槲皮素、蘆丁與大豆分離蛋白非共價作用機(jī)制及其功能性和消化性研究

趙鉅陽，袁惠萍，孫昕萌，金 聰

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

黃酮類多酚具有較強(qiáng)的抗氧化[1]、抑菌[2]、抗衰老[3]等功效，并參與癌癥、炎癥、糖尿病等疾病的治療[4]。蛋白質(zhì)是食物的重要組成成分，而多酚作為次級代謝產(chǎn)物大量存在于植物中。蛋白質(zhì)和多酚是多種食品中共存的重要成分，食品系統(tǒng)的成分多種多樣，成分之間的相互作用對食品的生產(chǎn)、加工和營養(yǎng)價值起著至關(guān)重要的作用。

蛋白質(zhì)和多酚之間的相互作用可生成“蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物”，在大多數(shù)食品系統(tǒng)中自發(fā)進(jìn)行。多酚與蛋白質(zhì)相互作用方式主要分為非共價和共價相互作用[5]，其中，非共價相互作用具有作用方式簡便，無副產(chǎn)物等優(yōu)勢，主要通過氫鍵、范德華力和疏水力等方式起作用。目前，已有相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，多酚/蛋白相互作用會影響蛋白質(zhì)的部分功能性質(zhì)，如蛋白質(zhì)與多酚相互作用會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的凈電荷發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的溶解性[6]。由于蛋白質(zhì)的溶解性是其他功能性質(zhì)的前提，研究也發(fā)現(xiàn)多酚與蛋白非共價相互作用還可提高蛋白的乳化能力及凝膠能力，如表沒食子兒茶素沒食子酸酯[7]與乳清蛋白互作可提高乳清蛋白的乳化活性，裘樂蕓等[8]研究發(fā)現(xiàn)添加表沒食子兒茶素沒食子酸并微波加熱后肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度可提高89.8%。但另一方面，研究也發(fā)現(xiàn)多酚/蛋白復(fù)合后，蛋白質(zhì)消化特性會受到負(fù)面影響，如Petzke 等[9]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸與乳清蛋白相互作用后會降低乳清蛋白的消化率，劉勤勤[10]研究表明茶多酚的添加不利于大豆分離蛋白在胃腸道里的消化吸收。然而諸如槲皮素、蘆丁等此類黃酮多酚與SPI 互作后，對SPI 功能特性的影響及其機(jī)制研究還不明晰。

因此，本文通過構(gòu)建兩種黃酮（槲皮素、蘆丁）與大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）復(fù)合物，分別考察槲皮素、蘆丁對SPI 部分功能性與體外模擬胃腸道消化性的影響，以期開發(fā)新型多功能黃酮類多酚的蛋白型包合物，為SPI、槲皮素和蘆丁的應(yīng)用范圍提供新思路和基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 純度98.54%，實驗室自制；脫脂豆粕 蛋白質(zhì)含量49.60%，哈爾濱市賓縣禹王植物蛋白有限公司；槲皮素 純度>98%，酷爾化學(xué)科技有限公司；蘆丁 純度>98%，合肥博美生物科技有限公司；大豆油 特級，九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS） 分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純，北京新光化工試劑廠；胃蛋白酶（酶活力1:3000）、胰脂肪酶（酶活力30000 U/g）、胰酶（1:4000）、膽鹽（純度≥60%） 上海源葉生物科技有限公司。

TMS-Touch 250N 質(zhì)構(gòu)儀 Food Technology Corporation；H1850R 高速離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-800 紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司；K9860 全自動凱氏定氮儀山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白提取 根據(jù)Speroni 等[11]的方法，采用堿溶酸沉法提取大豆分離蛋白。400 g 脫脂豆粕加入6 L 蒸餾水中，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)至pH7.8，攪拌2 h 后，將溶液于4000×g 離心15 min，取其上清液用2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.5，于4 ℃環(huán)境靜置2 h，倒去上清液，將剩余的沉淀于8000×g下離心10 min，離心后取底部沉淀，用5 倍體積蒸餾水水洗后，于4000×g 離心10 min，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至蛋白溶液pH7 即可，溶液預(yù)先冷凍并真空干燥48 h 研磨備用，即可獲得大豆分離蛋白。

