唐嘉誠,包建強,2,3*,陳彥婕,黃可承,宮萱,單錢藝
1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心,上海,201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海,201306)4(上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院,國家食品質量監(jiān)督檢驗中心,上海,200233)
糖蛋白是碳水化合物基團共價附于蛋白質上的一類結合蛋白,組成上以蛋白為主[1],而不同糖蛋白中,其糖所占比例差異較為明顯,占蛋白重量的2%~60%不等[2]。糖蛋白在自然界中來源廣泛,動物、植物以及微生物中都能提取到天然糖蛋白成分。由于有著特殊生物化學作用,例如抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞等,近年來對于糖蛋白的研究成為食品科學、免疫學、醫(yī)藥學、生物化學和細胞生物學的研究熱點。通過了解糖蛋白的提取純化方法及結構功能,對未來食品及藥物研發(fā)行業(yè)研究具有重要作用。本文對天然糖蛋白研究進行概述,分析了其提取和分離純化技術以及理化表征手段,為天然糖蛋白開發(fā)利用研究提供一定借鑒。
糖蛋白是指具有多分支的寡糖鏈(一般為15~20個單糖單元)與多肽鏈以共價鍵相連而成的復合物,其含量以蛋白為主[3]。糖蛋白在動物、植物和微生物中廣泛存在,是生命活動中一種重要大分子。
糖蛋白所含氨基酸種類較為全面,其中蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)、羥脯氨酸(Pro)、天門冬酰胺酸(Asn)這5種氨基酸的含量較高[4]。構成糖蛋白的單糖主要有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、N-乙酞葡萄糖胺以及糖醛酸等[5],不同種類的糖蛋白,其糖所占比例也有所不同。糖鏈的存在提高了糖蛋白的親水性,一般親水性較強的糖蛋白含有較高的硫酸化或唾液酸化的糖鏈,能夠提高糖蛋白的總電荷,增加糖蛋白的溶解度,如糖蛋白中的黏蛋白和蛋白聚糖[6]。通過糖鏈,糖蛋白能與其他蛋白質形成共價鍵和氫鍵相連起到結構支架的作用。糖蛋白中糖鏈和肽鏈主要有2種結合方式:N-鏈接,糖鏈和天冬酰胺基結合;O-鏈接,通過糖苷鍵,糖基和含羥基的Lys之間相結合或是糖基和Thr或Ser的羥基相連接[7],如圖1所示[8]。后者容易在堿性溶液中發(fā)生β-消除反應,易被堿溶液水解,根據(jù)這個特性可以初步判斷糖肽鍵類型。
A-O-糖肽鍵;B-N-糖肽鍵圖1 O-糖肽鍵和N-糖肽鍵[8]Fig.1 O-glycopeptide linkage and N-glycopeptide linkage
糖蛋白廣泛存在于自然界中。按照其提取來源可分為動物源糖蛋白、植物源糖蛋白和微生物源糖蛋白。其中植物和微生物中所提取的天然糖蛋白類型較為類似。糖蛋白在機體內(nèi)承擔著重要的功能,如結構、轉運、酶促反應等,并且具有廣泛的用途,如表1所示。
表1 糖蛋白來源及分類Table 1 Resources and types of glycoprotein
不同來源的糖蛋白中氨基酸組分都較為全面,一般含有全部的氨基酸種類;組成糖鏈的單糖通常只有11種。糖蛋白其結構種類多樣,形成了其不同的特性及類別。
