貴州省浮萍形態(tài)學(xué)鑒定與遺傳多樣性分析

馮丹 譚艾娟 呂世明 鄭萌盟 楊貴利,

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心,貴陽 550025;2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025;3.中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所環(huán)境地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025)

浮萍,屬于被子植物門,單子葉植物綱,共有5個(gè)屬,分別是綠萍屬(Lemna)、紫萍屬(Spirodela)、斑萍屬/蘭氏萍屬(Landoltia)、泥萍屬(Wolffiella)和無根萍屬/蕪萍屬(Wolffia)[1]。浮萍是世界上最小的開花植物,植株較小,只有幾到幾十毫米。浮萍結(jié)構(gòu)比較簡單,僅有葉狀體和根,通常漂浮于水面,通過葉狀體或根從水中吸收營養(yǎng)物質(zhì)[2];浮萍通常以無性繁殖的方式生長,從母葉狀體無性生殖出子葉狀體,繁殖速率近似指數(shù)增長,生長周期短至1—2d即可實(shí)現(xiàn)生物量翻倍。浮萍在溫度較低時(shí)會(huì)產(chǎn)生休眠體進(jìn)入休眠狀態(tài),如越冬前在其夾囊或開口內(nèi)生橢圓形的冬芽,脫離母體沉入水底,第2年當(dāng)溫度回升時(shí)浮出水面形成新的植株重新生長,生命力極強(qiáng)[3,4];浮萍可以在pH 4.5—7.2,溫度為2—35℃的條件下生長,具有較寬的pH和溫度域,對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng),所以浮萍分布廣泛,在世界各地的水田、池沼和湖泊等靜水中均有分布[5]。

近年來,浮萍以其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)逐漸引起關(guān)注,已被廣泛應(yīng)用于生物燃料、毒性測(cè)試、環(huán)境監(jiān)測(cè)和污水修復(fù)等方面[6,7]。浮萍能克服藻類的缺點(diǎn),利用生長抑制試驗(yàn)評(píng)價(jià)污染物質(zhì)的毒性,可以更好、更標(biāo)準(zhǔn)地反映廢水毒性的變化[8,9],同時(shí)也是地表水中污染物(有機(jī)污染物、重金屬、農(nóng)藥、放射性廢物、納米材料和碳?xì)浠衔?的有效生物蓄積器[10,12]。其次,浮萍作為新型生物反應(yīng)器可以用于合成疫苗、抗體、藥用蛋白和工業(yè)酶制劑等生物制品,在生物制藥方面也表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力[13]。目前,利用轉(zhuǎn)基因浮萍表達(dá)抗體已有研究報(bào)道[14],例如Cox等[15]在Lemna minor中成功表達(dá)了單克隆抗體(Monoclonal antibody,mAb),Khvatkov等[16]在Wolffia arrhiz中成功表達(dá)了粒細(xì)胞集落刺激因子(Gh-CSF),以上結(jié)果為開發(fā)以浮萍為生物反應(yīng)器合成抗體、蛋白等生物制品提供了依據(jù)。有研究表明[17]L.minor在液體培養(yǎng)基中生長速度快(生物量倍增時(shí)間為36h),蛋白質(zhì)含量高達(dá)其生物量干重的45%。2017年,Appenroth等[18]報(bào)道指出浮萍中的蛋白質(zhì)和氨基酸含量與世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦給人類的價(jià)值幾乎相同,證實(shí)浮萍也是一種潛在的蛋白質(zhì)來源[19]。此外,在光照條件為110 μmol/(m2·s)時(shí),Lemna aequinoctialis的最大淀粉產(chǎn)量為98.70 g/m2,說明浮萍是生產(chǎn)丁醇和乙醇等最有希望的替代能源之一[20—23]。所以,浮萍是一種極具應(yīng)用前景的小型水生被子植物,是一種適用于基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的新型生物材料。

