基于氣相離子遷移譜技術(shù)分析太和香椿的揮發(fā)性成分

楊松,郭家剛,伍玉菡,朱倩,杜京京,江艦*,丁之恩

1(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 安徽 合肥, 230031)2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園林學(xué)院, 安徽 合肥, 230036)3(亳州學(xué)院 生物與食品工程系, 安徽 亳州, 236800)

香椿[Toonasinensis(A.Juss.) Roem]為楝科香椿屬(Toona)樹種，是我國(guó)特有的珍貴多功能樹種。香椿在我國(guó)分布非常廣泛，從北到南均有其蹤跡，其種植中心區(qū)域?yàn)辄S河流域和長(zhǎng)江流域之間。香椿樹本身具有綠化功能，嫩芽可以作為蔬菜食用，樹皮、根皮、種子可入藥，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。安徽省太和縣種植香椿的歷史非常悠久，唐代時(shí)即被作為貢品，故太和縣生產(chǎn)的香椿又被稱為“貢椿”，2019年獲批國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品。目前，太和縣主要種植的香椿主要依據(jù)芽葉的顏色不同來區(qū)分，當(dāng)?shù)亓?xí)慣將芽葉顏色偏紫的稱為黑油椿[Toonasinensis(A.Juss.)Roem‘Heiyouchun’]、偏紅的稱為紅油椿[Toonasinensis(A.Juss.) Roem ‘Hongyouchun’]，偏綠的稱為青油椿[Toonasinensis(A.Juss.) Roem ‘Qingyouchun’]，其中以黑油椿風(fēng)味、口感最佳[3-4]。

近年來，隨著香椿產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，研究學(xué)者對(duì)香椿的研究也逐漸深入，主要集中在種質(zhì)資源分類、功能性成分提取、營(yíng)養(yǎng)特性和加工過程中特征風(fēng)味變化規(guī)律等方面。ZHAN等[5]采用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)29個(gè)中國(guó)香椿居群的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，并將29個(gè)居群劃分為2個(gè)遺傳譜系，為香椿的種質(zhì)資源保護(hù)和人工育種奠定了基礎(chǔ)。XU等[6]從香椿芽乙酸乙酯提取物中分離鑒定了8種黃酮類化合物，并考察了其抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，結(jié)果表明，香椿芽中的黃酮類化合物均具有顯著的抗氧化作用和α-葡萄糖苷酶抑制活性。ZHAI等[7]采用氣相色譜-嗅聞(gas chromatograph-olfactometry，GC-O) 技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)技術(shù)相結(jié)合的分析方法鑒定了香椿主要風(fēng)味物質(zhì)，并研究了不同干燥方式對(duì)不同顏色香椿風(fēng)味物質(zhì)的影響，結(jié)果表明，熱風(fēng)干燥的香椿的平均氣味活性值最低，真空冷凍干燥的平均氣味活性值最高，而太陽能干燥居中。然而，現(xiàn)有報(bào)道中對(duì)安徽特色香椿資源的品質(zhì)分析研究非常少見。因此，本研究分析安徽省太和縣主栽的3種香椿揮發(fā)性成分差異，以期為安徽特色香椿的快速鑒定、加工利用和品種定向選育提供理論依據(jù)。

氣相色譜離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)技術(shù)是一種新的食品揮發(fā)性成分分析手段，它將離子遷移譜技術(shù)和氣相色譜技術(shù)結(jié)合，相比GC-MS、GC-O等食品揮發(fā)性成分檢測(cè)技術(shù)，具備了高靈敏度和高分離度的雙重特性[8-9]。近幾年，隨著GC-IMS技術(shù)的日益成熟，研究學(xué)者將其應(yīng)用在食品揮發(fā)性成分分析方面的研究報(bào)道越來越多，主要有食品揮發(fā)性組成分析[10-11]、食品參偽檢測(cè)[12-14]、加工工藝對(duì)食品風(fēng)味的影響[15]等方面。目前，關(guān)于香椿中揮發(fā)性成分分析的研究主要采用GC-MS、GC-O等檢測(cè)技術(shù)[16-18]，而應(yīng)用GC-IMS技術(shù)對(duì)香椿揮發(fā)性成分進(jìn)行分析的研究尚未見報(bào)道。

