低緯高原甘蔗銹病病原菌鑒定及系統(tǒng)進化分析

王曉燕，李文鳳，張榮躍，單紅麗，李 婕，李銀煳，黃應昆

(云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南 開遠 661699)

【研究意義】銹病是一種重要的世界性甘蔗真菌病害，可造成甘蔗減產15%～30%，蔗糖分降低10%～36%，嚴重制約蔗糖產業(yè)的高質量發(fā)展[1-2]。以病原菌研究為基礎的抗病品種篩選與種植是防治此病最經濟有效的措施，因此探明低緯高原云南蔗區(qū)銹病的病原菌種類、發(fā)生分布特征、病菌間及其與柄銹菌屬其他銹菌的系統(tǒng)進化關系，對病害的精準科學防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】甘蔗銹病病原有3種，即褐銹病病原黑頂柄銹菌(PuccinamelanocephalaSyd. et P. Syd)、黃銹病病原屈恩柄銹菌(PuccinakuehniiButler.)[3]和黃褐銹病病原Macruropyxisfulvasp. nov.[4]。1890年褐銹病首次在爪哇發(fā)現(xiàn)，此后該病在多數(shù)植蔗國家普遍發(fā)生，爆發(fā)流行，給當?shù)亟洕斐删薮髶p失[5-8]。黃銹病主要分布在澳大利亞、拉丁美洲、美國和印度等國[9-12]。黃褐銹病是2008年在斯威士蘭甘蔗品種N25上發(fā)現(xiàn)的一種新型甘蔗銹病，目前該病在南非和斯威士蘭蔗區(qū)普遍發(fā)生[4]。阮興業(yè)等[13]1982年在云南首次發(fā)現(xiàn)了褐銹病，隨后該病迅速蔓延到我國各主要植蔗區(qū)[14-17]?！颈狙芯壳腥朦c】低緯高原云南蔗區(qū)是中國第二大甘蔗產區(qū)，甘蔗銹病在該產區(qū)普遍發(fā)生，且有逐年擴展蔓延加重危害之趨勢，但其病原菌種類、發(fā)生分布特征、病菌間及其與柄銹菌屬其他銹菌的系統(tǒng)進化關系等方面尚不明確，有效防控缺乏科學依據(jù)。【擬解決的關鍵問題】通過對低緯高原云南不同蔗區(qū)甘蔗銹病發(fā)生分布狀況進行系統(tǒng)調查，采用病原形態(tài)特征觀察及分子檢測等方法鑒定病原種類，并對57份甘蔗銹病樣品的rDNA序列進行克隆測序，分析甘蔗銹菌間及其與柄銹菌屬其他銹菌的系統(tǒng)進化關系，以期明確低緯高原云南蔗區(qū)甘蔗銹病病原菌種類和揭示甘蔗銹病分離物的分子進化，為甘蔗銹病的流行預測、抗病育種及精準防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調查及癥狀觀察

2014—2018年，先后對云南保山、臨滄、勐海、孟連、西盟、瀾滄和文山等蔗區(qū)甘蔗銹病的發(fā)生和分布進行了調查并采集57份不同銹病癥狀的病葉，觀察病害癥狀(表1)。

表1 57份甘蔗銹病樣品病原菌鑒定Table 1 Pathogen identification of 57 sugarcane rust samples

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 病原形態(tài)學觀察

觀察和測量具典型銹病癥狀病葉上的夏孢子堆大小、顏色和形態(tài)，然后用滅菌刀片刮取夏孢子在顯微鏡下進行形態(tài)、顏色、芽孔數(shù)和有無側絲等特征的觀察，并隨機測量100個夏孢子的大小。

1.3 病原分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

各銹病樣品稱取病葉0.2 g，采用北京全式金生物技術公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit提取葉片總DNA。采用參照文獻報道的銹菌特異性引物Rust2inv/LR6[18]進行PCR擴增，引物由上海生物工程公司合成。PCR反應體系(25 μL)：ddH2O 10 μL、2×PCRTaq混合物12.5 μL、DNA模板0.5 μL、上下游引物各1.0 μL(20 μg/μL)。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。采用快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒(天跟生物科技公司)回收純化PCR擴增產物，并將其與pEASY-T5(北京全式金生物技術有限公司)進行連接轉化，每個分離物挑選6個經PCR鑒定為陽性的克隆，送交北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。所得測序結果在GenBank中進行blastn比較搜索，確定病原分類地位，并用DNAMAN進行多序列比對分析。應用MEGA 6.0[19]軟件，以Coleosporiumasterum(HQ31750) 和Melampsorasp.(GU058014)為外群，采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