隨著現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的成熟,研究遺傳多樣性的方法由最初的形態(tài)學(xué)水平發(fā)展到細(xì)胞水平,再進(jìn)一步發(fā)展到生物化學(xué)和分子生物學(xué)水平,利用分子生物學(xué)技術(shù)開展浮萍的研究也越來越多[24]。浮萍有5個(gè)屬37個(gè)種,其遺傳多樣性能夠影響其表型特征和其他生物性狀,從而導(dǎo)致浮萍對(duì)不同自然環(huán)境的適應(yīng)性不同[25]。遺傳多樣性是物種進(jìn)化潛能和適應(yīng)自然界生存壓力的重要遺傳學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)于不同地區(qū)的浮萍進(jìn)行種屬鑒定,分析其種質(zhì)資源的分布情況,發(fā)現(xiàn)不同水域、溫度和地形均對(duì)浮萍的多樣性有影響[26]。因此,對(duì)浮萍科植物進(jìn)行遺傳多樣性分析能對(duì)不同地區(qū)浮萍科植物的研究提供遺傳性依據(jù)。2009年,Martirosian等[27]對(duì)25份浮萍科植物種質(zhì)的rpS16內(nèi)含子序列分析表明,基于rpS16內(nèi)含子的遺傳距離分析支持將Landoltia punctata從紫萍屬分離出來單獨(dú)設(shè)立斑萍屬。隨后,Wang等[28]比較了CBOL (Consortium for the Barcode of Life)提出的7個(gè)質(zhì)體標(biāo)記對(duì)97份浮萍科31種植物的序列識(shí)別潛力,最后發(fā)現(xiàn)atpF-atpH間隔序列最能表現(xiàn)浮萍多樣性的特點(diǎn),建立了基于該序列多態(tài)性的浮萍分子鑒定方法。所以,atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列都可用于浮萍系統(tǒng)發(fā)育研究,且同時(shí)利用atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列共同鑒定浮萍科植物的種屬準(zhǔn)確性更高。因此,為了更準(zhǔn)確地區(qū)分貴州省浮萍科植物種間遺傳多樣性,需要同時(shí)利用atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子對(duì)浮萍不同株系進(jìn)行種屬鑒定[29]。

本研究在貴州省轄9個(gè)地級(jí)行政區(qū)的多處水環(huán)境中共采集到41份浮萍種質(zhì),利用葉綠體atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列進(jìn)行分子生物學(xué)分析,并對(duì)浮萍遺傳多樣性分析進(jìn)行初步性研究,討論并比較了中國亞熱帶濕潤季風(fēng)地區(qū)浮萍種群和遺傳多樣性的差異。對(duì)浮萍進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和遺傳多樣性分析無論是對(duì)浮萍多樣性的保護(hù),還是對(duì)浮萍物種的生物學(xué)理解和生物量生產(chǎn)應(yīng)用都有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料采集

貴州省地處中國西南內(nèi)陸地區(qū)腹地,跨長江和珠江兩大水系,界于北緯24°37′—29°13′,東經(jīng)103°36′—109°35′;貴州境內(nèi)地勢(shì)西高東低,海拔在157—2841 m,屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候,氣候溫和,雨量充沛,年平均日照1354h,年均溫度18℃左右,夏季平均氣溫24℃,年均降雨量1200 mm[30]。貴州省野生植物資源豐度很高,共計(jì)43科75屬126種[31]。浮萍作為一種適應(yīng)能力強(qiáng)的植物,在貴州省也廣泛分布,本研究在貴州省9個(gè)地級(jí)行政區(qū)采集到多種浮萍資源,共計(jì)41份 (圖1)。

圖1 貴州省浮萍種質(zhì)采集地點(diǎn)分布Fig.1 Distribution of duckweed germplasm collection sites in Guizhou Province

1.2 儀器藥品

試劑:NaClO、75%乙醇、MS培養(yǎng)基(Hopebio;青島)、頭孢霉素(Ameresco;USA)、Hoagland培養(yǎng)液、巰基乙醇(Aladdin;上海)、CTAB、核酸提取液(Acmec;上海)、異丙醇(Aladdin;上海)、Taq酶(TransTaqDNA Polymerase High Fidelity;北京)、瓊脂糖(Sigma-Aldrich;USA)。

儀器:體視顯微鏡(SMZ-171;Motic;廈門)、人工氣候培養(yǎng)箱(GXZ-80;Thermo;美國)、超凈臺(tái)(SW-CJ-1D;孚夏;浙江)、滅菌鍋(DR60DA;ZEALWAY;USA)、pH儀(pHS-3C;雷磁;上海)、通風(fēng)櫥、離心機(jī)(TG-16S;蜀科;四川)、T100 Thermal Cycler PCR儀(T100;Thermo;USA)、水平電泳儀(JY1600C;JUNYI;北京)、凝膠電泳成像儀 (biorad ChemiDoc MP;Bio-Rad;USA) 。