本研究以太和縣主栽的3種香椿為研究對(duì)象，采用GC-IMS技術(shù)分析鑒定香椿樣品的揮發(fā)性物質(zhì)組成，對(duì)比3種香椿的揮發(fā)性成分差異，建立特征揮發(fā)性組分指紋圖譜，可為安徽特色香椿資源的開發(fā)利用和品種快速分類鑒定提供理論數(shù)據(jù)和有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用香椿原料采自太和縣苗圃場(chǎng)。3種香椿原料均按照代表性原則于4月初在香椿嫩芽剛萌發(fā)時(shí)采樣。采集后當(dāng)天，液氮速凍，并迅速轉(zhuǎn)移到-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。具體樣品編號(hào)信息見表1。

表1 香椿樣品編號(hào)信息表Table 1 Information of Toona sinensis samples

1.2 儀器與設(shè)備

ME204電子顯示天平，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；Flavour Spec?氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀配CTC PAL RSI自動(dòng)頂空進(jìn)樣器，德國(guó)G.A.S公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

香椿自然解凍后，切碎，待測(cè)。

1.3.2 GC-IMS條件

頂空進(jìn)樣條件：孵育溫度40 ℃；孵育時(shí)間10 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；進(jìn)樣針溫度85 ℃；進(jìn)樣量500 μL。

GC條件：色譜柱FS-SE-54-CB-1柱(15 m×0.53 mm,1 μm)；柱溫60 ℃；分析時(shí)間35 min；載氣：高純氮?dú)?純度≥99.999%)；流速：初始為2 mL/min，保持2 min，2～20 min線性增加至100 mL/min后，保持20 min。

IMS條件：漂移管溫度45 ℃；漂移氣：高純氮?dú)?純度≥99.999%)；漂移氣體流速150 mL/min；IMS檢測(cè)器溫度45 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用儀器配套的分析軟件(laboratory analytical viewer，LAV)和3款插件(Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA)對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。運(yùn)用LAV分析軟件查看分析樣品譜圖；運(yùn)用Reporter和Gallery Plot插件對(duì)比不同樣品譜圖差異和構(gòu)建指紋圖譜；運(yùn)用Dynamic PCA插件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)，獲得樣品分類圖。

運(yùn)用GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品中檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種香椿中揮發(fā)性成分氣相離子遷移譜圖對(duì)比

采用GC-IMS分析方法對(duì)3種不同類型的太和香椿中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果見圖1和圖2。圖1為運(yùn)用LAV軟件和Reporter插件分析獲得的香椿揮發(fā)性成分三維譜圖。圖1中，橫坐標(biāo)代表離子漂移時(shí)間，縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時(shí)間。圖1中的垂直線高度代表揮發(fā)性物質(zhì)峰值的強(qiáng)度，離子峰兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表一種物質(zhì)。峰的顏色代表每種揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量，顏色越深代表此種物質(zhì)在香椿中所有揮發(fā)性成分中的相對(duì)含量越高，反之則相對(duì)含量越低[19]。

圖2是將GC-IMS三維譜圖投影到二維平面的俯視圖，能夠直觀看出3種不同種類的太和香椿揮發(fā)性物質(zhì)的差異。由圖2可以看出，香椿中的揮發(fā)性物質(zhì)可以通過GC-IMS技術(shù)實(shí)現(xiàn)很好的分離，3種不同的太和香椿在GC-IMS特征譜信息上呈現(xiàn)了一定的差異(圖2中紅色框所示)，且同一種物質(zhì)的相對(duì)含量也出現(xiàn)了較明顯差異(圖2中黃色框所示)。孔宇等[16]采用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用法分析比較了不同種源色型香椿的揮發(fā)性物質(zhì)差異，發(fā)現(xiàn)不同色型的香椿中揮發(fā)性成分具有明顯差異。由此可以推測(cè)，本研究中的3種香椿在揮發(fā)性成分上存在差異可能是由于研究樣本屬于不同品種的香椿，其遺傳信息、代謝物合成途徑等內(nèi)在因素略有不同，導(dǎo)致3種香椿的揮發(fā)性物質(zhì)含量存在一定差異。

