單一或復(fù)合益生菌對小鼠免疫機(jī)能的影響

黎雨晴，汪澤坤，楊恩東，駱廣財(cái)，孫冬冬

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036；2.安徽亨博士保健食品有限公司，安徽阜陽 236000）

益生菌因?qū)λ拗骶哂卸嘀匾嫣幎徽J(rèn)為是抗生素的天然替代品，其功能和作用機(jī)制備受關(guān)注。隨著各種有益微生物的不斷發(fā)現(xiàn)，研究人員對益生菌的生物學(xué)特性、功能和安全性進(jìn)行了詳細(xì)的研究[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌在調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防慢性病、提高機(jī)體免疫力等方面具有一定的作用，是良好的免疫激活劑。其不僅可以改善宿主腸道菌群微生態(tài)平衡，還可以改善腸道黏膜表面的屏障功能，以促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和免疫機(jī)能的產(chǎn)生，其增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能已廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物保健與疾病防治過程[5-11]。目前，益生菌已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域中，在人畜保健與某些疾病防治方面發(fā)揮著越來越重要的作用。雖然研究已經(jīng)證實(shí)了益生菌具有免疫保護(hù)增強(qiáng)的作用[12]，但在益生菌個(gè)性化精準(zhǔn)補(bǔ)充的倡導(dǎo)下，針對復(fù)合益生菌免疫的研究尚不完善。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了單一或復(fù)合益生菌對小鼠免疫機(jī)能的影響，為益生菌微生態(tài)制劑產(chǎn)品的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

本實(shí)驗(yàn)所用益生菌包括嗜酸乳桿菌、戊糖乳桿菌、長雙歧桿菌，均來自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥系。復(fù)合益生菌制劑由嗜酸乳桿菌（1×107CFU/g）、戊糖乳桿菌（1×107CFU/g）、長雙歧桿菌（1×107CFU/g）構(gòu)成。

1.2 試劑與儀器

MRS培養(yǎng)基，F(xiàn)MB級，生工生物工程上海有限公司；莫匹羅星、環(huán)丙沙星、氯林可霉素、L-半胱氨酸鹽酸鹽、碳酸鈣、4%多聚甲醛，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；AST等生化試劑盒，北京安普生化有限公司；IL-2等ELISA試劑盒，上海麥克林生化科技有限公司。

GTZ-CJ超凈工作臺(tái)，海南龍口有限公司；Allegra 64R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司；JM-54R全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，賽默飛世爾上海（儀器）有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

含X-GAL的BSM培養(yǎng)基（X-BSM）：在MRS培養(yǎng)基（1 L）中加入500 mg的L-半胱氨酸鹽酸鹽、50 mg的莫匹羅星和60 mg的X-GAL。

含碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基（Ca-MBS）：MRS培養(yǎng)基（1 L）中添加5 g碳酸鈣。

含環(huán)丙沙星-氯林可霉素的MRS培養(yǎng)基（C-MBS）：MRS培養(yǎng)基（1 L）中加入10 mg的環(huán)丙沙星和0.1 mg的氯林可霉素。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)中的SPF級雄性昆明小鼠（體重25～30 g，6周齡）由南京麥瑞斯生物科技有限公司提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》和安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.5 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓胺纸M

取SPF級雄性昆明小鼠90只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取15只小鼠繼續(xù)普通喂養(yǎng)，作為正常組，剩下的75只小鼠連續(xù)三天使用環(huán)磷酰胺（60 mg/kg）腹腔注射，期間維持正常的進(jìn)食進(jìn)水，制造免疫低下模型。以小鼠出現(xiàn)體形瘦弱、大量脫毛、精神萎靡等現(xiàn)象作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后，將75只造模小鼠隨機(jī)分為5組：免疫低下模型組、嗜酸乳桿菌治療組、戊糖乳桿菌治療組、長雙歧桿菌治療組和復(fù)合益生菌治療組，每組15只。分別使用單一益生菌制劑（3×107CFU）或復(fù)合益生菌制劑（1 g）加入1 g的生理鹽水、對小鼠進(jìn)行灌胃處理，每天一次，連續(xù)灌胃28 d，記錄各組小鼠的體重。