1.3 無菌株系的制備

將野外采集的浮萍材料編號(hào),純水中漂洗兩遍,采用5%的次氯酸鈉和75%的乙醇進(jìn)行外植體消毒處理并接種于添加50 mg/L頭孢霉素的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行保存,繼代周期為1個(gè)月,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供種質(zhì)資源材料。DNA提取前,從保存的培養(yǎng)皿上接種10—20片浮萍植株轉(zhuǎn)接至pH調(diào)至5.0—5.5,添加1.5%蔗糖后滅菌處理的Hoagland營養(yǎng)培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)[32],培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度5000 lx,溫度25℃,光照周期16h/8h(L/D),濕度75%,培養(yǎng)時(shí)間2周左右。

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

用體視顯微鏡對(duì)無菌培養(yǎng)的浮萍進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,通過根的數(shù)量、葉片的大小、顏色等形態(tài),粗略鑒定浮萍樣品的屬分類。在浮萍5屬中,泥萍屬(Wolffiella)未在國內(nèi)發(fā)現(xiàn),無根萍屬/蕪萍屬(Wolffia)體積較小,無根,呈微小顆粒狀,易與其他屬區(qū)分開,綠萍屬(Lemna)、紫萍屬(Spirodela)和斑萍屬/蘭氏萍屬(Landoltia)都有葉狀體和根,很少開花,常在葉狀體邊緣的側(cè)囊中形成子代葉狀體,子代葉狀體逐漸長大從側(cè)囊中浮出。根據(jù)葉片和根的形態(tài)觀察判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:正面背面均為綠色,葉片小,長倒卵形或橢圓形,表面積約1—25 mm2,表面中脈稍隆起,腹面扁平,由1—4片單一的葉狀體組成,每個(gè)葉狀體有1根細(xì)長的根,根鞘短,植物體開花時(shí),著生花器的2—3個(gè)葉狀體脫離母體浮出水面,屬于綠萍屬(Lemna);葉片表面積與綠萍屬相似,呈倒卵形,正面中央為綠色,葉脈5條以下,邊緣一圈紫色,背面為紫色,根較少的浮萍屬于斑萍屬/蘭氏萍屬(Landoltia);葉片較大,圓形或倒卵形,不對(duì)稱,葉狀體腹面凸起,表面積約1 cm2,葉脈5條以上,正面呈綠色,背面為紫色,根非常茂密且長,15—35 mm,根冠明顯,屬于紫萍屬(Spirodela)[33—35]。

1.5 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

使用CTAB法提取浮萍DNA,取0.1—0.5 g新鮮浮萍葉片與于1.5 mL離心管中,加入1 mL含有2 μL的2×CTAB,65℃水浴30min,期間不斷搖動(dòng),使之混勻;水浴后冷卻到室溫,加入等體積的核酸提取液,混勻,12000 r/min離心10min;取上清液重復(fù)上述動(dòng)作一次;取上清液于新的1.5 mL離心管,加入0.6倍體積冰浴的異丙醇,在-20 ℃冰箱放置30min后,12000 r/min,4 ℃離心10min;取上清液,在沉淀中加入1 mL 75%的乙醇,12000 r/min,4℃離心5min,吸去乙醇;在超凈臺(tái)吹干沉淀,加入30—50 μL ddH2O,溶解DNA,置于-20℃保存。

PCR擴(kuò)增浮萍的葉綠體atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列(引物見表 1)。反應(yīng)體系25 μL:2 μL的DNA 模板,0.25 μL 5 U/μL HiFi酶,2.5 μL 10×Trans TaqHiFi buffer,2 μL 2.5 mmol/L的dNTP,1 μL引物,17.25 μL的ddH2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95℃預(yù)熱變性5min,94℃變性30s,50℃降溫30s,72℃延伸45s,30個(gè)循環(huán),72℃延伸2min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),產(chǎn)物由擎科公司測(cè)序。

表1 atpF-atpH和rpS16序列擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for the amplification of atpF-atpH and rpS16

