4 種藥劑對浙江景寧云錦杜鵑葉斑病菌的室內(nèi)毒力測定*

劉浩凱 劉衛(wèi)榮 張 輝 李 橋 仇輝康 陳春林 陳玲芳

（1.景寧縣畬族自治縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 景寧 323500；2.景寧畬族自治縣生態(tài)林業(yè)發(fā)展中心，浙江 景寧 323500）

云錦杜鵑(Rhododendron fortunei)為杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑屬(Rhododendron)常綠杜鵑亞屬常綠灌木或小喬木，高3～12 m，主要分布在我國廣東、廣西、福建、浙江等省，生長于海拔600～2 000 m 的山脊陽處或林下,有較高的觀賞價值和醫(yī)用價值[1]。云錦杜鵑生長以景寧縣上山頭和大仰湖濕地自然保護區(qū)居多，呈自然生長狀態(tài)。

目前關(guān)于云錦杜鵑的研究[2]主要集中在群落學(xué)[3]、光合生理生化[4]、次級代謝產(chǎn)物[5]等,其中，對杜鵑病害研究多以葉部病害為主，主要有葉斑病(Cercospora rhododendri)、煤污病(Capnodium sp)、灰霉病(Sclerotinia fuckeliana)等[6-10]。2017 年，景寧縣上山頭天然杜鵑林中的云錦杜鵑發(fā)生較為嚴重的葉斑病，進行分離得到引起該病害的致病菌為蘆筍擬莖點霉(Phomopsis asparagi)[11]，該病原菌主要侵染云錦杜鵑的葉片。發(fā)病初期，出現(xiàn)褐色小斑點，隨后發(fā)展成為黑褐色的圓形或不規(guī)則病斑，在后期時，病斑周圍甚至出現(xiàn)黃色暈圈，其葉斑病癥狀與以往報道[6-8]有所不同，本研究為蘆筍擬莖點霉在浙江省內(nèi)引起云錦杜鵑葉斑病的首次報道。本文采用菌絲生長速率法[12]，選擇4 種常用的殺菌劑多菌靈、甲基硫菌靈、百菌清和代森錳鋅，對蘆筍擬莖點霉進行毒力測定[13,14]，以達到篩選高效殺菌劑的目的，旨在為今后科學(xué)防治云錦杜鵑葉斑病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

供試菌株蘆筍擬莖點霉保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院-80 ℃超低溫冰箱。將供試菌株轉(zhuǎn)移至PDA 培養(yǎng)基中，25 ℃，光照培養(yǎng)7 天后備用。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）。

1.1.2 供試藥劑

試驗所選用的4 種供試藥劑為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的用于預(yù)防治療葉斑病的殺菌劑，分別為50%多菌靈、80%甲基硫菌靈、75%百菌清、80%代森錳鋅。

1.2 試驗方法

1.2.1 母液制備及試驗濃度確定

取4 種藥品溶解在無菌水中，配置成濃度為5×103mg/L 的母液，4 ℃下保存?zhèn)溆?。? 種藥劑加在50 mL 的PDA 中，使其濃度為5 μg/mL[15]，混和均勻，制成含藥劑的平板，未加入藥劑的培養(yǎng)基為空白對照。將待測菌株接種在PDA 平板上，從第3 天開始計算其菌落直徑的大小，然后每隔1 天進行相同的測量（兩軸之間呈90°測量，2 次數(shù)據(jù)取平均值），測量到第7 天的數(shù)據(jù)時結(jié)束，試驗重復(fù)3 次。計算病原菌在不同濃度藥劑作用下的抑菌率[16]，根據(jù)其抑菌率調(diào)整各藥劑終濃度（表2）。

表2 4 種藥劑的濃度梯度

1.2.2 不同殺菌劑對病原菌的毒力測定

將4 種藥劑按照表1 的濃度加入PDA 培養(yǎng)基中，制備成不同濃度梯度的含藥培養(yǎng)基。隨后對病原菌進行抑菌率分析，方法同1.2.1。根據(jù)濃度對數(shù)(X)和抑制菌落生長百分率的機率值(Y)，計算回歸方程Y＝AX＋B，回歸方程表示4 種不同殺菌劑對這種病原菌毒力，最后得到各自的相關(guān)系數(shù)和半數(shù)致死量，求出EC50和R2。

表1 供試藥劑廠家及濃度

1.3 數(shù)據(jù)處理

對所測得的數(shù)據(jù)用EXCEL 和SPSS17.0 進行整理并加以Duncan 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種藥劑對病原菌的抑制效果