1.2.2 SPI-槲皮素和SPI-蘆丁復(fù)合物制備 SPI-槲皮素和SPI-蘆丁復(fù)合物是通過非共價作用制備的[12]，制備方法稍作修改如下：將1 g SPI 溶解在49 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.0）中，向該混合物中添加不同比例（0%、2%、4%、6%、8%、10%）的蘆丁和槲皮素于25 ℃磁力攪拌器攪拌2 h。將反應(yīng)樣品透析48 h（分子量截止值：8000～14000 Da），每6 h 更換一次水以確保完全透析，使用紫外分光光度計記錄透析液在槲皮素374 nm，蘆丁266 nm 處有沒有吸收峰，所有未反應(yīng)的多酚被完全去除，透析液預(yù)先冷凍并真空干燥48 h 備用。

1.2.3 復(fù)合物功能性的測定

1.2.3.1 溶解性的測定 稱取適量槲皮素、蘆丁與SPI復(fù)合物溶于pH7.0 的0.01 mol/L PBS，保證SPI 濃度為10 mg/mL，于8000×g，15 min 離心，取0.1 mL離心后的上清液，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑，充分混合，放置10 min，以試劑空白為對照，測定波長595 nm 處的吸光度，平行三次。根據(jù)上述所得標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線公式（y=0.0788x?0.1063，R2=0.9930），求得添加不同濃度槲皮素或蘆丁下SPI 的蛋白濃度[13]。

1.2.3.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定 根據(jù)Pan 等[14]的方法測定大豆蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性。稱取適量槲皮素、蘆丁與SPI 復(fù)合物，保證SPI 濃度為10 mg/mL，取8 mL 配制好的樣品加入2 mL 的大豆油，以12000 r/min 高速勻漿1 min 后，立刻在試管底部取50 μL 樣品，然后加入到5 mL 0.1% SDS 溶液中，于500 nm 處測定其吸光值，后將取樣后的樣品于室溫下靜置10 min，再次取樣，測定方法同上，實驗平行三次。

乳化活性（EAI）及乳化穩(wěn)定性（ESI）分別根據(jù)下式進(jìn)行計算：

式中：EAI：1 g 蛋白質(zhì)的乳化區(qū)域，m2/g，C：蛋白質(zhì)濃度，g/mL；φ：油相體積分?jǐn)?shù)（v/v），即油相占的比例，本實驗中油相占1/4，故φ=0.25；D：稀釋倍數(shù)為100；A0：500 nm處0 min 的吸光值；A10：500 nm 處10 min 的吸光值。

1.2.3.3 凝膠性測定 稱取適量槲皮素、蘆丁與SPI 復(fù)合物，保證SPI 濃度為120 mg/mL，每組樣品90 ℃水浴加熱30 min，冷卻后放置于4 ℃冰箱中貯藏12 h。測量前將樣品取出，室溫下穩(wěn)定恢復(fù)30 min，室溫下用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測量，選用P/0.5 的探頭，以凝膠硬度進(jìn)行測定，測前速度：60 mm/min，測試速度：120 mm/min，測后速度：300 mm/min，壓縮型變量：40%，記錄測試峰的頂點(diǎn)，即為測定凝膠的硬度（N）。重復(fù)三次平行實驗，取平均值[15]。

1.2.4 消化特性測定 稱取適量槲皮素、蘆丁與SPI 復(fù)合物，保證SPI 濃度為10 mg/mL，采用模擬體外消化模型來測定大豆分離蛋白消化特性，參考Brodkorb 等[16]的消化模型，參考Mao 等[17]的方法制備模擬消化液，適當(dāng)修改。胃液（包含2 g/L NaCl、7 mL/L HCl 和3.2 g/L 胃蛋白酶）用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)至pH1.2，預(yù)熱至37 ℃后，與預(yù)熱至37 ℃的樣品以1:1 的體積比混合，采用1 mol/L NaOH 將混合體系pH 迅速調(diào)節(jié)至2.0，于37 ℃振蕩（100 r/min）消化2 h。在胃消化0、30、60、90、120 min 處取消化樣品，于8000×g，15 min 離心后分別測定其在520 nm 條件下的吸光值。取30.0 mL 胃消化后的食糜，用2 mol/L NaOH 迅速將混合后的體系調(diào)至pH6.8，分別與1.5 mL 電解質(zhì)溶液（二水氯化鈣36.70 mg/mL、氯化鈉218.70 mg/mL），2.5 mL 膽鹽溶液（膽鹽0.08 mg/mL）和3.5 mL 酶溶液（胰酶0.02 mg/mL、胰脂肪酶0.02 mg/mL）混合均勻，采用1 mol/L NaOH 將混合體系pH 迅速調(diào)節(jié)至7.0，于37 ℃恒溫振蕩（100 r/min）消化2 h，分別在腸消化0、30、60、90、120 min 處分別取消化樣品，測定其在520 nm 條件下的吸光值。

