滇黃精的組織培養(yǎng)研究

伍燦明，劉春涼

（玉林師范學(xué)院，廣西玉林 537000）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl. et Hemsl.）系百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本植物，主要分布在云南省、廣西壯族自治區(qū)等地，生長在海拔2 000～3 900 m的陰濕林地和灌木叢中[1]，其根狀莖、種子等器官均可作為外植體。前人對叢生芽誘導(dǎo)增殖和生根培養(yǎng)的研究較少，且增殖系數(shù)和生根系數(shù)均不理想。本文以種子誘導(dǎo)萌發(fā)的幼苗為材料，并不斷優(yōu)化叢生芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，以提高叢生芽增殖及和生根系數(shù)，為滇黃精種苗快速繁育提供依據(jù)[2-5]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

滇黃精果實(shí)采自九萬大山（東經(jīng)108°35'32''～108° 48'49''，北緯 25° 01'55''～ 25° 19'54''）的野生材料，滇黃精的果實(shí)呈綠色，果實(shí)橢圓形、圓形、豆粒大小，大小均勻，色澤光亮。滇黃精種子比較小，被3個心皮包裹在果實(shí)內(nèi)。

1.2 試劑與儀器

6-芐基氨基嘌呤，純度≥99%，上海澤葉生物科技有限公司；萘乙酸，純度95%，安陽全豐生物科技有限公司；赤霉素，純度≥90%，酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；所有試劑均為化學(xué)純。

YXQ-LS-75II型高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JZ-Ⅱ接種器械滅菌器，濟(jì)南普朗特生物科技有限公司；SW-CJ-JC型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 滇黃精種子的預(yù)處理和消毒試驗(yàn)

將滇黃精果實(shí)置于流動自來水下沖洗5 h后，先用0.3 g/L高錳酸鉀進(jìn)行表面初步消毒，接著用0.1%赤霉素浸泡8 h打破休眠狀態(tài)。將預(yù)處理的滇黃精果實(shí)用75%的酒精浸泡并不停地?fù)u晃30 s，然后用無菌水清洗3～4次；再用0.1%的升汞深度消毒15 min，搖晃，棄去升汞后用無菌水清洗3～4次，再用解剖刀去掉外皮（注意不能傷及種子），接種到初步萌發(fā)培養(yǎng)基：MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+活性炭0.2 g/L，培養(yǎng)基中含蔗糖25 g/L、瓊脂粉5 g/L，pH=7.0（下同）。每瓶接種6顆種子，處理5瓶，3次重復(fù)，40 d后統(tǒng)計(jì)污染率和萌發(fā)率。

1.3.2 不同光照強(qiáng)度對滇黃精種子萌發(fā)的影響

消毒后的滇黃精種子接到不同光照處理和不同濃度NAA外源激素處理的MS培養(yǎng)基中，12 d后觀察種子萌發(fā)情況。

1.3.3 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對叢生芽誘導(dǎo)的影響

將長勢良好的滇黃精幼苗分別接種于不同濃度的6-BA、NAA不同配比外源激素進(jìn)的MS培養(yǎng)基上，各處理的培養(yǎng)基均加活性炭粉0.5 g/L。每瓶接入4棵幼苗，每個處理8瓶、3次重復(fù)，45 d左右統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖情況。叢生芽的誘導(dǎo)率計(jì)算公式如下：

1.3.4 不同NAA濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響

配制6-BA濃度均為0.4 mg/L，以0.2 mg/L為一個梯度設(shè)置NAA的濃度梯度的MS培養(yǎng)基，選取長勢良好、長有2～3片葉子的滇黃精幼苗，每瓶接入4棵幼苗，每個處理8瓶、3次重復(fù)，每10 d記錄1次每個培養(yǎng)基中滇黃精幼苗的高度、葉片顏色和叢生芽生長情況。

1.3.5 滇黃精叢生芽生根的初步探究

選取大小相似，生長程度相近的叢生芽接種于加入不同濃度的6-BA、NAA這2種外源激素進(jìn)行配比的MS培養(yǎng)基，各處理的培養(yǎng)基均加入活性炭粉0.5 g/L。每瓶接種4個根狀莖，每個處理接種8瓶，30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度調(diào)節(jié)在23～27 ℃，光照強(qiáng)度在2 000～3 000 Lx，光照時間為14 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌接種與啟動培養(yǎng)