從動物原料中提取的糖蛋白主要類型為膠原蛋白以及黏蛋白:膠原蛋白種類繁多、來源廣泛,主要由3種特殊的左手螺旋多肽鏈結構構成,其中膠原蛋白長鏈中每3個氨基酸是甘氨酸占主要部分,鏈中剩余位點由脯氨酸和羥脯氨酸填充,其中羥賴氨酸殘基能夠是糖類結合位點,易形成糖基化結構。膠原蛋白因其肽鏈上多種反應基團和低抗原性,易于結合多種酶和細胞,能夠制備成多種產(chǎn)品,有廣闊的應用前景;黏蛋白是構成生物黏液凝膠結構的一類大分子,其主要結構特征為中心區(qū)域含有較多的蘇氨酸或絲氨酸,寡糖側鏈通過O-糖肽鍵與絲氨酸或蘇氨酸相連,而糖類占黏蛋白總分子質量50%以上,故黏蛋白含有重度O-糖肽鍵結構,因而具有較好的水溶性,可作為化妝品保濕劑和用于干眼癥的治療。
植物及微生物中主要提取糖蛋白主要類型為凝集素及伸展蛋白,相比于動物糖蛋白,植物及微生物源糖蛋白其羥脯氨酸殘基含量有較大變化,從而影響了其糖蛋白結構構型,容易形成如凝集素中特殊的結合位點[18]:凝集素主要從植物中提取,因其含有能夠識別復雜碳水化合物結構的結構域,能夠與特異性糖基可逆結合,故常用作分離純化多糖和糖蛋白,目前應用最多的是豆科凝集素,根據(jù)糖結合結構域種類分為4種不同凝集素類別;伸展蛋白富含羥脯氨酸,存在于植物細胞壁中,是一種重要的結構蛋白,對植物中抗病,抗逆作用起到重要作用。
糖蛋白是1種結合蛋白,因其同時具有糖類以及蛋白質的某些性質,根據(jù)這類性質來確定提取方法。大部分溶劑如水、稀酸、稀堿和酶解溶液都能良好溶解糖蛋白,可以根據(jù)需求以及溶劑種類和濃度等來確定提取糖蛋白的方法。而為了提高提取效率,在糖蛋白提取過程中,常用超聲輔助或微波輔助的方法,利于糖蛋白的溶出,在糖蛋白的提取過程中,要避免過酸、過堿、高溫和機械作用等不利因素影響最終糖蛋白的生物活性。
根據(jù)糖蛋白的性質,常用的提取方法有水浸提法、酸堿提取法、鹽溶液浸提法、酶解提取法和乙醇浸提法,而有些時候也采用混合的提取方式,以獲得更高的提取效率。而根據(jù)不同物料的性質,其提取方式也有所改變。不同的提取方法,影響提取率高低的因素不同,為了有更高的提取率,常用正交試驗法或是響應面試驗法去優(yōu)化提取工藝,得出一種較優(yōu)方案,以期達到更好的提取目的。常用的提取方法如表2所示。
表2 糖蛋白提取方法Table 2 The method of glycoprotein extraction
糖蛋白中的糖鏈為多羥基結構,易溶于水,而含有高度O-糖肽鍵結構的糖蛋白在水中溶解程度更高,因此水提取法是最為普遍的提取方法之一,不同物料來源用水浸提時效果略有差異。水浸提法相比于其他方法更為經(jīng)濟,實驗材料易得,污染少并且工藝較為簡單,其氨基酸及單糖組分、理化性質如流變性等幾乎不受影響。提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比,通常是水浸提法較為常見的考察指標以及優(yōu)化條件。水浸提法常見應用于植物糖蛋白的提取過程中,為了有更好的提取效果,常輔以超聲等實驗條件,并結合多次提取。ZHOU等[20]采用水提醇沉法提取苦蕎糖蛋白,在450 W超聲輔助提取條件下,經(jīng)后續(xù)除雜,凍干得到粗糖蛋白,得率為2.31%。
糖蛋白中蛋白為兩性電解質,用偏離糖蛋白等電點的提取溶劑提取,根據(jù)糖蛋白的酸堿性質選擇提取溶液,酸性蛋白采用偏堿性的溶液提取,堿性蛋白采用偏酸性溶液提取。并且酸堿溶液能夠破壞糖蛋白分子中存在的分子內(nèi)氫鍵和共價鍵,更易于溶出提取,如具有三螺旋結構的膠原蛋白在酸堿作用下轉變?yōu)榭扇苄缘穆菪Y構,而酸處理會將一些谷氨酰胺和天冬酰胺分別轉化為谷氨酸和天冬氨酸[29],一般酸堿法適用于提取含有較多共價交聯(lián)的復雜糖蛋白,如生物黏液等。徐偉良[30]分別采用酸、堿、水、酶法提取大鯢黏液糖蛋白,結果證明堿法提取得率最高,達到3.85%。在用酸堿法提取時,要注意酸堿對于糖蛋白活性的影響,避免糖蛋白發(fā)生不可逆變性。