將各個時間點(diǎn)的樣品離心后，已消化的蛋白質(zhì)含量通過上清液的吸光值代入蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 紫外吸收光譜測定 用10 mmol/L，pH7.0 PBS 稀釋至樣品中蛋白質(zhì)濃度為1 mg/mL，用紫外分光光度計掃描其紫外吸收譜圖，掃描波長范圍為200～400 nm，掃描間隔λ=1 nm，掃描速度：100 nm/min，其中，用磷酸鹽緩沖溶液作為空白調(diào)零[18]。

1.2.6 熒光光譜測定 用10 mmol/L，pH7.0 PBS 稀釋至樣品中蛋白質(zhì)濃度為0.1 mg/mL，測定樣品的熒光光譜，設(shè)置激發(fā)波長295 nm，掃描范圍為300～500 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬為5 nm，掃描速度為500 nm/min，分別在293 和310 K 的恒溫條件下收集熒光光譜信息，每組樣品重復(fù)測定三次[19]。

式中，F(xiàn)0為不添加槲皮素/蘆丁時SPI 的熒光強(qiáng)度；F 為添加槲皮素/蘆丁時SPI 熒光強(qiáng)度；kq為分子淬滅常數(shù)；kSV為Stern-Volmer 淬滅常數(shù)；τ0為不添加槲皮素/蘆丁時熒光物質(zhì)的平均壽命（對于蛋白質(zhì)等生物大分子，熒光壽命一般為10?8s）。將Stern-Volmer 方程轉(zhuǎn)化為公式（4）可進(jìn)一步分析出兒茶素與SPI 相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)。

式中：Kb為SPI 與槲皮素/蘆丁的結(jié)合常數(shù)；n 為二者結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)，根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果可繪制與log[Q]的關(guān)系，并確定截距Kb和斜率n。

根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)的評估槲皮素/蘆丁與SPI 之間的相互作用力，由公式（5）、（6）和（7）推算槲皮素/蘆丁與SPI 結(jié)合的吉布斯自由能（ΔG）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Statistix 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性。使用Excel 和Sigmaplot 14.0 軟件進(jìn)行表與圖的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合體系溶解性分析

溶解度是蛋白質(zhì)在復(fù)雜食品系統(tǒng)中發(fā)揮功能性質(zhì)（如乳化特性）的先決條件[20]。圖1 表示了槲皮素-SPI 復(fù)合物和蘆丁-SPI 復(fù)合物中蛋白的溶解度，隨著槲皮素添加量的增加，SPI 溶解性呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，不同添加量槲皮素的溶解性顯著高于對照組（P<0.05），槲皮素添加量為4%時，SPI 溶解性比對照組可提高10.06%，這是由于槲皮素中含有羥基基團(tuán)，通過氫鍵、疏水及靜電吸附等方式與蛋白質(zhì)結(jié)合[21]，導(dǎo)致SPI 親水性增加，增強(qiáng)了SPI 的水合作用，SPI 的溶解性有所提高。槲皮素添加量為4%、6%、8%和10%時溶解度未見顯著性增加（P>0.05），可能是由于槲皮素的疏水基團(tuán)數(shù)目有限，與SPI 結(jié)合程度已達(dá)最大。由圖1 所示，隨著蘆丁添加量的增加，SPI 溶解性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，蘆丁添加量為6%時，和對照組相比，SPI 溶解性可提高19.27%，這是由于蘆丁含有羥基基團(tuán)能與水分子形成氫鍵，從而增強(qiáng)了蛋白的水合作用，因而SPI 的溶解性有所提高，但SPI 溶解度的下降可能是由于蘆丁濃度過高，導(dǎo)致其與部分蛋白發(fā)生穩(wěn)定結(jié)合后，形成相對穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成絮狀物沉淀[22]，由此降低了SPI 在水中的溶解度。已有相關(guān)研究人員[23]發(fā)現(xiàn)，由于溶菌酶、核桃蛋白和馬鈴薯蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)與酚類化合物的相互作用，其溶解度降低，這可能是由于蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)交聯(lián)以及蛋白質(zhì)分子的凈電荷和親水/疏水性質(zhì)改變的原因。

