）。作用時間達到48、72 h 后，該促增殖活性也變得更加顯著（P<0.05）。干預至48 h 時，除胃蛋白酶酶解的骨肉酶解產物外，其他酶解物在100 μg/mL下均能顯著促進成骨細胞增殖（P<0.05）。培養(yǎng)至72 h 后，中華鱉不同酶酶解物均顯示出顯著的促成骨細胞增殖活性（P<0.05）。其中，中華鱉殼的酶解物活性均優(yōu)于骨肉部分的，且胃蛋白酶酶解肽的促成骨細胞增殖活性略優(yōu)于胰蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解物。總的來說，中華鱉各酶解物均具有一定的促骨細胞增殖活性，有潛在的骨密度調節(jié)活性[32]。

圖8 24、48、72 h 后三種濃度下不同酶解產物成骨細胞存活率Fig.8 The survival rate of osteoblasts from different enzymatic hydrolysis products at three concentrations after 24,48,72 h

3 結論

本研究測定的中華鱉殼和裙邊干粉蛋白含量為54.18%，骨和肉干粉蛋白質含量為80.38%。經胰蛋白酶，堿性蛋白酶酶解后產物分子量分布集中于1000 Da 以下，更適合人體吸收，經過胃蛋白酶酶解后產物分子量分布較為均勻，中華鱉骨和肉的酶解產物中必需氨基酸總量達到39.81%，顯示了中華鱉蛋白酶解物的營養(yǎng)特性。三種酶解產物中甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸含量較高。同時，由殼和裙邊制備的酶解產物在100 μg/mL 濃度時能顯著促進成骨細胞增殖（P<0.05），提示其具有潛在的骨密度調節(jié)活性。本研究從實際應用出發(fā)，為工廠精深加工中華鱉以及中華鱉增強骨密度肽的深入研發(fā)提供了一定的理論依據。