由圖1 可知，4 種藥劑對病原菌生長均表現(xiàn)有一定的抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加，抑菌效果逐漸明顯。當百菌清和代森錳鋅的濃度為50μg/mL時，抑菌率僅為63.21%和61.15%（圖2、圖3），抑菌效果差異不顯著；當藥劑濃度為25、12.5、6.25 μg/mL時，百菌清的抑菌效果明顯好于代森錳鋅，百菌清的抑菌率雖有變化，但沒有代森錳鋅明顯。而對于多菌靈，當濃度為2.5 μg/mL 時，抑菌率為95.01%（圖4），并且隨著藥劑濃度的降低，都保持著較高的抑菌效果；甲基硫菌靈的抑菌效果略低于多菌靈，在濃度為12.5μg/mL 時，抑菌率為87.59%（圖5）。

圖1 4 種殺菌劑的抑菌率及相對生長速率測定

圖2 百菌清不同濃度對病原菌抑菌效果

圖3 代森錳鋅不同濃度對病原菌抑菌效果

圖4 多菌靈不同濃度對病原菌抑菌效果

圖5 甲基硫菌靈不同濃度對病原菌抑菌效果

2.2 毒力回歸方程分析

根據(jù)藥劑濃度，利用藥劑的濃度對數(shù)值x 與藥劑抑菌率幾率值y 的直線相關(guān)關(guān)系，計算出藥劑的毒力回歸方程，求出相關(guān)系數(shù)以及EC50。由表3 可知：這4 種藥劑對蘆筍擬莖點霉的抑制效果均較好，EC50值差值較大。其中50%多菌靈抑制能力最強，EC50為0.97 mg/L；80%甲基硫菌靈和75%的百菌清次之，EC50分別為2.16 mg/L 和9.16 mg/L；80%代森錳鋅的EC50最大，為32.79 mg/L，抑菌效果最差。4 種殺菌劑的抑菌效果排序從高到低分別為：50%多菌靈＞80%甲基硫菌靈＞75%百菌清＞80%代森錳鋅。

表3 供試藥劑對病原菌毒力測定

3 討論

擬莖點霉是一種植物病原真菌，分布廣泛，可在油棕[16]、葡萄[17]、廣東鳳梨[18]等植物上發(fā)病。由蘆筍擬莖點霉引起的葉斑病是出現(xiàn)在云錦杜鵑的病害之一，嚴重影響其觀賞價值。

3.1 試驗結(jié)果表明，4 種藥劑對蘆筍擬莖點霉均有抑制作用，毒力作用從高到底為50%多菌靈＞80%甲基硫菌靈＞75%百菌清＞80%代森錳鋅。已有研究證實，多菌靈和百菌清對蘆筍莖枯病有較好的防治效果，雖本文所分離出的病原菌與蘆筍莖枯病的病原菌相同，但同樣是多菌靈，0.12μg/mL 的濃度下，抑菌率能達到95.12%，而本試驗當濃度為2.5μg/mL 時，抑菌率為95.01%，這可能是由于寄主不同，而導(dǎo)致引起不同的防治效果。

3.2 1980 年以來，苯并咪唑類殺菌劑得到廣泛的使用，在農(nóng)業(yè)上可防治多種真菌病害，效果非常顯著[21]。分析其作用機理發(fā)現(xiàn)，多菌靈與敏感生物的微管蛋白有高度的親和力，它束縛微管蛋白亞基，使其不能正常組裝在有絲分裂過程中起重要作用的紡錘絲。另外，還可影響微管蛋白在保持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)細胞器的運動。甲基硫菌靈同樣屬于苯并咪唑類,是一種內(nèi)吸性殺菌劑。因此對于該病害的防治可以采用2 種藥劑混合使用，達到延緩病菌生長及抗性的產(chǎn)生，達到較好的防治效果。

3.3 雖然較高濃度的殺菌劑使用——特別是苯并咪唑類，可以達到延緩真菌生長速率，但是長時間容易在病原菌群體中產(chǎn)生抗性菌株，這導(dǎo)致高劑量的同種藥劑，或者同類型藥劑容易喪失防治效果。因此，在針對苯并咪唑類的藥劑使用時，一定要充分考慮藥劑的合理利用，盡可能降低一種或一類殺菌劑的單獨使用，多結(jié)合其他藥劑混合使用，緩解病菌選擇性壓力。