圖1 槲皮素-SPI 復(fù)合物和蘆丁-SPI 復(fù)合物中蛋白的溶解度Fig.1 The solubility of SPI in quercetin-SPI complexes and rutin-SPI complexes

2.2 復(fù)合體系乳化性的分析

圖2a、b 分別表示了槲皮素-SPI 復(fù)合物和蘆丁-SPI復(fù)合物中蛋白的EAI 和ESI。由圖2 可知，隨著槲皮素添加量的增加，SPI 的EAI 和ESI 都呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，添加槲皮素的SPI 其EAI 和ESI 顯著高于對照組（P<0.05），并且槲皮素添加量為4%時，和對照組相比，SPI 的EAI 和ESI 分別提高20.84%及11.44%。蛋白質(zhì)的乳化特性取決于其擴(kuò)散到油/水界面的能力[24]，SPI 可作為表面活性劑，吸附到油滴表面形成界面膜，穩(wěn)定乳狀液，EAI 的提高是由于暴露的芳香殘基數(shù)量增加，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)對油水界面的親和力增加，且聚集的SPI 形成了更厚的蛋白膜，從而為液滴提供了更好的乳化穩(wěn)定性[25]。槲皮素的添加量為6%、8%和10%時，此時SPI 的EAI無顯著性差異（P>0.05），可能是由于SPI 暴露的芳香氨基酸數(shù)量不再增加。

圖2 槲皮素-SPI 復(fù)合物和蘆丁-SPI 復(fù)合物中蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性Fig.2 The emulsifying activity and emulsifying stability of SPI in quercetin-SPI complexes and rutin-SPI complexes

如圖2 所示，隨著蘆丁添加量的增加，SPI 的EAI 和ESI 都呈現(xiàn)先增加后略有下降的趨勢，添加蘆丁的SPI 其EAI 和ESI 顯著高于對照組（P<0.05），當(dāng)蘆丁添加量為4%時，和對照組相比，SPI 的EAI提高26.17%，當(dāng)蘆丁添加量為6%時，和對照組相比，SPI 的ESI 分別23.54%。SPI 與蘆丁相互作用后的構(gòu)象變化會影響其表面性質(zhì)，從而形成穩(wěn)定的乳液系統(tǒng)，因此，SPI-蘆丁形成的乳液的穩(wěn)定性優(yōu)于SPI 形成的乳液。后續(xù)對結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明槲皮素和蘆丁誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。因此，SPI 表面性質(zhì)的構(gòu)象變化導(dǎo)致乳化性能的改善。Li 等[26]研究發(fā)現(xiàn)與花青素結(jié)合后，水稻蛋白的EAI 和ESI 得到了提高，原因可能是與花青素結(jié)合后蛋白質(zhì)構(gòu)象和界面行為改變有關(guān)。

2.3 復(fù)合體系凝膠性的分析

圖3 表示槲皮素-SPI 復(fù)合物和蘆丁-SPI 復(fù)合物中蛋白的凝膠硬度，槲皮素添加量（除添加量8%外）對SPI 凝膠性的影響無顯著性差異（P>0.05），槲皮素的添加量為8%時，和對照組相比，SPI 凝膠硬度提高23.23%，此時SPI 的凝膠性顯著高于其他組（P<0.05），這是由于槲皮素酚羥基的數(shù)量較少，氫鍵相互作用能力弱，但槲皮素添加量在8%時可能增加槲皮素與SPI 的氫鍵相互作用力，從而影響凝膠硬度。隨著蘆丁添加量的增加，SPI 凝膠硬度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，不同添加量蘆丁的SPI 凝膠硬度顯著高于對照組（P<0.05），蘆丁添加量在8%時，和對照組相比，SPI 凝膠硬度可提高 187.18%。這是由于蘆丁與蛋白質(zhì)相互作用后，蛋白分子間碰撞的機(jī)會和結(jié)合程度增加，氫鍵作用能力增加，從而增強(qiáng)了凝膠的硬度。隨著蘆丁濃度的增加，與SPI 結(jié)合的羥基數(shù)量逐漸增加，慢慢趨于飽和，多余的羥基與氨基酸殘基繼續(xù)反應(yīng)，會破壞已形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)固性，因此，二者復(fù)合物的凝膠性降低[27]。Yan 等[28]研究表明蘆丁和沒食子酸可提高凝膠強(qiáng)度，其原因可能是沒食子酸和蘆丁分子在凝膠形成過程中主要與明膠分子的骨架和羧基相互作用。