2.2 三種太和香椿中揮發(fā)性物質(zhì)定性分析

運(yùn)用GC-IMS Library Search軟件，根據(jù)氣相色譜保留時(shí)間和離子漂移時(shí)間，對(duì)香椿中檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定。使用6種正酮C4-C9作為外標(biāo)物質(zhì)，計(jì)算每種物質(zhì)的保留指數(shù)，再與軟件內(nèi)置NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)匹配，從而鑒定出樣品中揮發(fā)性物質(zhì)組成。在香椿樣品中共計(jì)檢測(cè)出揮發(fā)性物質(zhì)74種，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定出47種(單體和二聚體僅統(tǒng)計(jì)1次)，詳細(xì)物質(zhì)信息見表2。由表2可以看出，被鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)包括醛類7種、酯類5種、酮類5種、醇類11種、酸類4種、雜環(huán)類10種，呋喃類2種，醚類2種，萜烯類化合物1種。3種香椿的揮發(fā)性物質(zhì)中醇類化合物的相對(duì)含量最高，其次是雜環(huán)類和酯類。2-己烯醇在3種香椿中的相對(duì)含量均超過30%。2-己烯醇在自然界的植物中廣泛存在，具有濃郁的果香、蔬菜香和青草香。由此可以推測(cè)，3種太和香椿在風(fēng)味上更多表現(xiàn)為1種青香、酯香。這與張杰[20]結(jié)果基本一致。此外，3個(gè)香椿品種中共鑒定出7種含硫化合物，其相對(duì)含量分別為：黑油椿(11.9%)、紅油椿(13.22%)、青油椿(12.74%)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21]，這些化合物具有較低的氣味閾值，是香椿特殊風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)者。

圖1 三種香椿揮發(fā)性物質(zhì)三維氣相離子遷移譜圖Fig.1 GC-IMS 3D topographic of volatile compounds in three types of Toona sinensis

圖2 三種香椿揮發(fā)性物質(zhì)氣相離子遷移二維譜圖Fig.2 GC-IMS 2D topographic of volatile compounds in three types of Toona sinensis

2.3 三種太和香椿中揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜構(gòu)建

為了能夠直觀地比較樣品間揮發(fā)性化合物差異，利用設(shè)備自帶的LAV軟件中的GalleryPlot插件，生成3種太和香椿的揮發(fā)性化合物指紋圖譜(圖3)。圖中，橫軸為樣品中檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)，其中數(shù)字表示化合物未被鑒定出；縱軸為香椿樣品(每行為1個(gè)樣品的指紋圖譜，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù))；每個(gè)圓點(diǎn)代表一種揮發(fā)性物質(zhì)，點(diǎn)顏色的深淺和點(diǎn)面積代表物質(zhì)的相對(duì)含量，顏色越深、面積越大表示該物質(zhì)的含量越高[22]。

圖中B區(qū)紅色框標(biāo)注出的為黑油椿樣品中特征揮發(fā)性物質(zhì)，主要有1,2-丙二醇、2-乙基苯酚、1-辛烯-3-醇、苯甲酸甲酯、2-乙基呋喃、2-正戊基呋喃、3-羥基-2-丁酮、α-側(cè)柏烯等，這些物質(zhì)在黑油椿中的相對(duì)含量明顯高于其他2種香椿，尤其是α-側(cè)柏烯，其相對(duì)含量明顯高于青油椿和紅油椿樣品。圖中R區(qū)紅色框中標(biāo)出的是紅油椿樣品中特征揮發(fā)性成分，主要有丙烯醛、2-己烯醇、丙酸、己酸、2,5-二甲基噻吩、甲基乙基硫醚、糠基硫醇、四氫噻吩等，這些物質(zhì)在紅油椿中的相對(duì)含量明顯高于其他2種香椿。圖中G區(qū)紅色框標(biāo)出的是青油椿樣品中特征揮發(fā)性成分，主要有5-甲基糠醛、乙酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、1-辛烯-3-酮、5-甲基-2-呋喃甲醇、苯甲醇、乙酸、2-甲基噻吩、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、二乙二醇二甲醚等，這些物質(zhì)在青油椿中的相對(duì)含量明顯高于其他2種香椿。由圖3可以看出，3種香椿的揮發(fā)性組分相似度較高，其揮發(fā)性成分從物質(zhì)種類上看并無差異，但是某些組分在樣品中的相對(duì)含量存在較明顯的差異。這可能是由于3種香椿的遺傳背景、生長(zhǎng)條件和種植方式均存在較大的相似度造成的。趙麗麗等[23]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)地相同的香椿在風(fēng)味物質(zhì)組成上具有較高的相似度。

