鈉鹽替代物對(duì)馬蘇大馬哈魚子醬品質(zhì)的影響

武瑞赟，王 安，穆文強(qiáng)，龐 德，李平蘭

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

魚子醬被稱為世界三大珍味之首，與鵝肝、松露并稱三大美食，也是國(guó)內(nèi)經(jīng)濟(jì)魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主打產(chǎn)品。魚籽食品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類齊全，富含蛋白質(zhì)、維生素、必需氨基酸和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，近年來，需求呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。魚籽的加工工藝中，為了去腥和延長(zhǎng)貨架期，鹽漬是主要的處理環(huán)節(jié)。鹽漬過程中使用到的調(diào)料主要是氯化鈉，氯化鈉的使用不僅可以給產(chǎn)品帶來典型的咸味口感以及去除腥味的作用，同時(shí)，氯化鈉具有較高的滲透壓，使微生物細(xì)胞脫水、變形并影響微生物細(xì)胞中水分的代謝，從而抑制其生命活動(dòng)，減緩有害微生物的生長(zhǎng)，使魚子醬等產(chǎn)品的安全性和可食用性得到了保障。

雖然氯化鈉在居民日常飲食中必不可少，但是大量的流行病學(xué)、臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，過量的鈉攝入會(huì)導(dǎo)致高血壓、心血管疾病，而高血壓會(huì)導(dǎo)致心肌梗死、功能衰竭等。世界衛(wèi)生組織《2030年可持續(xù)發(fā)展議程》中提到，每年約有410 萬人因鈉鹽攝入過量而死，所以被認(rèn)為是人類不可忽視的“健康殺手”。Du Shufa等對(duì)食鹽使用量數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析發(fā)現(xiàn)，在過去的30 年里，中國(guó)人均鈉攝入量在逐步降低，但仍然是世界衛(wèi)生組織推薦值（＜2.0 g/d）的2 倍，超過1/4的人鈉攝入量大于5.0 g/d。由此可見，我國(guó)的減鹽防控工作仍然任重而道遠(yuǎn)。

如何降低氯化鈉含量又不影響鹽漬后魚子醬的品質(zhì)？當(dāng)下，食品中減鹽的措施主要集中在降低鹽含量、改變鹽粒形態(tài)、改善加工工藝，以及添加鈉鹽替代 物等方式。其中，鈉鹽替代物主要是通過對(duì)產(chǎn)品中使用的氯化鈉進(jìn)行部分替代，減少鈉離子的攝入，從而達(dá)到減鹽的目的。相較于其他方法，此方法因成本較低、操作方便的特點(diǎn)，以及鈉鹽替代物在口感上具有和鈉鹽相同的作用，均能夠作為氯化鈉的替代物來使用并賦予食物咸味特征，因此被廣泛應(yīng)用于食品減鹽。然而，鈉鹽替代物種類較為單一，目前主要為氯化鹽（如氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等），其他替代物還未被全面使用，因次，開發(fā)復(fù)合鈉鹽替代物具有實(shí)際的應(yīng)用前景。

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)魚籽營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了全面的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)魚籽中水溶性蛋白和維生素含量最多，水洗能夠造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失。因次，在魚子醬的實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)減少水洗次數(shù)，但又得保證鹽漬的作用可以得到發(fā)揮。在此基礎(chǔ)上，本研究擬采用多種鈉鹽替代物聯(lián)合使用的方法，以微生物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)、最佳陡坡試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳的鈉鹽復(fù)合替代物配方，以期降低氯化鈉的使用量，減少魚子醬中的鈉含量；進(jìn)一步通過對(duì)pH值、水分活度（water activity，）、色差等品質(zhì)特性的研究，比較全面地反映鈉鹽替代物的減鹽效果與對(duì)馬蘇大馬哈魚子醬品質(zhì)及貨架期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬蘇大馬哈魚籽 北京市鱘魚、鮭鱒魚水產(chǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)。

氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、乳酸鉀、乳酸鈣 湖北藍(lán)天有限責(zé)任公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCL-1300超凈工作臺(tái) 北京賽伯樂儀器有限公司；YXQ-LS-S高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；ML54-02分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HD3A智能水分活度測(cè)量?jī)x 無錫市華科儀器儀表有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；NH-300色差儀 日本Konica Minolta 公司；KDN-1000自動(dòng)凱氏定氮儀 杭州綠博儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚子醬制備