圖3 槲皮素-SPI 復(fù)合物和蘆丁-SPI 復(fù)合物中蛋白的凝膠硬度Fig.3 The gel hardness of SPI in quercetin-SPI complexes and rutin-SPI complexes

2.4 復(fù)合體系消化特性的分析

圖4 代表槲皮素-SPI 復(fù)合物和蘆丁-SPI 復(fù)合物中蛋白的胃腸消化。添加槲皮素、蘆丁的SPI 生物利用度明顯高于對照樣，這種現(xiàn)象可以歸因于SPI經(jīng)胰酶消化后可迅速被膽鹽降解，槲皮素、蘆丁的添加可以保護(hù)SPI 被膽鹽降解，槲皮素、蘆丁的添加可以提高SPI 的生物利用度。但是不同添加量的槲皮素、蘆丁之間生物利用度無明顯差異。SPI 生物利用度在消化30 min 時迅速增加，這是因為初始階段，胃蛋白酶充足，滿足SPI 消化的條件，隨著消化時間的增加，胃蛋白酶被消化，從而SPI 生物利用度略有降低。腸道消化階段，除腸道消化240 min 時，SPI的生物利用度無明顯差異。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)多酚都能保護(hù)蛋白質(zhì)免受胃蛋白酶消化的影響，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的腸道消化出現(xiàn)總體輕微延遲[29]，也有部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)多酚可減弱對消化酶的抑制作用，如Naz 等[30]研究發(fā)現(xiàn)EGCG 對消化酶的抑制作用被唾液中富含脯氨酸蛋白減輕了2～6 倍，從而影響生物利用度。

圖4 槲皮素-SPI 復(fù)合物和蘆丁-SPI 復(fù)合物中蛋白的胃腸消化Fig.4 The gastrointestinal digestion of SPI in quercetin-SPI complexes and rutin-SPI complexes

2.5 紫外-可見吸收光譜遷移分析

紫外-可見吸收光譜法是一種非常簡單有效的方法，常被用于探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化和研究配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。SPI 有兩個吸收峰：由蛋白質(zhì)肽鍵引起的強(qiáng)吸收峰（220 nm）和由芳香族氨基酸引起的弱吸收峰（280 nm）[31]。圖5 表示了不同槲皮素、蘆丁添加量對大豆分離蛋白紫外可見光譜的影響。隨著槲皮素、蘆丁的添加，SPI 在280 nm 附近的吸收峰強(qiáng)度逐漸減小，而SPI 在220 nm 附近的吸收峰強(qiáng)度逐漸增大，槲皮素、蘆丁在200～300 nm 范圍內(nèi)沒有吸收，因此，SPI 吸收強(qiáng)度的降低可能是槲皮素、蘆丁與SPI 相互作用的結(jié)果。加入槲皮素、蘆丁后，吸收峰在220 nm 附近增加，推測蛋白質(zhì)肽鍵參與了槲皮素、蘆丁與SPI 相互作用的過程，且說明槲皮素、蘆丁與SPI 的結(jié)合引起了SPI 的構(gòu)象變化。

圖5 槲皮素、蘆丁不同添加量對大豆分離蛋白紫外可見光譜的影響Fig.5 The effect of quercetin,rutin on the UV-Vis spectra of soy protein isolate