滇黃精種子接種到啟動培養(yǎng)基后逐漸萌發(fā)，培養(yǎng)30 d后，滇黃精種子萌發(fā)率可達(dá)90%以上，且長勢良好。實(shí)驗(yàn)證明，以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+活性炭粉0.2 g/L，pH=7.0為滇黃精種子萌發(fā)的啟動培養(yǎng)基，有較好的萌發(fā)率，能作為滇黃精種子無菌萌發(fā)的啟動培養(yǎng)基。

2.2 不同光照強(qiáng)度對滇黃精種子萌發(fā)的影響

由表1可知，NAA濃度和添加活性炭粉的培養(yǎng)基對種子的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)表明NAA濃度在0.6～1.0 mg/L，且進(jìn)行遮光處理的種子萌發(fā)率高，萌發(fā)速度快。

表1 不同光照強(qiáng)度對滇黃精種子萌發(fā)的影響

2.3 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對叢生芽誘導(dǎo)的影響

由表2知，3種培養(yǎng)基中叢生芽的誘導(dǎo)率都比較低，而生長速度也緩慢。（1）號和（2）號培養(yǎng)基有部分小苗出現(xiàn)黃葉并逐漸死亡的現(xiàn)象，可能是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分已經(jīng)消耗完全，（3）號培養(yǎng)基中的幼苗均生長良好，但是叢生芽生長速度慢。

表2 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.4 不同NAA濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響

由表3可知，當(dāng)NAA濃度在0.6～1.2 mg/L時，叢生芽誘導(dǎo)率提高，葉色較好。誘導(dǎo)過程較易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但除培養(yǎng)基（1）外，本次實(shí)驗(yàn)沒有出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，只有幾棵幼苗最后慢慢枯死。從總體來看，叢生芽誘導(dǎo)率還是比較低。后期還需要繼續(xù)調(diào)整NAA和6-BA濃度，進(jìn)一步探究滇黃精組培苗叢生芽誘導(dǎo)率高的最佳配方。

表3 不同NAA濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.5 滇黃精叢生芽生根的初步探究

從表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，培養(yǎng)基（7）（8）（9）的平均根數(shù)最多，而且根的平均長度也較長。滇黃精的根長和根數(shù)隨著NAA濃度和6-BA濃度的增加而增加，當(dāng)6-BA為0.8 mg/L，NAA為0.5 mg/L時，滇黃精叢生芽的平均根樹最多，平均根長最長。

表4 滇黃精叢生芽生根的探究結(jié)果

3 結(jié)論

先使用75%酒精浸泡消毒30 s，再用0.1% HgCl2浸泡15 min，達(dá)到種子污染率為零的效果。在無菌處理前使用赤霉素浸泡8 h可打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂5 g/L+活性炭粉0.5 g/L，可作為滇黃精種子啟動培養(yǎng)基，添加適量的活性炭粉和遮光處理模擬黑暗環(huán)境，可提高種子萌發(fā)速度。為避免滇黃精幼苗出現(xiàn)褐化或者死亡，應(yīng)該及時更換培養(yǎng)基。

當(dāng)6-BA濃度為0.4 mg/L時，探討不同NAA濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響發(fā)現(xiàn)，各培養(yǎng)基幼苗長勢均良好，只有幾棵演變?yōu)榘谆缱罱K死亡。查閱文獻(xiàn)推測，MS培養(yǎng)基大量元素含量高，可能是總鹽分、滲透壓過高，使得滇黃精出現(xiàn)滲透失水，逐漸死亡。

在6-BA和NAA濃度逐步增加的培養(yǎng)基中，滇黃精的生根率達(dá)100%，根的生長更快更自然，幼苗也蔥郁健壯。在滇黃精生根誘導(dǎo)中，NAA在0.2～0.5 mg/L，6-BA在0.4～0.8 mg/L有利于根的產(chǎn)生，后期還會進(jìn)行增加其濃度觀察是否會抑制根的生長。