圖3 三種香椿揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of volatile organic compounds in three types of Toona sinensis

表2 三種香椿特征風(fēng)味物質(zhì)定性分析信息Table 2 Qualitative analysis of characteristic flavors in three types of Toona sinensis

2.4 三種香椿中揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析PCA

PCA是一種降維數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，通過對(duì)變量的高維數(shù)組進(jìn)行降維處理，在根據(jù)主成分因子在各樣品中的貢獻(xiàn)率來評(píng)價(jià)樣本之間的規(guī)律性和差異性，能夠更加直觀地看出樣品之間的差異[24]。本研究以3種香椿樣品的氣相離子遷移譜數(shù)據(jù)為變量，采用儀器自帶的Dynamic PCA插件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖4。圖4中，不同顏色的點(diǎn)代表不同種類的香椿樣品，顏色相同的點(diǎn)代表同一種香椿樣品。由圖4可以看出，第一主成分(PC1)貢獻(xiàn)率為58%，第二主成分(PC2)貢獻(xiàn)率為36%，PC1和PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率為94%，說明主成分分析的降維處理保留了各樣品揮發(fā)性物質(zhì)中的主要信息，分析結(jié)果有效[25]。由圖4還可以看出，相同種類的香椿樣品聚在一起，表示試驗(yàn)的重復(fù)性較好，而不同種類的香椿樣品間隔較遠(yuǎn)，且沒有重疊區(qū)域，說明采用GC-IMS技術(shù)結(jié)合主成分分析法能夠很好地從揮發(fā)性物質(zhì)組成上判別和區(qū)分3種太和香椿。

圖4 三種香椿主成分分析結(jié)果圖Fig.4 Principal component analysis results of three types of Toona sinensis

2.5 相似度分析

采用儀器自帶的LAV軟件對(duì)3種香椿樣品進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表3。由表3可知，同種香椿的重復(fù)樣品之間揮發(fā)性組分信息的相似度均在90%以上，3種不同種類的香椿其揮發(fā)性組分相似度也在70%以上。相似度最高的樣品是青油椿和紅油椿樣品，其平均相似度接近80%，相似度最低的樣品是青油椿和黑油椿，其平均相似度為72.75%。

表3 三種香椿揮發(fā)性成分的相似度評(píng)價(jià)Table 3 Similarity of volatile components in the three types of Toona sinensis

3 結(jié)論

本文采用GC-IMS技術(shù)分析了安徽省太和縣主栽的3種香椿中揮發(fā)性成分的差異，并且構(gòu)建了不同香椿特征風(fēng)味物質(zhì)的指紋圖譜。結(jié)果表明，采用GC-IMS技術(shù)分析香椿中揮發(fā)性成分，共計(jì)檢測(cè)出74種化合物，與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配后鑒定出化合物47種，主要包括醛類、酯類、酮類、醇類、酸類、雜環(huán)類、呋喃類、醚類、萜烯類化合物，其中醇類物質(zhì)最多。通過儀器自帶的GalleryPlot和Dynamic PCA插件構(gòu)建3種香椿揮發(fā)性成分特征指紋圖譜，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，可以直觀看出不同香椿揮發(fā)性成分的差異。本研究可為安徽特色香椿的品質(zhì)評(píng)價(jià)、種類區(qū)分和摻假鑒別提供一種快速、有效的手段，對(duì)香椿資源利用和定向育種具有較高的理論參考意義。