1.6 分子系統(tǒng)學(xué)及遺傳多樣性分析

在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中下載已知的37種浮萍物種的代表性序列,先用BioDeit軟件進(jìn)行序列比對(duì)和剪切,再分別采用atpF-atpH間隔序列與rpS16內(nèi)含子序列在Mega6.0軟件中構(gòu)建NJ(Neighbor-joining Tree)型系統(tǒng)發(fā)育樹,確定浮萍樣品的種屬分類,再將浮萍所有樣品序列比對(duì)結(jié)果輸入DNA SP6軟件,分析貴州省不同地區(qū)浮萍種質(zhì)資源的遺傳多樣性,包括單倍型數(shù)(H)、單倍型多態(tài)性指數(shù)(Hd)、核苷酸多態(tài)性指數(shù)(Pi)、群體突變率(θw)和平均每kb核苷酸差異數(shù)[36]。

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

通過肉眼及顯微鏡對(duì)浮萍葉狀體和根進(jìn)行觀察,鑒定貴州省采集的41份種質(zhì)中只有綠萍屬(Lemna)、紫萍屬(Spirodela)和斑萍屬/蘭氏萍屬(Landoltia)。其中綠萍屬居多,共33個(gè);其余有6個(gè)紫萍屬,2個(gè)斑萍屬(表2和圖 2)。貴陽市位于貴州省中部,水資源豐富,主要采集的浮萍為綠萍屬和斑萍屬,只有1株紫萍屬;安順市位于貴州中部偏西,只采到綠萍屬,沒有采到紫萍屬和斑萍屬;黔東南和黔北地區(qū)的遵義和銅仁市多有綠萍屬和紫萍屬,約70%為綠萍屬,黔西地區(qū)包括六盤水和畢節(jié)等市,主要采集到的是綠萍屬和斑萍屬,畢節(jié)市只采到綠萍屬,六盤水采到綠萍屬和斑萍屬。

圖2 浮萍代表性株系的形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Morphological observation of representative strains of Duckweed

表2 浮萍種質(zhì)的形態(tài)學(xué)鑒定Tab.2 Morphological identification of duckweed germplasm

2.2 葉綠體保守序列PCR擴(kuò)增

圖3是部分浮萍株系的atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列PCR擴(kuò)增結(jié)果。其41個(gè)種質(zhì)都成功擴(kuò)增出目的條帶,其中atpF-atpH間隔序列的長度為 687—708 bp,rpS16內(nèi)含子序列的長度為1020—1059 bp 。

圖3 部分浮萍種質(zhì)atpF-atpH間隔序列和rpS16間隔序列凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of atpF-atpH interval sequence and rpS16 interval sequence of some duckweed germplasm

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

利用浮萍葉綠體atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列進(jìn)行分子聚類分析,41份浮萍種質(zhì)聚類到4個(gè)種,分別是L.aequinoctialis、L.minor、Spirodela polyrhiza和Landoltia punctata。用兩種序列所得出的結(jié)果吻合,在屬間的分類與形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果一致。其中L.minor種質(zhì)數(shù)量最多,有29份,4份屬于L.aequinoctialis,6份屬于S.polyrhiza,2份屬于L.punctata(表3)。

利用atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列分別用BioDeit軟件比對(duì)后,用MAGE6軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。

從NCBI上下載了浮萍37個(gè)種的葉綠體atpF-atpH間隔序列,并按照全部序列中最短的序列進(jìn)行剪切,構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹親緣關(guān)系更準(zhǔn)確;同樣,在NCBI上下載25條浮萍rpS16內(nèi)含子序列,其中,綠萍有7個(gè)未找到,無根萍有1個(gè)未找到,蕪萍屬有4個(gè)未找到,本次在貴州省內(nèi)的樣品采集過程中沒有以上浮萍種,所以對(duì)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果的影響不大。

由發(fā)育樹圖 4a可看出,0168所代表的29份浮萍種質(zhì)由atpF-atpH間隔序列所構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育樹都與L.minor聚為一類,因此,這29份種質(zhì)為L.minor,0145、0080、0083和0180與L.aequinoctialis聚為一類,以0079為代表的6份種質(zhì)與S.polyrhiza聚為一類,0169、0174與L.punctata聚為一類;此結(jié)果與圖 4b相對(duì)比,聚類結(jié)果相同。將41份浮種質(zhì)分類進(jìn)行總結(jié)(表3)。

圖4 貴州41份浮萍種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 41 Duckweed germplasm in Guizhou Province

表3 貴州省41份浮萍種質(zhì)的分類Tab.3 Classification of 43 duckweed germplasm in Guizhou Province

