Mstn基因敲除通過上調Wnt/β-catenin信號通路影響骨代謝并減輕2型糖尿病小鼠骨質疏松*

程經緯， 柳楊青， 汪艷芳， 丁 樂， 郭麗君

（1京畿大學研究生院，韓國 京畿道水原 16227；2河南省人民醫(yī)院編輯部，鄭州大學人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；3河南省人民醫(yī)院內分泌科，鄭州大學人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

骨質疏松是一種以骨量低下和骨微結構破壞為特征的代謝性骨病。2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者骨質疏松的發(fā)生風險明顯高于正常人群［1］。肌肉生長抑制素（myostatin，Mstn）是轉化生長因子β 超家族成員之一，主要由骨骼肌分泌，可負調節(jié)肌肉生長分化［2-3］。此外，Mstn 還具有調節(jié)骨代謝的作用。文獻報道，Mstn基因敲除小鼠股骨的骨量較野生小鼠明顯增加；在飲食誘導的肥胖大鼠中，抑制Mstn 表達可造成股骨骨量丟失和骨小梁結構破壞［2-3］。但Mstn與T2DM 發(fā)生骨質疏松的關系及機制尚不清晰。本研究探討Mstn基因敲除對T2DM小鼠骨代謝及骨微結構的影響及機制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 采用CRISPR/Cas9 技術及高通量電轉受精卵方式構建雜合型Mstn基因敲除（Mstn+/-）小鼠，通過繁育及PCR 鑒定獲得純合型Mstn基因敲除（Mstn-/-）小鼠 12 只、Mstn+/-小鼠 12 只和野生型（wild-type，WT）小鼠12 只，品系C57BL/6N，6 周齡，雄性，SPF 級，由賽業(yè)生物科技有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)于河南大學醫(yī)學院動物房，動物實驗許可證號為SYXK（豫）2016-0006，溫度22～24 ℃，濕度40%～60%，保持晝夜12 h 節(jié)律，自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1 周后進行實驗。本研究遵循動物倫理和實驗準則。

1.2 主要儀器與試劑 血糖儀（Roche）；Skyscan 1174 顯微計算機斷層掃描（micro-computed tomography，micro-CT）儀（Bruker）；酶標儀（BioTek）；脫水機、包埋機和病理切片機（武漢俊杰電子有限公司）；光學顯微鏡及成像系統(tǒng)（Nikon）；鏈脲佐菌素（Sigma）；小鼠Ⅰ型前膠原N 端原肽（procollagen type I N-terminal propeptide，PINP）和Ⅰ型膠原交聯(lián) C 端肽（collagen type I cross-linked C-telopeptide，CTX）ELISA 試劑盒，兔抗小鼠Wnt、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）和 β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的Ⅱ抗，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）鈣-鈷染色試劑盒，以及抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型的建立與評價 將12 只WT 小鼠、12只Mstn+/-小鼠和12 只Mstn-/-小鼠各隨機分為對照組及 T2DM 組，共 6 組，每組 6 只，分別為 WT 組、Mstn+/-組、Mstn-/-組、WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組及Mstn-/-+DM組，前3 組給予普通飲食（總熱量13.5 kJ/g）飼養(yǎng)6周，后3 組給予高脂飲食（總熱量18.7 kJ/g）飼養(yǎng)6周+鏈脲佐菌素注射誘導T2DM 模型。WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組給予高脂飲食喂養(yǎng)6周后，在不禁食狀態(tài)下以50 mg/kg 腹腔注射2%鏈脲佐菌素（用檸檬酸鈉緩沖液配成），72 h 后禁食6 h，取尾靜脈血，用血糖儀檢測空腹血糖。T2DM 模型構建成功標準：空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出現多飲、多食、多尿及消瘦癥狀。18 只小鼠均造模成功［4］。WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液作為對照。