將新鮮魚籽解凍，用去離子水清洗去除雜質(zhì)后，按照下述工藝進(jìn)行魚子醬制備：原料→清洗→挑選→鹽漬→ 清洗→瀝干→包裝→冷藏。其中鹽漬過程，加入水的質(zhì)量與魚籽質(zhì)量比1∶1，用鹽量4%，鹽漬時(shí)長(zhǎng)10 min，清洗時(shí)長(zhǎng)5 min，后保存在27 ℃（常溫）條件下。整個(gè)過程均于無菌超凈臺(tái)進(jìn)行，所使用的器具均為食品級(jí)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以貯藏12 h魚子醬的微生物菌落總數(shù)為指標(biāo)，在僅使用氯化鈉（100%）鹽漬的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，針對(duì)乳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂與抗壞血酸鈣4 種替代物，分別按照10%、20%、30%、40%與50%的替代比例設(shè)置試驗(yàn)組，探求不同鈉鹽替代物的最佳替代比例。

1.3.3 PB試驗(yàn)

PB試驗(yàn)可從最少的試驗(yàn)次數(shù)中從多因素中準(zhǔn)確、便捷地篩選出顯著性影響因素。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)（表1），響應(yīng)值為貯藏12 h魚子醬的菌落總數(shù)。對(duì)各因素進(jìn)行方差分析，并根據(jù)貢獻(xiàn)率大小從中篩選出貢獻(xiàn)率較高的3 個(gè)因素進(jìn)行下一步研究。

表1 PB試驗(yàn)因素與水平編碼表Table 1 Code levels and corresponding actual levels of variables used in PB design

1.3.4 最佳爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)的步長(zhǎng)效應(yīng)與結(jié)果，綜合分析菌落總數(shù)，得到顯著因素及響應(yīng)值，以高替代比例為優(yōu)先原則，設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)的方向和步長(zhǎng)。方向根據(jù)顯著因素的效應(yīng)值表現(xiàn)為增加或減少，步長(zhǎng)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of the steepest grade test

1.3.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

選取乳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂替代比例3 個(gè)因素作為自變量，使用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，由最佳陡坡試驗(yàn)中選擇的最優(yōu)替代比例作為響應(yīng)中心點(diǎn)，以貯藏12 h魚子醬的菌落總數(shù)為響應(yīng)值，因素與水平編碼如表3所示。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼表Table 3 Code levels and corresponding actual levels of variables used in Box-Behnken design

1.3.6 菌落總數(shù)測(cè)定

稱取1 g魚籽醬，破碎，振蕩均勻后取上清液備用。根據(jù)GB 4789.1—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，吸取100 μL樣品溶液進(jìn)行涂布，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，培養(yǎng)溫度37 ℃，以菌落形成單位在30～300 CFU/g為宜。

1.3.7 OD測(cè)定

稱取2 g馬蘇大馬哈魚子醬實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組樣品，加入8 mL去離子水，破碎攪拌均勻后，8 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定OD。

1.3.8 pH值測(cè)定

準(zhǔn)確稱量0.2 g魚籽醬，加入0.8 mL去離子水，將魚籽破碎均勻后，靜置沉淀，使用電子pH計(jì)測(cè)定上清液的pH值。

1.3.9 色澤測(cè)定

采用色彩色差計(jì)，在自然燈光下測(cè)定魚子醬的亮度值（*）、紅度值（）和黃度值（*），每組樣品測(cè)定3 次。

1.3.10測(cè)定

不僅可以表示食品中水的能量狀態(tài)，又能揭示食品質(zhì)量變化和微生物繁殖對(duì)其水分的可利用程度，是食品加工過程及成品質(zhì)量的重要控制參數(shù)和監(jiān)控指標(biāo)。取適量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組馬蘇大馬哈魚子醬樣品分別于水分測(cè)量皿中，在0、6、12、18、24 h進(jìn)行取樣。使用水分活度測(cè)量?jī)x檢測(cè)樣品，測(cè)量時(shí)間10 min，示數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS Statistix 25.0軟件進(jìn)行均值計(jì)算及方差分析，采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，使用不同替代比例的鈉鹽替代物進(jìn)行鹽漬后，微生物數(shù)量均呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，說明鈉鹽的含量對(duì)微生物生長(zhǎng)具有一定的作用。另外，考慮過高或過低的替代比例可能會(huì)帶來不適口感等影響，通過單因素試驗(yàn)得到的乳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂及抗壞血酸鈣的替代比例分別為10%、20%、10%、40%。

圖1 不同鈉鹽替代物單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Effect of individual sodium salt substitutes on total bacterial count investigated by one-factor-at-a-time method

2.2 PB試驗(yàn)結(jié)果

選擇對(duì)乳酸鉀替代比例（）、氯化鉀替代比例（）、 氯化鎂替代比例（）和抗壞血酸鈣替代比例（） 4 個(gè)因素進(jìn)行分析，考察各個(gè)因素對(duì)魚子醬菌落總數(shù)的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)中各因素的較適范圍，以菌落總數(shù)為響應(yīng)值，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