2.4 遺傳多樣性分析

利用DNA SP6軟件分析貴州省浮萍種質(zhì)的遺傳多樣性。結(jié)果表明貴州省浮萍種質(zhì)的遺傳多樣性非常豐富,基于atpF-atpH和rpS16的單倍型指數(shù)分別為13和10,群體突變率分別為0.15380和0.14334,核苷酸多態(tài)性指數(shù)分別為0.08725和0.09158,每kb平均核苷酸差異數(shù)為47.20000和61.72200,單倍型多態(tài)性指數(shù)分別為0.98700和0.64700(表4)。

表4 貴州省浮萍遺傳多樣性分析Tab.4 Genetic diversity analysis of duckweed in Guizhou Province

不同屬間遺傳多樣性也存在差異,綠萍屬基于atpF-atpH的單倍型指數(shù)遠(yuǎn)大于rpS16序列的單倍型指數(shù),多根紫萍屬和少根紫萍屬單倍型數(shù)分別為5和1,綠萍屬平均每kb核苷酸差異數(shù)及核苷酸多態(tài)性指數(shù)最大,其次是紫萍屬;群體突變率也是綠萍屬最大,其次是紫萍屬,斑萍屬群體突變率及核苷酸多態(tài)性均最小(表5)。

表5 不同屬浮萍遺傳多樣性分析Tab.5 Genetic diversity analysis of duckweed in different genera

3 討論

3.1 貴州省浮萍種質(zhì)資源分布

貴州省分為黔中、黔西、黔北、黔東南等幾個(gè)地區(qū),黔中地區(qū)包括貴陽、安順等市,屬于以山地、丘陵為主的丘原盆地地區(qū),最高溫度平均在25—28℃[37],水資源豐富,綠萍屬分布較多;黔北地區(qū)的遵義和銅仁市多有綠萍屬和紫萍屬,遵義市處于云貴高原向湖南丘陵和四川盆地過渡的斜坡地帶,在云貴高原的東北部,地形起伏大[38],主要分布綠萍屬,銅仁市在遠(yuǎn)離河谷的山原面上,巖溶、丘陵、洼地較多,地面起伏不太大,主要分布綠萍屬和紫萍屬;黔東南山地縱橫,峰巒連綿,群山疊翠、林木蔥籠,森林資源豐富,年平均氣溫15℃左右,在黔東南地區(qū)只采集到綠萍屬;黔西地區(qū)包括六盤水、畢節(jié)等市,主要分布綠萍屬和斑萍屬,畢節(jié)市地處滇東高原向黔中山原丘陵過渡的傾斜地帶,平均溫度10—15℃[39],只采集到綠萍屬,六盤水市地處長江水系和珠江水系的分水嶺地區(qū),境內(nèi)10 km以上河流43條,水資源豐富,采集到綠萍屬和斑萍屬。因此可以看出,紫萍屬多在地勢(shì)起伏不大,溫度較高的地區(qū)有分布;斑萍屬在溫度為25℃左右、水資源豐富的地區(qū)分布較多,綠萍屬適應(yīng)能力更強(qiáng),溫度適應(yīng)域較寬,10—25℃均能生長,對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng),分布最廣;此外,貴州省屬于喀斯特地貌,全省地貌可概括分為高原、山地、丘陵和盆地四種基本類型,其中92.5%的面積為山地和丘陵,水域分布不均勻,由于某些人為原因(比如使用除草劑或人工清理等)使浮萍科植物生長的池塘、稻田等水域未采集到浮萍,雖然采樣地分布較集中,但是在貴州省9個(gè)地級(jí)行政區(qū)都進(jìn)行了采集,并且常見的綠萍屬、紫萍屬、斑萍屬都有采集到。因此,對(duì)研究浮萍科植物在貴州省的分布及遺傳多樣性分析均無較大影響。