2.2 血清PINP 和CTX 水平檢測 小鼠禁食6 h 后取尾靜脈血 0.2 mL，3 000 r/min 離心 5 min 后取上清，采用 ELISA 法檢測血清 PINP 和 CTX 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.3 骨微結構指標測定 造模后將小鼠麻醉，固定于micro-CT 儀檢測臺上，應用Scaner 軟件對小鼠左側脛骨進行掃描，測定骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分數（bone volume fraction，bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數量（trabecular number，Tb. N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb. Sp）及結構模型指數（structure model index，SMI）。掃描參數：電壓50 kV，電流800 μA，掃描分辨率12 μm，視野1 304×1 024。以脛骨膝關節(jié)側生長板下1 mm 為參考線，參考線以下2 mm 內區(qū)域設定為三維重建感興趣區(qū)域，采用N-Recon 軟件進行三維圖像重建，CT-AN軟件進行三維分析。

2.4 骨組織成骨細胞活性觀察 采用ALP 鈣-鈷染色法。取新鮮骨組織，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣液緩慢脫鈣2 周，流水沖洗過夜；梯度乙醇脫水，包埋，4 μm 厚切片。梯度乙醇脫蠟，流水沖洗；ALP孵育液37 ℃孵育2～12 h，流水沖洗；試劑B 37 ℃孵育5 min，流水沖洗；硫化工作液孵育1～2 min，流水沖洗；核固紅復染，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察骨組織成骨細胞活性。陽性結果為細胞質呈深褐色顆粒或片狀沉淀。

2.5 骨組織破骨細胞活性觀察 采用TRAP 染色法。取2.4 中制備的骨組織石蠟切片，梯度乙醇脫蠟，流水沖洗；TRAP固定液4 ℃固定30～60 s，流水沖洗；TRAP 孵育液37 ℃孵育45～60 min，流水沖洗；蘇木素染液染色5～8 min，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察骨組織破骨細胞活性。陽性結果為細胞質呈紫紅色。

2.6 骨組 織 Wnt、GSK-3β 和 β-catenin 表達檢測采用免疫組織化學法。取2.4 中制備的骨組織石蠟切片，梯度乙醇脫蠟，流水沖洗；檸檬酸緩沖液抗原修復；3%過氧化氫溶液室溫避光孵育15 min，阻斷內源性過氧化物酶；5% BSA 室溫封閉30 min；滴加Wn（t1∶200）、GSK-3β（1∶200）和 β-catenin（1∶100）Ⅰ抗，4 °C 孵育過夜；滴加 HRP 標記的Ⅱ抗，室溫孵育50 min；DAB 顯色，顯微鏡下觀察到棕黃色時終止顯色；蘇木素復染5 min，流水沖洗；1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗；PBS 返藍，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察圖像，棕色為陽性表達，藍色為細胞核。采用ImageJ軟件計算平均吸光度值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數據均經正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 造模后小鼠血清PINP和CTX水平的比較

WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組小鼠血清 PINP 和 CTX 水平分別高于 WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組（P＜0.05）；WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組血清PINP 和CTX 水平均依次降低（P＜0.05），WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組血清 PINP 和 CTX 水平亦均依次降低（P＜0.05）；但Mstn基因敲除后血清CTX 水平改變較PINP 更明顯，提示抑制Mstn基因表達可抑制T2DM 引起的骨形成及骨吸收增加，但主要以抑制過度骨吸收為主，且變化程度與Mstn 表達量有關，見表1。

表1 造模后小鼠血清PINP和CTX水平的比較Table 1. Serum levels of PINP and CTX in mice after modeling（μg/L. Mean±SD. n=6）

