真絲文物霉變菌株的分離、鑒定及防霉藥劑篩選

王毅婧，黃陽陽，黃小萃，劉 臣，邱海麗

(蘇州市職業(yè)大學絲綢應用技術研究所，江蘇蘇州 215002)

0 引 言

中國自古就以“絲綢之國”享譽國際，古代發(fā)達的絲綢紡織業(yè)為我們留下了諸多寶貴的文化遺產(chǎn)[1]。近年來各種考古工作中出土了大量的真絲文物，成為了珍貴的絲綢檔案[2-3]。然而絲織品是一種天然蛋白質(zhì)纖維，其儲存環(huán)境中存在的霉菌等微生物可以以真絲蛋白為營養(yǎng)基質(zhì)，在適宜條件下迅速繁殖，引起真絲文物霉變，從而導致真絲文物色澤改變、纖維褪化，嚴重影響真絲文物的保存[4]。因此，對真絲文物防霉技術的研究越來越受到人們的重視。目前對霉變真絲文物的保護工作以霉斑清除及生物技術手段為主[5-7]，而真絲文物由于其蛋白成分及纖維結構的特殊性，即使清除其表面霉斑后，保存不當仍會發(fā)生二次霉變。因此，分離出最易引起真絲文物霉變的微生物，并對其進行鑒定，為真絲文物防霉技術的開發(fā)提供靶標菌株，同時篩選安全、高效的防霉藥劑，對真絲文物長期防霉保護具有重要意義。近年來，異噻唑啉酮及氨基甲酸酯類等防霉劑因其具有長效、低毒、高效、廣譜等特點，被廣泛應用到各類文物的防霉保護及防霉制品的生產(chǎn)中[8-10]。通過測定不同真絲文物霉變菌株對各防霉藥劑的敏感性差異，可以針對性地篩選出真絲文物防霉處理劑，以期為真絲文物防霉控制提供理論基礎和防治依據(jù)。

1材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1材料及試劑 霉變黑色團花馬褂及霉變元色亮花緞坎肩(圖1)，來源于蘇州絲綢博物館于20世紀90年代收集的民國時期民間傳世品，館藏儲存溫度10～20 ℃，濕度50%～60%；孟加拉紅培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)及察氏培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術股份有限公司；3-碘-2丙炔基-N-正丁基氨基甲酸酯(IPBC)、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MIT)、苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)、聚六亞甲基單胍磷酸鹽(PHMG)購自佛山市麗源化工有限公司。

圖1 霉變真絲文物Fig.1 Silk relics contaminated by mold

1．1．2主要儀器 SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；MJPS-150型霉菌培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；XSP-2C型顯微鏡，上海興行實業(yè)有限公司；漩渦振蕩器，合肥艾本森科學儀器有限公司。

1．2 霉變菌株分離及鑒定

1．2．1霉變菌株分離、純化 用無菌棉簽輕輕擦拭真絲文物表面霉斑部位，蘸取霉菌孢子，在孟加拉紅培養(yǎng)基平板中劃線，于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5～7 d形成菌落，選擇菌落形態(tài)典型、分離效果明顯的平板，分別挑取單菌落邊緣的菌絲，轉接到PDA培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)7 d進行純化培養(yǎng)，經(jīng)此方法3次純化后獲得引起真絲文物霉變的單菌落菌株，轉入PDA斜面試管中28 ℃培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)后的斜面菌種于4 ℃冷藏箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2形態(tài)學鑒定 采用點植法將分離純化后的斜面菌種接種于察氏培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察霉菌菌落形態(tài)并制作顯微鏡鏡檢切片[11]，記錄霉變菌株的生長速度、菌落形態(tài)、顏色等特點，顯微鏡鏡檢觀察霉菌分生孢子梗及分生孢子形態(tài)特征，按照《真菌鑒定手冊》[12]對分離得到的霉菌進行初步鑒定。

1．2．3分子生物學鑒定 擴增真菌ITS序列使用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’。PCR反應體系為25 μL，組分為：Template 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，酶0.2 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR循環(huán)條件為：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃修復延伸10 min，4 ℃保存。委托上海生工對分離純化后的霉變菌株進行序列測定，測序得到的菌株基因序列分別于NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析，與已知序列進行對比，進行同源性分析[13]。利用MEGA7軟件進行多序列比對，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結合霉菌的形態(tài)學特征確定真絲文物各霉變菌株的分類學地位。