1.6 免疫功能檢測

1.6.1 小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定

在小鼠尾部靜脈注入稀釋后的墨汁，分別在注射墨汁后的2 min 和10 min從小鼠眼眶靜脈采血，血液標(biāo)本用酶標(biāo)儀測定680 nm處吸光值。小鼠稱重后處死，在超凈工作臺(tái)中解剖取出肝臟和脾臟，用生理鹽水洗去表面血污后稱重記錄。按公式（1）和（2）計(jì)算碳廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）：

其中，OD1和OD2分別為t1（2 min）和t2（10 min）時(shí)刻血液標(biāo)本的吸光度值，體重、肝重和脾重單位均為g。

1.6.2 免疫器官指數(shù)的測定

常規(guī)眼球采血后處死小鼠，在超凈工作臺(tái)中解剖取出脾臟和胸腺，用生理鹽水洗去表面血污后稱重記錄。按公式（3）和（4）計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)：

其中，脾重和胸腺重單位為mg，體重單位為g。

1.6.3 小鼠血清生化指標(biāo)測定

取各組小鼠血清樣本，嚴(yán)格按照試劑盒操作規(guī)定檢測小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清肌酐（CREA）和尿素氮（UREA）含量。

1.6.4 小鼠血清細(xì)胞因子含量測定

血清細(xì)胞因子（IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ）含量按照ELISA試劑盒方法進(jìn)行測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同實(shí)驗(yàn)組之間的差異分析采用ANOVA，P＜0.05和P＜0.01判斷為差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一或復(fù)合益生菌對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞是一種抗原呈遞細(xì)胞，通過分泌細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的增殖與分化，提高機(jī)體免疫能力[13]。如表1所示，免疫低下模型組小鼠碳廓清指數(shù)6.52±0.02，與正常組小鼠碳廓清指數(shù)相比下降了13.53%（P＜0.05），說明環(huán)磷酰胺使小鼠的單核巨噬細(xì)胞吞噬能力下降，表明造模成功；各單一益生菌組（嗜酸乳桿菌組、戊糖乳桿菌組和長雙歧桿菌組）小鼠碳廓清指數(shù)與免疫低下模型組相比均顯著升高（P＜0.05），各組分別升高了11.92%、14.81%和16.52%；復(fù)合益生菌組小鼠碳廓清指數(shù)與免疫低下模型組相比升高了30.91%（P＜0.01）。結(jié)果表明，單一或復(fù)合益生菌能不同程度提高小鼠的非特異性免疫功能，復(fù)合益生菌提高效果更顯著，約為各單一益生菌組的2倍。這一結(jié)果表明復(fù)合益生菌能有效增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，這可能與益生菌共同作用提高了免疫蛋白的分泌，促使腸黏膜淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞功能有關(guān)[14]。

表1 益生菌對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

2.2 單一或復(fù)合益生菌對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

免疫器官指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一，其中脾指數(shù)和胸腺指數(shù)主要反映免疫細(xì)胞的功能和免疫器官的發(fā)育，間接反映了機(jī)體的免疫水平[15]。

如表2所示，免疫低下模型組脾指數(shù)（3.98±0.43）mg/g，與正常組相比降低了30.91%（P＜0.01），進(jìn)一步證明了免疫低下小鼠模型造模成功；嗜酸乳桿菌組、戊糖乳桿菌組和長雙歧桿菌組脾指數(shù)分別為（4.43±0.34）mg/g、（4.71±0.72）mg/g 和（4.68±0.56）mg/g，與免疫低下模型組相比均出現(xiàn)了顯著升高（P＜0.05），復(fù)合益生菌組更是升高至（6.52±2.47）mg/g，增加了63.82%（P＜ 0.01）。各益生菌處理組與模型組相比，胸腺指數(shù)均有所升高，其中戊糖乳桿菌組、長雙歧桿菌組分別升高20.25%和21.52%，復(fù)合益生菌組升高了62.66%（P＜0.01）。

表2 益生菌對小鼠免疫器官指數(shù)的影響（mg/g）

結(jié)果表明，單一或復(fù)合益生菌能夠在不同程度上提高免疫低下小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，增強(qiáng)免疫低下小鼠脾臟和胸腺的免疫機(jī)能，且復(fù)合益生菌治療效果更顯著。