2 造模后小鼠骨微結構的比較

WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組小鼠骨小梁連續(xù)性和結構完好，骨皮質光滑，其中Mstn-/-組骨小梁數量明顯增多；WT+DM 組和Mstn+/-+DM 組骨小梁數量減少，骨小梁斷裂，骨皮質邊緣毛糙，而Mstn-/-+DM 組骨小梁數量明顯增多，連續(xù)性明顯改善，見圖1。WT+DM 組和Mstn+/-+DM 組小鼠 BMD、BV/TV、Tb. N及Tb. Th 分別低于 WT 組和Mstn+/-組（P＜0.05），Tb.Sp 和 SMI 分別高于 WT 組和Mstn+/-組（P＜0.05）；Mstn-/-+DM 組與Mstn-/-組比較上述指標的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Mstn-/-組BMD、BV/TV、Tb. N及 Tb. Th 均高于 WT 組和Mstn+/-組，Tb. Sp 和 SMI 均低 于 WT 組和Mstn+/-組（P＜0.05）；Mstn-/-+DM 組BMD、BV/TV、Tb. N 和 Tb. Th 均高于 WT+DM 組和Mstn+/-+DM 組 ，Tb. Sp 和 SMI 均 低 于 WT+DM 組 和Mstn+/-+DM 組（P＜0.05）；WT 組與Mstn+/-組，WT+DM組與Mstn+/-+DM 組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp及SMI 比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。這提示抑制T2DM 小鼠Mstn基因表達可改善骨微結構，增加骨強度，且變化程度與Mstn表達量有關。

Figure 1. Tibial micro-CT images of mice after modeling.圖1 造模后小鼠脛骨micro-CT圖

表2 造模后小鼠骨微結構指標的比較Table 2. Bone microstructure indexs of mice after modeling（Mean±SD. n=6）

3 造模后小鼠骨組織成骨細胞活性的比較

ALP 鈣-鈷染色顯示，WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組細胞質內深褐色沉淀分別多于WT組、Mstn+/-組和Mstn-/-組；WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組細胞質內深褐色沉淀依次減少，WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組細胞質內深褐色沉淀亦依次減少，見圖2。

Figure 2. ALP calcium-cobalt staining images of bone tissues from mice after modeling（scale bar=50 μm）.圖2 造模后小鼠骨組織ALP鈣-鈷染色圖

4 造模后小鼠骨組織破骨細胞活性的比較

TRAP 染色顯示，WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組細胞質內紫紅色沉淀分別多于WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組；WT組、Mstn+/-組和Mstn-/-組細胞質內紫紅色沉淀依次減少，WT+DM 組、Mstn+/-+DM組和Mstn-/-+DM 組細胞質內紫紅色沉淀亦依次減少；但Mstn基因敲除后破骨細胞活性改變較成骨細胞更明顯，提示抑制Mstn基因表達可抑制T2DM 引起的骨形成及骨吸收增加，但主要以抑制過度骨吸收為主，且變化程度與Mstn表達量有關，見圖3。

5 造模后小鼠骨組織Wnt、GSK-3β 和β-catenin 表達的比較

Figure 3. TRAP staining images of bone tissues from mice after modeling（scale bar=50 μm）.圖3 造模后小鼠骨組織TRAP染色圖

WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組骨組織 Wnt 和 β-catenin 表達分別低于 WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組（P＜0.05），GSK-3β 表達分別高于 WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組（P＜0.05）；Mstn-/-組骨組織Wnt和 β-catenin 表達均高于 WT 組和Mstn+/-組，GSK-3β表達均低于WT 組和Mstn+/-組（P＜0.05）；Mstn-/-+DM組骨組織Wnt 和β-catenin 表達均高于WT+DM 組和Mstn+/-+DM 組 ，GSK-3β 表 達 均 低 于 WT+DM 組 和Mstn+/-+DM 組（P＜0.05）；WT 組與Mstn+/-組，WT+DM組與Mstn+/-+DM 組骨組織 Wnt、GSK-3β 和 β-catenin表達比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4 及表3。這提示抑制T2DM 小鼠Mstn基因表達可上調骨組織Wnt/β-catenin 信號通路，且變化程度與Mstn表達量有關。。

Figure 4. Immunohistochemical staining images of Wnt，GSK-3β and β-catenin in bone tissues of mice after modeling（scale bar=50 μm）.圖4 造模后小鼠骨組織Wnt、GSK-3β和β-catenin免疫組化染色圖