1．3 防霉藥劑篩選

1．3．1防霉劑藥效 試驗按照IPBC、MIT、BIT、PHMG的藥劑使用說明書及預實驗結果，分別將四種防霉劑稀釋為5個濃度梯度(表2)。分別取10 mL無菌水加入到純化培養(yǎng)好的各斜面菌種中，用無菌接種環(huán)輕刮表面洗出霉菌孢子，將洗出的孢子液倒入含玻璃珠的離心管中，4 000 r/min離心10 min，去掉上清液，加入50 mL無菌水離心洗滌沉淀三次，用無機鹽營養(yǎng)液稀釋洗滌后的沉淀，制備霉菌孢子懸浮液，血球計數(shù)法計數(shù)，控制霉菌孢子懸浮液濃度為1×106個/mL～5×106個/mL[14]。取0.5 mL孢子懸浮液接種至PDA培養(yǎng)基平板中，涂布均勻，將無菌牛津杯置于培養(yǎng)皿中心，取不同濃度的各藥劑0.2 mL分別加入到牛津杯中，每個濃度重復3次，無菌水做對照，28 ℃培養(yǎng)7 d觀察藥效。

1．3．2藥效試驗數(shù)據(jù)處理 采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑占含菌培養(yǎng)基直徑的百分率計算相對抑菌率[15]。以防霉劑各濃度對數(shù)值為自變量x，相對抑菌率為因變量y，建立防霉劑毒力回歸方程，計算抑制中濃度EC50[16]。

2 結 果

2．1 霉變菌株形態(tài)學觀察

通過平板純化，從霉變真絲文物中共分離4株霉菌，分別編號為A、D、H、K。依據(jù)霉菌形態(tài)學培養(yǎng)方法對各菌株進行培養(yǎng)，選取典型菌株進行形態(tài)學觀察，為霉變菌株的鑒定提供參考。各菌株在察氏培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、分生孢子梗及分生孢子等顯微形態(tài)特征如圖2所示。

圖2 霉菌菌落形態(tài)與顯微形態(tài)Fig.2 Colony morphology and microscopic shape of mold strains

菌株A：生長速度中等，菌絲體較長、白色，呈輻射狀向周圍生長，菌落背面呈黃橙色。分生孢子梗與菌絲明顯不同，分生孢子梗光滑、無色、無分枝、有隔膜。

菌株D：生長速度緩慢，菌落呈絨毛狀、乳白色，菌落背部呈淺橙色。分生孢子梗光滑、無色、有分枝、有隔膜。分生孢子小而光滑，球形或亞球形。

菌株H：生長速度緩慢，菌落呈絨毛狀，初期呈白色，后變?yōu)榫G褐色。分生孢子梗無膨大，線形，單生，暗色，有分隔；分生孢子卵圓形、橢圓形或紡錘形，無色，光滑，有隔膜0～2個。

菌株K：生長速度緩慢，菌落呈絨毛狀，灰綠色至黑色，邊緣白色，菌落表面有褶皺。分生孢子梗單枝或稍分枝，線形，有曲折，暗色，有分隔；分生孢子呈鏈狀，卵圓形或橢圓形，無色，光滑，有隔膜。

2．2 分子生物學鑒定結果

將4株霉菌的基因序列與NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中收錄的基因序列進行同源性比對，選取數(shù)據(jù)庫中參照序列同源性最高的霉菌標準序列為參比對象，測序比對結果見表1。選取同源性最高的相關菌株進行同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，確定菌株的分類學地位。

表1 4株霉菌同源性比對Table 1 BLAST results of the 4 mold strains

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果，結合不同菌株形態(tài)學特征和同源性比對結果，確定4株菌株按照親緣關系分別屬于半知菌類叢梗孢目的3個屬：叢梗孢科曲霉族曲霉屬(Aspergillus)，暗梗孢科節(jié)孢霉族節(jié)孢霉屬(Arthrinium)，暗梗孢科雙孢亞科芽枝霉屬(Cladosporium)。其中A、D分別屬于節(jié)孢霉屬和曲霉屬，H、K屬于芽枝霉屬。同源性比對結果顯示，與4株霉變菌株同源性高于99%的序列較多。通過圖2形態(tài)學觀察可知H與K雖屬于同屬但不同種。圖3表明，A、D、H、K菌株在分類學上分別與KP269008．1、KT310987．1、KP278171．1、KX078479．1的親緣關系更近，但尚不足以鑒定到具體的種。