2.6 熒光淬滅機(jī)制分析

圖6 代表不同槲皮素、蘆丁添加量對大豆分離蛋白熒光光譜及Stern-Volmer 圖的影響，在溫度298、310 K 條件下，隨著槲皮素、蘆丁的加入，箭頭表示槲皮素、蘆丁添加量從0%～10%，SPI 的熒光強(qiáng)度有明顯減弱，且各溫度下都表現(xiàn)出不同程度的藍(lán)移現(xiàn)象，表明槲皮素、蘆丁和SPI 發(fā)生了相互作用使得部分色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基暴露，疏水環(huán)境的極性減弱，疏水性增加，肽鏈的伸展程度有所減弱[32]，從而增加了蛋白分子間的碰撞機(jī)會、結(jié)合程度和氫鍵作用能力，凝膠硬度得到改善。槲皮素-SPI復(fù)合物、蘆丁-SPI 復(fù)合物由于疏水性增加且結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，SPI 溶解性、乳化性和凝膠性得到了提高。

圖6 槲皮素、蘆丁不同添加量對大豆分離蛋白熒光光譜及Stern-Volmer 圖的影響Fig.6 The effect of quercetin,rutin on the fluorescence spectrum and Stern-Volmer plot of soy protein isolate

表1 代表槲皮素、蘆丁與SPI 反應(yīng)過程淬滅常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)信息，由表1 可知，根據(jù)不同添加量槲皮素、蘆丁的Stern-Volmer 公式可得到線性回歸擬合方程已知動力學(xué)機(jī)制的最大動態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L?mol?1s?1[33]，槲皮素引起的SPI 淬滅速率常數(shù)小于動態(tài)猝滅的速率常數(shù)極限，因此，槲皮素引對SPI 的淬滅機(jī)制應(yīng)為動態(tài)淬滅，且Ksv隨溫度的升高而升高，表明其機(jī)制為動態(tài)淬滅。而蘆丁引起的SPI 淬滅速率常數(shù)遠(yuǎn)大于動態(tài)猝滅的速率常數(shù)極限，因此，蘆丁對SPI 的淬滅機(jī)制應(yīng)為靜態(tài)淬滅，且Ksv隨溫度的升高而降低[34]，表明其機(jī)制為靜態(tài)淬滅。

表1 槲皮素、蘆丁與SPI 反應(yīng)過程淬滅常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)信息Table 1 The quenching constants and thermodynamic parameters of quercetin,rutin and SPI reaction

結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果表明槲皮素、蘆丁與SPI 之間形成比例約為1:1 的復(fù)合物。ΔH>0、ΔS>0 主要表現(xiàn)為疏水作用力；ΔH<0、ΔS<0 主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力；ΔH<0，ΔS>0 主要表現(xiàn)為靜電作用力[35]。經(jīng)計算ΔG<0，說明二者之間的相互作用為自發(fā)進(jìn)行，槲皮素ΔH<0、ΔS<0，蘆丁ΔH<0、ΔS<0，因此室溫狀態(tài)下槲皮素、蘆丁與SPI 之間的相互作用方式以氫鍵和范德華力為主，表明槲皮素、蘆丁與SPI 之間是非共價相互作用。由于氫鍵和范德華力的存在改變了蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，同時改變了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[36]，導(dǎo)致疏水性基團(tuán)的掩埋，親水性基團(tuán)與水相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的溶解性等其他功能性質(zhì)的變化。李楠等[37]也得出類似的結(jié)論，薰衣草花色苷與牛血清蛋白之間的作用力是氫鍵和范德華力。

3 結(jié)論

槲皮素、蘆丁可提高SPI 的功能特性（溶解性、乳化性、凝膠性）。當(dāng)槲皮素添加量分別為8%、6%、4%、4%時，可有效提高SPI 凝膠硬度、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、溶解性功能性質(zhì)分別提高23.23%、20.84%、11.44%、10.06%。蘆丁也具有類似的作用，當(dāng)添加量為8%、4%、6%、6%時，可使SPI 凝膠硬度、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、溶解性提高187.18%、26.17%、23.54%、19.27%。此外槲皮素、蘆丁還可提高SPI 的生物利用度，結(jié)合Stern-volmer 分析發(fā)現(xiàn)槲皮素、蘆丁與SPI 淬滅機(jī)制屬于動態(tài)淬滅及靜態(tài)淬滅，且槲皮素-SPI、蘆丁-SPI 復(fù)合物熒光光譜均發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象，疏水環(huán)境的極性減弱，疏水性增加，肽鏈的伸展程度有所減弱。熱力學(xué)分析表明，槲皮素、蘆丁與SPI 結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行，兩種互作復(fù)合物的主要作用力為氫鍵和范德華力為主。