云南勐海海引1號4份甘蔗銹病樣品的病斑聚集呈簇，長3～8 mm，寬1～2 mm，夏孢子堆桔黃色(圖1-A)，為典型黃銹病癥狀特征；其余53份甘蔗銹病樣品的病斑分散，長10～30 mm，寬1～3 mm，夏孢子堆棕紅色(圖1-B)，為典型褐銹病癥狀特征。

2.2 病原形態(tài)特征

云南勐海海引1號4份甘蔗銹病樣品的夏孢子梨形，栗褐色或金黃色，表面有刺，壁頂端加厚10 μm以上，大小為(25～50)μm × (16～35)μm，具4～5個芽孔，無側絲(圖1-C)，為屈恩柄銹菌夏孢子。其余53份甘蔗銹病樣品的夏孢子球形，棕色至深棕色，表面密布小刺，壁四周均勻加厚，大小為(20～40)μm × (13～25)μm，芽孔多4個；側絲較多，無色，匙形(圖1-D)，為黑頂柄銹菌夏孢子。

A：甘蔗黃銹病葉部癥狀；B：甘蔗褐銹病葉部癥狀；C：屈恩柄銹菌夏孢子形態(tài)特征；D：黑頂柄銹菌夏孢子形態(tài)特征A: Leaf symptoms of sugarcane orange rust disease; B: Leaf symptoms of sugarcane brown rust disease; C: Urediospores morphological characteristics of P. kuehnii; D: Urediospores morphological characteristics of P. melanocephala圖1 甘蔗銹病田間癥狀及其病原菌的顯微形態(tài)特征Fig.1 Field symptoms of sugarcane rust diseases and morphological characteristics of their pathogens

2.3 病原分子鑒定

提取的甘蔗銹病病葉DNA經擴增、測序后將所得序列(GenBank登錄號見表1)提交NCBI網站進行BLAST同源性比較分析。結果表明：云南勐海海引1號4份甘蔗銹病病原的核苷酸序列(GenBank登錄號：KP201840～KP201843)與已報道的屈恩柄銹菌核苷酸序列(GenBank登錄號：GU058021)同源性在99.9%以上，表明該病原是屈恩柄銹菌(表1)；云南保山、臨滄、勐海、孟連、西盟、瀾滄和文山其他甘蔗品種上的53份甘蔗銹病病原核苷酸序列(GenBank登錄號：KP201824～KP201839，KU886334～KU886368，MZ188978～MZ188979)與已報道的黑頂柄銹菌核苷酸序列(GenBank登錄號：GU058001)同源性在99.8%以上，表明該病原是黑頂柄銹菌(表1)。

2.4 系統(tǒng)進化分析

從GenBank中搜索并下載甘蔗銹病病原及其他柄銹菌的rDNA序列，與本研究獲得的57條甘蔗銹菌序列一起構建NJ系統(tǒng)進化樹。結果(圖2)表明，本研究獲得的57條甘蔗銹菌rDNA序列與其他柄銹菌，在整個系統(tǒng)進化樹中分為4組。其中，53條黑頂柄銹菌與GenBank中已報道的黑頂柄銹菌核苷酸序列(GenBank登錄號：GU058001、JX036025和MG564638)，及P.nakanishikii(GenBank登錄號：GU058002)、P.rufipes(GenBank登錄號：AJ29654 5)、Aecidiumdeutziae(GenBank登錄號：KU309317)和P.coronata(GenBank登錄號：DQ354526) 等柄銹菌屬銹菌聚為組1。4條屈恩柄銹菌與GenBank中已報道的屈恩柄銹菌核苷酸序列 (GenBank登錄號：GU0580021)和P.polysora(GenBank登錄號：GU058024)聚為組4；黃褐銹病病原M.fulvasp.nov.(GenBank登錄號：JX036026和JX036027)與P.physalidis(GenBank登錄號：DQ354522)、P.sparganiodis(GenBank登錄號：GU058027)和Pucciniosirapallidula(GenBank登錄號：DQ354534) 聚為組3；而其余的GenBank中已報道的柄銹菌屬其他銹菌聚為組2。