3.2 貴州省浮萍種質(zhì)資源鑒定

經(jīng)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn),貴州省41份浮萍種質(zhì),經(jīng)過聚類分析得到3屬4種,分別是L.aequinoctialis、L.minor、S.polyrhiza和L.punctata,其中L.minor分布最多。浮萍科植物有5個(gè)屬37種,而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)除泥萍屬(Wolffiella)從未在國內(nèi)找到以外,中國浮萍科植物只有4屬[40]。在海南島收集到34個(gè)浮萍株系,經(jīng)過鑒定共有4屬4種,分別是Wolffia globosa、L.aequinoctialis、S.Polyrrhiza和L.punctata[41];太湖流域采集到3屬5種浮萍,分別為S.polyrrhiza、L.minor、Lemna turionifera、L.aequinoctialis和L.punctata[42];2018年,陳蕾等[43]在廣東和江蘇2省采集了63份浮萍樣品,結(jié)果為3屬4種,L.aequinoctialis、L.minor、S.polyrhiza和L.punctata,其中廣東采集的浮萍均為L.minor;江西省10個(gè)市29個(gè)縣(區(qū))采集到39份浮萍種質(zhì),經(jīng)過種屬鑒定,共有4屬5種,分別為L.minor、Lemna perpusilla、S.polyrrhiza、L.punctata和Wolffia arrhiza,L.minor最多共34株[44]。目前,中國長江中游的湖北、湖南,下游地區(qū)的江西一帶,包括東邊的浙江和福建,南邊的廣東,東北方向的江蘇及華南地區(qū)的海南等8個(gè)省份的浮萍種質(zhì)資源研究取得較大進(jìn)展。而貴州省位于中國西南喀斯特地區(qū)的中心區(qū)域,喀斯特地貌發(fā)育強(qiáng)烈,地形起伏大,濕潤溫暖,光照充足,多年年均降水量約為1142 mm,年均氣溫16℃[45,46],氣候及水資源均是浮萍科植物生長的良好環(huán)境,尚未有關(guān)于浮萍分布及遺傳多樣性的研究,因此,本實(shí)驗(yàn)采集了貴州省41份浮萍種質(zhì),經(jīng)過聚類分析得到3屬4種,其中L.minor是優(yōu)勢(shì)種,在亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候地區(qū),熱量豐富、雨量充沛、光照充足,非常適合浮萍科植物的生長,但是不同屬之間對(duì)水體環(huán)境的適應(yīng)能力不同,綠萍屬在不同水域中均有分布,而紫萍屬和斑萍屬多在地勢(shì)起伏不大、溫度較高、水資源豐富的地區(qū)分布,貴州省浮萍種質(zhì)資源豐富,并且積累了較多的遺傳多樣性。

3.3 貴州省浮萍遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,是地球上所有生物攜帶的遺傳信息的總和。已有研究發(fā)現(xiàn)atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列保守性很高,最能體現(xiàn)浮萍多樣性的特點(diǎn)[47],因此,本研究對(duì)貴州省41個(gè)浮萍樣品DNA 序列進(jìn)行遺傳多樣性分析,利用atpF-atpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列共同鑒定浮萍科植物的種屬準(zhǔn)確性更高,其中主要分析群體突變率(θw)、平均核苷酸差異數(shù)(kb)、單倍型多態(tài)性指數(shù)(Hd)和核苷酸多態(tài)性指數(shù)(Pi)。目前,國內(nèi)只有吉林省、長江中游湖南、湖北地區(qū)和福建地區(qū)對(duì)浮萍科植物遺傳多樣性進(jìn)行了研究[48],與典型亞熱帶季風(fēng)氣候地區(qū)對(duì)比,貴州省浮萍科植物的群體突變率均較大,綠萍屬和紫萍屬基于atpFatpH間隔序列和rpS16內(nèi)含子序列的每kb平均核苷酸差異數(shù)和核苷酸多態(tài)性指數(shù)均遠(yuǎn)大于湖南、湖北地區(qū),福建地區(qū)和典型溫帶季風(fēng)地區(qū)吉林省均未找到斑萍屬,貴州省綠萍屬和紫萍屬遺傳多樣性也均大于福建省和吉林省的浮萍科植物多樣性。由此可見:貴州省浮萍種質(zhì)存在豐富的遺傳多樣性?？λ固氐貐^(qū)亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候高溫多雨,全年溫潤,使浮萍科植物積累了較多的遺傳多樣性。因此貴州省浮萍科植物的遺傳多樣性豐富。

本研究以貴州省為代表對(duì)亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候喀斯特地區(qū)浮萍科植物進(jìn)行種屬鑒定和遺傳多樣性分析,比較了浮萍種間親緣關(guān)系及變異情況,為浮萍種屬鑒定和親緣關(guān)系分析提供依據(jù),有利于對(duì)亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候地區(qū)浮萍科植物的研究。