表4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 PB design and experimental results

表6 PB試驗(yàn)整體因素模型方差分析表Table 6 Analysis of variance for the effect of substitution levels of four non-sodium salts for NaCl on total bacterial count as per PB design

由表5～6可知，氯化鉀替代比例（）、氯化鎂替代比例（）和抗壞血酸鈣替代比例（）3 個(gè)因素對(duì)菌落總數(shù)的增加顯示為正效應(yīng)，乳酸鉀替代比例（）顯示為負(fù)效應(yīng)，抗壞血酸鈣替代比例貢獻(xiàn)率最低（0.19）， 因此選擇乳酸鉀替代比例、氯化鉀替代比例、氯化鎂替代比例3 個(gè)影響最顯著的因素進(jìn)行下一步的最陡爬坡試驗(yàn)。

表5 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及效應(yīng)分析Table 5 Low and high levels of variables and effect analysis as per PB design

2.3 最佳爬坡試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)擬合區(qū)域越靠近響應(yīng)值中心，響應(yīng)面擬合方程越精準(zhǔn)。最佳爬坡法以各因素正負(fù)效應(yīng)值確定爬坡方向，能夠準(zhǔn)確逼近最佳值區(qū)域。依據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)最佳爬坡路徑，其中乳酸鉀替代比例為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少，氯化鉀、氯化鎂替代比例為正效應(yīng)，應(yīng)增加。按照因素水平的變化方向及步長(zhǎng)設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

由圖2可知，3號(hào)樣品的初始菌落總數(shù)較高，但后續(xù)貯藏12、18、24 h均發(fā)現(xiàn)3號(hào)樣品的抑菌效果均優(yōu)于其他組樣品，故以3號(hào)樣品的因素與水平為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖2 最佳陡坡試驗(yàn)拐點(diǎn)圖Fig. 2 Inflection point for total bacterial count in samples stored for different periods of time as per steepest ascent design

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB試驗(yàn)和最佳陡坡試驗(yàn)的結(jié)果（乳酸鉀替代比例17.5%、氯化鉀替代比例15.0%、氯化鎂替代比例35.0%），采用響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表7所示。

表7 復(fù)配鹽最佳配方的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Box-Behnken design and experimental response

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，建立回歸模型并進(jìn)行方差分析，由表8可知：模型值小于0.000 1，高度顯著，說明與實(shí)際情況擬合良好；失擬項(xiàng)結(jié)果表明，未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾?。ㄖ禐?.914 0，不顯著）；該模型的決定系數(shù)=0.936 1，說明該模型擬合較好。對(duì)于魚子醬產(chǎn)品，當(dāng)菌落總數(shù)達(dá)到6.00（lg（CFU/g））即可認(rèn)為產(chǎn)品腐敗，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在27 ℃放置12 h時(shí)菌落總數(shù)達(dá)到 6.00（lg（CFU/g）），因此以27 ℃放置12 h的菌落總數(shù)為響應(yīng)值建立響應(yīng)面模型。

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of quadratic polynomial model

由圖3可知，等高線圖均為橢圓形，響應(yīng)面三維圖具有穩(wěn)定點(diǎn)，且為最大值。對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合處理得到的曲線為：=6.316 2-0.031 2-0.010 0- 0.009 0＋0.007 5＋0.025 0＋0.036 7＋0.109 2＋0.072 3。

圖3 乳酸鉀、氯化鉀和氯化鎂替代比例對(duì)菌落總數(shù)影響的 等高線圖和響應(yīng)面圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the individual and interactive effects of variables on total bacterial count

參照以上試驗(yàn)結(jié)果得到的最優(yōu)鈉鹽替代物復(fù)合配方為乳酸鉀替代比例18.55%、氯化鉀替代比例15.105%、氯化鎂替代比例35.08%，即當(dāng)正常組氯化鈉使用量為4%時(shí)，最優(yōu)鈉鹽替代物復(fù)合配方為乳酸鉀添加量0.74%、氯化鉀0.60%、氯化鎂1.40%，在保證鹽漬鹽使用量不變的基礎(chǔ)上可將氯化鈉使用量降至1.26%。

以乳酸鉀0.74%、氯化鉀0.60%、氯化鎂1.40%添加量為實(shí)驗(yàn)組，氯化鈉組為對(duì)照組，進(jìn)一步測(cè)定魚子醬貯藏過程中品質(zhì)特性。