圖3 基于ITS基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree established on the basis of ITS

2．3 防霉劑藥效結果分析

根據(jù)4種防霉劑的抑菌效果建立不同菌株毒力回歸方程，試驗結果顯示4種防霉劑有效成分含量與抑菌率相關系數(shù)均達顯著水平，不同防霉劑對供試霉菌均有一定的抑制效果，且抑制效果均與藥劑濃度呈正比，但是不同防霉劑對不同真絲文物霉變菌株的抑制效果差異較大。4種防霉劑中PHMG及BIT的抑菌效果相對較低，其中PHMG對菌株A及菌株H的毒力較低，EC50分別為4 093.028 3 mg/L及2 949.672 2 mg/L；BIT對菌株D及菌株K的毒力最小，EC50分別為2 082.539 5 mg/L和5 584.528 7 mg/L。同一類型的防霉劑對不同真絲文物霉變菌株的抑菌效果也具有較大差異，供試防霉劑中BIT與MIT均屬于異噻唑啉酮類藥劑，其中BIT對4種真絲文物霉變菌株的抑制作用較小，而MIT對A、H及K菌株的毒力均優(yōu)于其他3種防霉劑，EC50分別為56.235 5 mg/L、292.173 7 mg/L及190.045 6 mg/L，對D菌株的毒力僅次于IPBC，EC50為62.681 5 mg/L。IPBC的綜合毒力僅次于MIT，對菌株D的毒力最高，EC50僅為27.454 0 mg/L，對菌株A、H及K菌株的EC50分別為250.283 0 mg/L、480.325 7 mg/L及997.239 2 mg/L(表2～5)。由此可以看出，MIT及IPBC對真絲文物霉變菌株有良好的抑制效果，具有一定的推廣應用前景。

表2 4種防霉劑對菌株A的毒力測定Table 2 Toxicity of 4 kinds of fungicides on Strain A

表3 4種防霉劑對菌株D的毒力測定Table 3 Toxicity of 4 kinds of fungicides on Strain D

表4 4種防霉劑對菌株H的毒力測定Table 4 Toxicity of 4 kinds of fungicides on Strain H

表5 4種防霉劑對菌株K的毒力測定Table 5 Toxicity of 4 kinds of fungicides on Strain K

3 討 論

研究顯示霉變真絲文物中芽枝霉屬霉菌在真絲文物中污染情況較為嚴重，本研究分離得到的霉變菌株種類與真絲文物中經(jīng)常出現(xiàn)的霉菌種類基本一致[5，17]。由于采樣點的局限性，本研究僅分離得到4株真絲霉變菌株，且均是從霉變真絲文物表面直接取樣得到的，不能全面反映真絲文物的霉菌污染情況。今后可對真絲文物存放環(huán)境中的霉菌取樣鑒定以進行對比，進一步研究不同存放環(huán)境對真絲文物霉變的影響。霉菌在真絲文物表面生長不僅會影響真絲文物的保存，同時霉菌產(chǎn)生的代謝物亦會對人體產(chǎn)生危害[18]。

4 結 論

本研究測定了4種防霉劑對4株真絲文物霉變菌株的毒力，結果顯示MIT和IPBC對4株真絲文物霉變菌株的抑菌效果較好，后續(xù)可利用此兩種防霉劑對真絲文物表面進行防霉處理。另外本研究僅對4種防霉劑的單一防霉效果進行了探討，多種防霉劑復合使用對真絲文物霉變菌株的防治效果還有待進一步的研究。本研究通過對真絲文物霉變菌株的鑒定及防霉藥劑的篩選，為進一步探究如何抑制真絲文物表面的霉菌生長，降低霉菌污染的危害，延長真絲展品及文物的保存提供了有效依據(jù)。