圖2 基于甘蔗銹菌與其他柄銹菌屬銹菌rDNA序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on rDNA sequence of sugarcane rust fungi and Pucciniaceae fungi from GenBank

3 討 論

甘蔗銹病菌與柄銹菌屬其他銹菌rDNA序列系統(tǒng)進化分析結果顯示低緯高原云南蔗區(qū)53個黑頂柄銹菌分離物在系統(tǒng)進化樹中無明顯的品種和地理分組，說明這53個黑頂柄銹菌分離物間無分子變異或變異較小。本研究中用于分析的所有黑頂柄銹菌分離物與檸檬草銹菌P.nakanishikii的遺傳關系最近，而與甘蔗銹病的另一病原屈恩柄銹菌的遺傳關系較遠，這與Dixon等[20]對來自23個國家164個蔗區(qū)的甘蔗銹菌分離物與其他銹菌的系統(tǒng)進化關系分析結果一致。

雖然甘蔗黃銹病的病原屈恩柄銹菌是一種突發(fā)性病原，但一旦該病爆發(fā)常造成巨大的經濟損失。因甘蔗黃銹病的發(fā)生，每年澳大利亞和美國佛羅里達的經濟損失超過17.7億美元和4億美元[20-21]，嚴重阻礙了當?shù)卣崽菢I(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。甘蔗銹病的發(fā)生流行與品種抗病性緊密相關，感病品種的大面積種植是病害流行的重要原因，利用抗病品種是防治最經濟有效的措施。云南是中國甘蔗野生資源重要的分布中心和世界野生甘蔗起源中心之一，且因復雜多樣的地理及氣候條件形成了豐富的甘蔗種質資源，是中國乃至世界甘蔗遺傳改良的天然寶貴基因庫之一[22]。然而，至今中國甘蔗種質資源和品種材料抗銹病的鑒定與評價，僅針對褐銹病[23-24]，黃銹病的抗病鑒定與評價尚未開展。今后在開展褐銹病優(yōu)良抗源材料和抗病品種評價篩選的同時，還應加強黃銹病優(yōu)良抗源材料和抗病品種的評價篩選，以期為選育和利用抗病品種有效防控甘蔗銹病提供科學依據(jù)和優(yōu)良抗源材料。

由M.fulvasp.nov.引起的甘蔗黃褐銹病是2008年在斯威士蘭甘蔗品種N25上發(fā)現(xiàn)的一種新型甘蔗銹病。其病斑線形，平行于中脈，長約2～10 mm。夏孢子堆新鮮時為亮橙色，隨后變?yōu)樯罴t棕色，長度可達3 mm。夏孢子橢圓形、倒卵形或球形；亮橙色至橙紅色；壁四周均勻加厚，厚度為1.5～4.9 μm；大小為(25～32)μm ×(20～26)μm[7]。目前，該病在斯威士蘭和南非蔗區(qū)普遍發(fā)生為害。2016年在莫桑比克和津巴布韋的芒草上也觀察到與甘蔗黃褐銹病一樣的癥狀[4]。因此，應加強引種檢疫及甘蔗和可作為替代寄主的芒屬或其他相關雜草銹病的監(jiān)測，從源頭上防止甘蔗黃褐銹病傳入中國，有效減少該病對蔗糖產業(yè)的潛在威脅，以促進中國蔗糖產業(yè)的高質量發(fā)展。

4 結 論

本研究采用形態(tài)學觀察和分子鑒定方法，通過對云南保山、臨滄、勐海、孟連、西盟、瀾滄和文山等蔗區(qū)采集到的57份甘蔗銹病病原進行檢測和序列分析，首次在云南勐海蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)引起甘蔗黃銹病的屈恩柄銹菌，并證實引起褐銹病的黑頂柄銹菌是主要病原菌。這為中國甘蔗銹病的深入研究和科學防控奠定了基礎、提供了依據(jù)。