鹽溶液和緩沖溶中的離子能夠與糖蛋白部分結合,穩(wěn)定性高、溶解度大,一定濃度的鹽溶液可促進糖蛋白溶解。與水浸提法相比,鹽和緩沖溶液浸提法提取效果更好,也能極大程度保證糖蛋白的生物活性,適用于一些易變性的糖蛋白提取。常用的提取液為氯化鈉溶液、磷酸鹽緩沖溶液和三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液。但是在后續(xù)提純前需要進行脫鹽處理,常用的方式是經(jīng)透析袋透析或是凝膠柱層析脫鹽操作。
酶是一種對底物具有高度特異性和高度催化效能的一類生物大分子。酶解法能夠使不溶性糖蛋白分解成為可溶性的糖肽、肽和氨基酸,有較高的提取效率以及較少的污染。酶能夠特異性降解糖蛋白中一些特異性的肽鍵,有較高的得率。提取糖蛋白所采用的酶會影響所提取糖蛋白的性質,降解糖蛋白中結構,影響其理化性質,如分子質量等[31]。由于其專一性和高度選擇性,能夠一定程度上避免雜質的引入。但是采用酶解法提取糖蛋白時,需要考慮所使用酶的種類,以及提取溫度、pH對于酶活性的影響,所需要考慮的交互作用較多,前期需要對不同的酶進行篩選,實驗操作較為復雜,后續(xù)需要滅酶操作等。目前對于酶解提取糖蛋白的報道較少。
一般為了提高糖蛋白的提取效率,常輔以其他設備進行共同輔助提取,常見的是超聲輔助提取以及微波輔助提取,兩者均可提高糖蛋白的提取效率,超聲波所產(chǎn)生的空穴作用有助于其溶出過程,同樣在提取過程中需要考慮超聲及微波設備設定指標,如頻率和功率等。王芳等[32]采用超聲輔助提取覆盆子糖蛋白,相比單一使用熱水浸提法,其糖蛋白得率提高了2.733個百分點。
少數(shù)糖蛋白具有醇溶性可以采用乙醇浸提法進行提取,但是采用乙醇浸提法所花費的試劑量大,提取周期長、成本較高,一般適合用于提取特定的醇溶性蛋白,通常不單一使用乙醇浸提的方法對糖蛋白進行提取,通常輔以其他方法,如水浸提、鹽溶液浸提等方法。KRISHNAN等[33]研究美洲可食用塊莖,采用硫酸銨沉淀,并用70%乙醇萃取,后經(jīng)過親和色譜純化得到了29 kDa大小的糖蛋白。方旭波等[34]采用85%乙醇浸提白骨壤,結合100 ℃熱水浸提法,經(jīng)純化,脫色后得到了具有一定抗補體活性的白色纖維狀糖蛋白。
得到純品糖蛋白是后續(xù)進行理化研究的重要前提,糖蛋白的純化指的是通過去除雜質獲得單一成分的過程。糖蛋白的分離純化過程與蛋白、多糖純化過程類似,首先是經(jīng)過初步純化,除去粗提物中游離蛋白以及小分子雜質,再經(jīng)后續(xù)分級純化,能夠得到較純的糖蛋白單品。
常用的去除游離蛋白質的方法是Sevage試劑法,在提取液中加入氯仿-正丁醇混合液經(jīng)過劇烈振蕩,將游離蛋白變?yōu)椴蝗苄晕镔|除去[35]。Sevage試劑法較為溫和,對多糖結構影響不大,在糖蛋白提取實驗中最為常見,而根據(jù)不同研究對象,所使用的Sevage溶液中氯仿-正丁醇比例需要進行相應調整,并且反應時間以及除雜次數(shù)同樣需要實驗所驗證。
常用透析法除去小分子雜質,也有學者采用超濾的方式提純糖蛋白。而采用(NH4)2SO4分級沉淀得到糖蛋白,通過獲取不同飽和度下的糖蛋白沉淀,同樣也可以達到初步純化的效果。
經(jīng)初步除雜的糖蛋白需要經(jīng)過進一步分級純化,常用的方法是色譜柱分離技術,如陰離子交換色譜柱、凝膠柱色譜柱、親和色譜柱和高效液相色譜等。而實驗中經(jīng)常采用多種方法進行分離純化,具體見表3。
表3 糖蛋白純化方法Table 3 The method of Glycoprotein purification
3.2.1 陰離子交換柱層析