表3 造模后小鼠骨組織Wnt、GSK-3β和β-catenin表達的比較Table 3. Expression of Wnt，GSK-3β and β-catenin in bone tissues of mice after modeling（Mean±SD. n=6）

討 論

研究顯示，糖尿病患者機體內分泌代謝紊亂，可引起骨吸收和骨形成失衡，導致繼發(fā)性骨質疏松［5-6］，但具體分子機制尚不清晰。Mstn是由骨骼肌分泌的肌肉因子，可調節(jié)骨代謝［2-3］。本團隊前期已證明，抑制Mstn表達可改善T2DM小鼠糖代謝［4］，但是否能調控T2DM 骨代謝尚無定論。因此，本研究在Mstn基因敲除基礎上誘導T2DM 小鼠模型，探討Mstn 對T2DM小鼠骨代謝及骨微結構的影響。

發(fā)生骨質疏松時，骨小梁微結構破壞和皮質骨多孔性改變導致骨強度降低及總骨量減少。micro-CT 不僅可準確測量骨體積和BMD，還可定量分析骨小梁三維形態(tài)結構指標，綜合評價骨量和骨強度，較雙能X 線吸收儀有明顯優(yōu)勢。BV/TV 是骨小梁總體積與樣本總體積之比，可反映松質骨中骨小梁骨量；Tb. N、Tb. Th 和Tb. Sp 是評價骨小梁空間形態(tài)結構的主要指標，骨質疏松時BV/TV、Tb. N 和Tb. Th 減小，Tb.Sp 增大。SMI 是反映骨小梁中桿狀結構和板狀結構比例的參數，骨質疏松時骨小梁由板狀結構轉變桿狀結構，SMI 增大［7］。本研究結果顯示，WT+DM 組和Mstn+/-+DM 組骨小梁數量減少，骨小梁斷裂，骨皮質邊緣毛糙，BMD、BV/TV、Tb.N 及Tb.Th 分別低于 WT 組和Mstn+/-組，Tb.Sp 和 SMI 分別高于 WT組和Mstn+/-組；與 WT 組和Mstn+/-組比較，Mstn-/-組骨小梁數量明顯增多，BMD、BV/TV、Tb. N 及Tb. Th 升高，Tb.Sp 和 SMI降低；與 WT+DM 組和Mstn+/-+DM 組比較，Mstn-/-+DM 組骨小梁數量明顯增多，BMD、BV/TV、Tb.N 及 Tb.Th 升高，Tb.Sp 和 SMI 降低。這提示抑制Mstn基因表達可改善T2DM 引起的骨微結構變化，減輕骨質疏松，Mstn可負向調節(jié)骨量。

骨轉換標志物可反映骨代謝情況。骨形成標志物包括PINP 和ALP 等，骨吸收標志物包括CTX 和TRAP 等。檢測血清或骨組織骨轉換標志物水平，可評估骨形成與骨吸收是否處于動態(tài)平衡。骨基質蛋白中90%為Ⅰ型膠原，Ⅰ型膠原的前體物質為原膠原，當原膠原被成骨細胞分泌到胞外介質時，可分解為Ⅰ型膠原和PINP，PINP 大部分進入血液循環(huán)，因此血清PINP可反映成骨細胞活性和膠原合成。CTX為Ⅰ型膠原降解產物，結構緊密，穩(wěn)定性強，不受腎臟的進一步降解，血清CTX 水平可反映破骨細胞活性和膠原降解。ALP 是成骨細胞分泌的細胞外酶，參與骨基質礦化，是成骨細胞成熟和具有活性的標志。TRAP 是酸性磷酸酶6 種同工酶中的一種，在破骨細胞中含量豐富，是特異性強和敏感度高的骨吸收標志物［8-10］。骨組織ALP和TRAP染色陽性范圍越大，表示成骨細胞和破骨細胞活性越高。本研究結果顯示，WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組血清PINP 和CTX 水平及骨組織中成骨細胞活性和破骨細胞活性分別高于WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組，但T2DM 時血清CTX 水平及破骨細胞活性的改變較血清PINP 及成骨細胞活性更明顯，提示T2DM 小鼠骨代謝為高轉換型，骨分解代謝大于合成代謝。其可能的機制如下：T2DM 時胰島素相對不足，導致體內1，25-（OH）2D3生成及活性降低，腸道鈣吸收減少，加上高血糖滲透性利尿使鈣、磷被排出體外，血液中鈣濃度降低，引起繼發(fā)性甲狀旁腺機能亢進，破骨細胞活性增強，骨吸收增加；T2DM 時骨轉換高度活躍，盡管骨形成與骨吸收均增加，但高血糖可影響成骨細胞在膠原蛋白上的黏附，引起成骨細胞功能障礙，使骨吸收大于骨形成，骨代謝失衡，導致骨量降低［9-10］。本研究結果顯示，WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組血清PINP 和CTX 水平及骨組織中成骨細胞活性和破骨細胞活性依次降低，WT+DM 組、Mstn+/-+DM 組和Mstn-/-+DM 組亦依次降低，但抑制Mstn基因表達對血清CTX 水平及破骨細胞活性的改變更明顯，提示抑制Mstn基因表達可抑制T2DM 引起的骨形成及骨吸收增加，但主要以抑制過度骨吸收為主。