2.3 單一或復(fù)合益生菌對小鼠血清四項(xiàng)生化指標(biāo)的影響

如表3所示，免疫低下模型組小鼠與正常組小鼠相比，血清四項(xiàng)生化指標(biāo)含量均有所升高，其中ALT含量上升了14.49%（P＜0.05），AST、UREA含量分別上升了9.78%和10.58%（P＜0.01），表明造模主要對小鼠的肝功能造成損傷；與免疫低下模型組相比，除嗜酸乳桿菌組小鼠血清中CREA水平無明顯變化、戊糖乳桿菌和長雙歧桿菌組CREA水平顯著上升外，益生菌處理組小鼠血清中AST、ALT、UREA和CREA水平均出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.01），且復(fù)合益生菌組血清生化指標(biāo)最接近正常組。

表3 益生菌對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單一或復(fù)合益生菌都能夠維持肝腎的正常代謝，有效調(diào)節(jié)免疫低下模型小鼠的免疫機(jī)能，且復(fù)合益生菌組的調(diào)節(jié)效果更顯著。這可能是因?yàn)閺?fù)合益生菌中含有多種營養(yǎng)因子，各種養(yǎng)分和代謝產(chǎn)物均通過血液進(jìn)行交換，這些因子對生物膜結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，復(fù)合益生菌營養(yǎng)成分較單一益生菌更多，更能有效改善小鼠胃腸道環(huán)境，提高機(jī)體免疫功能[16]。

2.4 單一或復(fù)合益生菌對小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響

機(jī)體免疫應(yīng)答中，Th1細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞主要參與體液免疫，每種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子相互拮抗，當(dāng)細(xì)胞因子失調(diào)，從Th1移向Th2，機(jī)體就會(huì)處于免疫抑制狀態(tài)[17]。

如表4所示，免疫低下模型組血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ分泌水平為（0.61±0.33）ng/mL和（3.31±0.90）ng/mL，分別下降了64.33%和50.74%（P＜0.01）；血清細(xì)胞因子IL-4和IL-6分泌水平升高至（7.34±0.81）ng/mL和（10.90±0.63）ng/mL，與正常組相比升高極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，造模后的小鼠Th1型細(xì)胞因子含量下降，Th2型細(xì)胞因子含量升高，導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡向Th2的方向移動(dòng)，抑制了造模小鼠的免疫機(jī)能，進(jìn)一步證明了小鼠模型成功造模。

與免疫低下模型組相比，單一益生菌組血清細(xì)胞因子IL-2分泌水平顯著升高（P＜0.05），IFN-γ含量分別增加了1.49倍、1.55倍和1.30倍，分泌水平升高極顯著（P＜0.01）；戊糖乳桿菌和長雙歧桿菌對IL-4和IL-6分泌水平的降低效果極顯著（P＜0.01）；復(fù)合益生菌的影響更大（P＜0.01），IL-4、IL-6分泌水平分別下降了41.96%和25.32%，IL-2和IFN-γ分泌水平則分別上升了1.97倍和2.12倍。

表4 益生菌對小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響（ng/mL）

結(jié)果表明，給予造模小鼠益生菌灌胃處理后，單一或復(fù)合益生菌組都對血清細(xì)胞因子含量產(chǎn)生了不同程度的影響，改善小鼠因造模受到的機(jī)體損傷，有效恢復(fù)或提高小鼠免疫機(jī)能。其中，復(fù)合益生菌組比單一益生菌組免疫力改善效果更好。這可能是因?yàn)椴煌嫔置诤驼{(diào)節(jié)的效應(yīng)分子不同，這些效應(yīng)分子相互作用，直接或間接地調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，提高機(jī)體整體免疫調(diào)節(jié)能力[18]。

3 結(jié)論

以往，研究集中于益生菌作為飼料添加劑發(fā)揮保護(hù)腸道和促進(jìn)消化等功能。隨著相關(guān)研究的深入，利用生理優(yōu)勢菌或機(jī)體非常駐菌及其代謝產(chǎn)物來預(yù)防和治療某些疾病的微生態(tài)治療概念被提出[19]。

本研究用環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型，分別用單一益生菌（嗜酸乳桿菌、戊糖乳桿菌、長雙歧桿菌）和復(fù)合益生菌對小鼠進(jìn)行灌胃，發(fā)現(xiàn)單一益生菌和復(fù)合益生菌均能夠顯著提高免疫低下小鼠的非特異性免疫功能，能夠改善小鼠的肝腎功能損傷，且復(fù)合益生菌的效果優(yōu)于單一益生菌。復(fù)合益生菌的具體調(diào)節(jié)機(jī)制與劑量、配比和免疫系統(tǒng)自身調(diào)節(jié)的復(fù)雜性有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。