應用最為廣泛的陰離子交換柱層析填料為二乙基氨基纖維素,利用生物大分子所帶電荷不同,根據(jù)與離子交換劑結合能力的不同達到分離效果[41]。為了既保證蛋白質生物大分子的活性,又要保證樣品與填料有適中的結合能力,一般使得溶液pH值與蛋白質等電點應相差一個單位,有較好的分離效果,常用的填料類別有DEAE-纖維素、DEAE-葡萄糖凝膠、DEAE-瓊脂糖凝膠。
為了完全分離與填料相結合的復雜組分,通常需要改變?nèi)芤簆H值或是離子強度。實際實驗過程中,常改變離子強度,即鹽溶液的濃度,其操作方便并且能夠極大程度上保證蛋白質的活性。常用的洗脫方式是用NaCl溶液或是NaHCO3溶液進行等濃度梯度洗脫和連續(xù)梯度洗脫,根據(jù)填料所帶不同離子型而確定洗脫液類型,其中連續(xù)梯度洗脫有著更精細的分離度,所得產(chǎn)品有較好的生物活性。QIN等[42]采用DEAE 瓊脂糖凝膠(DEAE Sepharose)陰離子交換柱對粗豌豆糖蛋白進行純化,采用NaCl梯度洗脫液進行洗脫,3個峰形較好的洗脫峰,結合后續(xù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜證明,其3種不同的糖蛋白組分為單一條帶,證明陰離子交換柱層析有較好分離度。SONG等[38]以白玉蝸牛黏液為研究對象,經(jīng)前處理后,于DEAE Sepharose FF 陰離子交換柱上進行梯度洗脫,得到3個分離尖峰,后續(xù)實驗證明1 mg/mL純化黏液糖蛋白對DPPH自由基清除率達到13.77%,并且具有顯著地促進傷口愈合活性。
3.2.2 凝膠柱層析
經(jīng)陰離子交換柱層析所得到的樣品,其分子質量可能具有一定的差異性,凝膠柱層析法是根據(jù)目標分子質量大小的不同而達到分離的目的,在對未知糖鏈結構的糖蛋白進行分離純化時,2種層析法共同使用可達到較高的區(qū)分度。大分子不能進入凝膠顆粒中,而小分子能夠自由進入凝膠顆粒,需要花費更長時間流經(jīng)柱床,故凝膠柱層析又名排阻色譜。常用的洗脫劑為無鹽水,通過一定的流速控制,達到進一步分離不同大小糖蛋白的目的。而為了避免凝膠對于糖蛋白少量的吸附,可以使用適量的鹽溶液對其洗脫,則有更好的洗脫效果。劉豪[36]通過交聯(lián)葡聚糖凝膠G-100(Sephadex G-100)進一步純化大鯢黏液糖蛋白,得到2個較好分離度的尖峰,經(jīng)苯酚硫酸法驗證后,得到目標糖蛋白,結合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳證明得到了單一大鯢黏液糖蛋白純品。
3.2.3 親和柱層析
生物大分子具有生物學特異性,即為專一性親和力,利用單糖和寡糖能夠與凝集素可逆結合的原理來分離純化糖蛋白。含有糖基的生物大分子:糖蛋白、酶、多糖和抗原等能夠與凝集素產(chǎn)生親和吸附,而不能與凝集素產(chǎn)生特異結合的物質會隨著洗脫液流出,后續(xù)再用含有某種甲基糖苷或是某種糖的緩沖液洗脫特異吸附的目標物質[43]。在已知提取目標糖蛋白含有特定的糖鏈結構時,采用親和柱層析分離效果較好,區(qū)分度高。不同的凝集素所能結合的糖鏈結構有所不同,例如,刀豆凝集素可結合二天線(無平分型N-乙酰氨基葡萄糖基)、高甘露糖型、雜合型糖鏈;麥胚凝集素可結合平分型N-乙酰氨基葡萄糖基、唾液酸;花生凝集素可結合N-乙酰半乳糖胺基Gal β1-3 GalNAc等。王艷等[40]采用刀豆凝集素A親和層析法,分離純化玉竹糖蛋白,結合HPLC分析,得到2組不同尖峰,證明親和層析分離度優(yōu)良。而隨著對不同種類糖蛋白糖鏈結構的深入了解,根據(jù)其活性位點的不同,更多的方法,如酰肼法、硼酸親和層析法、免疫法等也有一定的應用。