研究顯示，經典Wnt 信號通路即Wnt/β-catenin信號通路在骨代謝中發(fā)揮重要作用，上調Wnt/βcatenin信號通路可改善糖尿病大鼠骨質疏松［11-13］，表明Wnt/β-catenin 信號通路可能參與糖尿病骨質疏松的發(fā)生。β-catenin 是由CTNNB1基因編碼的一類多功能蛋白，是Wnt信號通路的關鍵效應分子。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌與細胞膜上受體結合形成復合物，該受體由7 次跨膜的卷曲蛋白受體及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6 共同組成，當形成復合物時，復合物活化散亂蛋白（Dishevelled protein），觸發(fā)細胞內的信號轉導，進而抑制由GSK-3β、結腸癌抑制因子和軸蛋白等構成的蛋白降解復合物，使細胞質中的β-catenin 累積并進入細胞核，與核內轉錄因子T 細胞因子/淋巴樣增強因子結合，激活并調節(jié)下游靶基因的轉錄和表達［14-15］。上述實驗結果已證實Mstn基因敲除可減輕T2DM 小鼠骨質疏松，但該表型改變是否可通過Wnt/β-catenin 信號通路實現尚無定論，因此本研究進一步采用免疫組化染色法觀察Mstn基因敲除對 T2DM 小鼠骨組織 Wnt/β-catenin 信號通路的影響。結果顯示，WT+DM 組、Mstn+/-+DM組和Mstn-/-+DM 組骨組織 Wnt 和 β-catenin 表達分別低于 WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組，GSK-3β 表達分別高于 WT 組、Mstn+/-組和Mstn-/-組；與 WT 組和Mstn+/-組比較，Mstn-/-組骨組織Wnt 和β-catenin 表達升高，GSK-3β 表達降低；與 WT+DM 組和Mstn+/-+DM 組比較，Mstn-/-+DM 組骨組織 Wnt 和 β-catenin 表達升高，GSK-3β 表達降低。這提示Mstn基因表達缺失減輕T2DM 骨質疏松可能是通過上調Wnt/β-catenin 信號通路來實現的，Wnt/β-catenin 信號通路可作為糖尿病骨質疏松治療干預的靶點之一。

本研究結果提示，抑制T2DM 小鼠Mstn基因表達可上調骨組織Wnt/β-catenin 信號通路，抑制骨吸收，增加骨強度，從而減輕骨質疏松?；贛stn在糖代謝及骨代謝方面的獨特作用，Mstn 抑制劑可能將成為糖尿病骨質疏松有潛力的治療藥物。但本研究為動物實驗，分子機制研究不夠深入，Mstn在糖尿病骨質疏松中的作用尚需進一步探討。