2.5 魚子醬貯藏過程中指標(biāo)變化

2.5.1 OD的變化

OD與透光率呈負(fù)相關(guān)。由圖4可知，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的初始OD分別為0.375±0.002、0.322±0.040。27 ℃貯藏條件下，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是實(shí)驗(yàn)組的OD上升趨勢(shì)較對(duì)照組緩慢，到達(dá)旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期所需時(shí)間也較長(zhǎng)，這與菌落總數(shù)的測(cè)定結(jié)果一致，說明微生物繁殖速度減緩，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組可有效抑制微生物的生長(zhǎng)。

圖4 魚子醬貯藏過程中OD600 nm的變化Fig. 4 Changes in OD600 nm in caviar during storage

2.5.2 pH值的變化

由圖5可知，在貯藏過程中，魚子醬的pH值總體均呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，這主要是因?yàn)橘A藏過程中，磷酸肌酸等物質(zhì)分解產(chǎn)生磷酸等酸性物質(zhì)，使魚子醬的pH值下降，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚子醬中的內(nèi)源性酶和表面微生物分解蛋白質(zhì)等含氮化合物，產(chǎn)生較多的堿性物質(zhì)，造成pH值上升。由于貯藏溫度與鹽漬過程使用的鹽用量不同，使上下波動(dòng)趨勢(shì)快慢程度不同，各處理組均呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，但是相比對(duì)照組而言，實(shí)驗(yàn)組的變化趨勢(shì)較為緩慢，說明實(shí)驗(yàn)組的微生物活動(dòng)滯后，腐敗程度與菌落總數(shù)存在一定的關(guān)系，與菌落總數(shù)分析結(jié)果基本一致，說明得到的低鹽替代配方可以有效減緩微生物活性，進(jìn)而延緩魚子醬腐敗進(jìn)程。

圖5 魚子醬貯藏過程中pH值的變化Fig. 5 Changes in pH value of caviar during storage

2.5.3 色澤的變化

魚籽本身的生化、微生物變化的外部表現(xiàn)之一是色澤變化，而色澤變化與魚籽的新鮮度有直接關(guān)系。由表9 可知，魚籽醬貯藏過程中，*呈現(xiàn)上升趨勢(shì)但有所波動(dòng)，這可能是由于在貯藏前期，溫度過高，魚籽表面水分損失較大，表面變得干燥，因此缺少水分的折射，*降低，隨著微生物的加速繁殖與相關(guān)酶的作用，魚籽逐漸腐敗萎縮，持水力下降，水分向魚籽表面滲透，使得表面濕潤(rùn)程度增加，造成*上升。此時(shí)，魚籽質(zhì)地逐漸變軟。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組魚籽醬的*在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，變化幅度較大。這可能與貯藏過程中水分的析出有關(guān)，貯藏前期，表面水分減少，魚籽表面變得干燥，使*上升，在貯藏時(shí)間到達(dá)6 h時(shí)，魚籽的*升高到最大值，即紅色加深；在后續(xù)的貯藏過程中，由于水分的析出，表面由干燥逐漸濕潤(rùn)，*逐漸降低。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組魚籽醬的*均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，變化幅度較大。

表9 魚子醬貯藏過程中色澤的變化Table 9 Color change of caviar during storage

2.5.4的變化

由圖6可知，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組魚子醬在27 ℃的貯藏溫度下呈現(xiàn)基本一致的變化趨勢(shì)，且均大于0.90。這與色澤的測(cè)定結(jié)果相吻合：貯藏過程中，魚籽表面與內(nèi)部的水分存在遷移現(xiàn)象，導(dǎo)致出現(xiàn)波動(dòng)，但由于貯藏環(huán)境為封閉的恒溫培養(yǎng)箱，空氣流速較小，水分蒸發(fā)也較慢，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的雖呈波動(dòng)趨勢(shì)，但總體變化不大。

圖6 魚子醬貯藏過程中aw的變化Fig. 6 Changes in aw in caviar during storage

3 結(jié) 論

本研究以微生物菌落總數(shù)為指標(biāo)，經(jīng)單因素、響應(yīng)面等試驗(yàn)確定魚子醬中最佳鈉鹽復(fù)合物替代配方為乳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂的替代比例分別為17.64%、14.61%、34.36%。通過與正常組魚子醬進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組魚子醬持續(xù)保持在0.9以上、*均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)、OD增長(zhǎng)緩慢，表明優(yōu)化得到的鈉鹽替代物復(fù)合鹽可以在一定程度上延長(zhǎng)魚子醬貨架期，延緩魚子醬產(chǎn)品的腐敗進(jìn)程。因此，該鈉鹽替代物復(fù)合鹽配方可用于魚子醬的制備，且能夠提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性，在鹽漬品加工行業(yè)具有良好的應(yīng)用潛力。