結構決定物質的性質。對于糖蛋白理化表征,常用的方法有氣相色譜、差示掃描量熱分析、紅外吸收光譜、顯色反應、凝膠電泳、薄層層析、氨基酸分析、全波長紫外掃描、單糖組成分析、糖肽鍵的測定、等電點測定等。不同結構以及單糖和氨基酸組成以及排列順序都會影響其生物活性。而通過一系列的檢測能夠解釋糖蛋白獨特生理活性,為糖蛋白的研究提供有力論據(jù)。
常用的糖蛋白純度鑒定方法有凝膠層析法、親和層析法、高壓電泳法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、超速離心法和旋光法等。一般來說對于糖蛋白純度的鑒定需要采用2種以上的方法。
薛張芝等[23]采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對墨魚纏卵腺糖蛋白純度進行鑒定,采用考馬斯亮藍染色法以及糖原染色法對其染色,由于糖蛋白本身所具有的糖與蛋白的性質,會對2種不同的染色方法產(chǎn)生表征反應,2塊不同的染色膠上相近位置只有1條染色條帶,并且兩者位置相同,證明純化物是糖蛋白,達到電泳純。田庚元等[44]通過高效液相色譜法鑒定枸杞子糖蛋白純度得到單一對稱峰,并且采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,以蛋白質和糖原2種染色方法對2種膠塊進行染色,得到了位置相近的單一條帶,由此證明所提取的糖蛋白為單一純品。LI等[45]分離純化了灰鼬肉水解產(chǎn)物中的糖蛋白成分,經(jīng)柱層析純化和HPLC檢測,為單一對稱峰,結果表明得到了糖蛋白純品。
作為一種結合蛋白,不同糖蛋白中單糖與氨基酸的組成與含量都會影響其生物活性,所以分析糖蛋白的單糖與氨基酸組成是探索糖蛋白的重要步驟,如一些氨基酸排序以及構成與其氧化性有密切關系。
糖蛋白中單糖組分常見的分析方法有氣相色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法和紙層析法。LI等[46]對油茶糖蛋白用H2SO4在氮氣條件下進行水解,衍生化后采用GC對樣品進行分析,來檢測其中的單糖的組成,同時采用氨基酸自動分析儀檢測檢測油茶糖蛋白中的氨基酸成分結果證明其主要含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖三種單糖;谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸3種氨基酸。一些糖蛋白中含有人體必需氨基酸以及藥用氨基酸,后續(xù)的加工工藝中可以考慮應用于產(chǎn)品的開發(fā)研究。
糖蛋白中糖肽鍵為2種:O-型糖肽鍵和N-型糖肽鍵,前者對堿不穩(wěn)定,在NaOH溶液中易發(fā)生β-消除反應,糖肽鍵上的絲氨酸和蘇氨酸由于堿的作用下被轉化成α-氨基丙烯酸和α-丁基丙烯酸,這兩者會在240 nm吸光度處產(chǎn)生明顯的紫外吸收[47]。通常對于糖蛋白樣品溶于NaOH溶液中進行反應,以溶于水的樣品作為對照,進行全波長紫外掃描,通過判斷對照240 nm處吸光度的變化對糖蛋白中糖肽鍵類別進行初步判斷。
糖蛋白中單糖的組成、環(huán)狀構象、不同單糖之間的連接位置、鏈接順序等對糖鏈組成結構有影響[48]。通常采用直接分析,即芯片法或是糖鏈釋放的方法對糖鏈結構進行分析。芯片法通過凝集素對糖蛋白進行一定的化學修飾所采用的方法,通過凝集素與糖蛋白特異性結合進行分析。糖鏈釋放是通過化學或者酶法特異性切割糖蛋白,得到完整的糖鏈結構,能夠更完整地得到糖鏈地信息如單糖的組成、分支、鏈接方式等。
目前通過紅外吸收光譜和核磁共振波譜法能夠了解糖苷鍵的位置、糖殘基、糖苷鍵類型等。廉亞楠等[49]對甘草硒糖蛋白進行紅外光譜分析,結果表明其在1 000~1 200 cm-1處存在C—O鍵的吸收峰,表明糖蛋白中含有吡喃環(huán)。ZHANG等[50]提取鏈霉菌中的糖蛋白,進行核磁共振波譜法分析。其1H譜圖像證明,鏈霉菌糖蛋白中含有苯丙氨酸殘基和鼠李糖殘基甲基而13C譜圖像則表明其含有D-(1,6)連接的糖苷殘基。
作為一種結合型蛋白,糖蛋白有著蛋白與多糖2種物質的特點,具有多種生物活性功能,例如抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抗菌作用,免疫調節(jié)功能以及細胞間相互識別的作用等,這些作用取決于自身蛋白以及寡糖鏈的結構以及組成,相互協(xié)同作用共同構成了糖蛋白的獨特生理活性。
人體在生命活動中會產(chǎn)生自由基,它能夠破壞人體組織,導致許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)展,自由基累積到一定程度還會誘發(fā)細胞癌變,破壞周圍正常細胞。所以開發(fā)一種能夠去除人體內(nèi)自由基、具有抗氧化和抗衰老功效的物質具有重大的意義,尤其是天然的抗氧化物更是研究熱點。有許多的研究表明,糖蛋白具有抗氧化、清除自由基以及活性氧的功效,這些功效與糖蛋白中蛋白與糖的組成,以及糖蛋白的結構密不可分。
裙帶菜糖蛋白[51]具有清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的能力,并且呈現(xiàn)出一定的劑量與pH的相關性,這些活性可能與糖蛋白的結構多樣性有關。張金豫等[52]通過水提醇沉法提取,并且經(jīng)過純化得到大鯢黏液糖蛋白能夠起到對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除作用。從海馬中分離純化得到的2組糖蛋白HG-11與HG-21對DPPH自由基均有一定的清除能力[53],而由于疏水性氨基酸以及芳香族氨基酸含量的差異,HG-21的抗氧化性強于HG-11。
細菌廣泛地存在于自然界之中,一些細菌能夠與人共存且不會引起疾病。但是有些細菌卻是致病甚至是致命的,例如鏈球菌或是葡萄球菌,可能會引起肺炎和腦膜炎等疾病。近年來,人們對具有抗生素抗性的細菌關注不斷上升,而考慮到化學抗菌劑的有害作用,近年對于具有天然抗菌能力的產(chǎn)品研究日趨增長,并用于健康以及食品工業(yè)方面。其中糖蛋白具有廣泛的結構多樣性,在生物學中起到重要的作用,能夠作為抗菌、抗病毒或是抗真菌劑。
ABDEL-SHAFI等[54]通過硫酸銨沉淀法提取并純化非洲鯰魚的黏液糖蛋白(mucous glycoprotein,CFG),對9種病原菌進行抗菌實驗,結果證明其最低抑菌濃度為50 μg/mL,并且CFG對9種致病菌的生長有抑制作用,尤其是大腸桿菌和傷寒沙門氏菌在30 h 的生長內(nèi)能夠起到完全抑制作用,當CFG與抗生素聯(lián)合使用時有顯著的協(xié)同抗菌作用。陳淑敏等[55]提取純化曼氏無針烏賊纏卵腺糖蛋白,以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為研究對象,采用牛津杯法測定其抑菌效果,結果表明曼氏無針烏賊纏卵腺糖蛋白抗菌活性優(yōu)于同濃度的山梨酸鉀,對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果顯著。表明天然糖蛋白能夠應用于某些食品應用和保存過程中,能夠減少化學抗生素的用量,具有一定的實用前景。
腫瘤是人體某部位由于某種外因或內(nèi)因誘發(fā)導致細胞異常形成的局部腫塊,經(jīng)常出現(xiàn)在炎癥結束的過程之中,成為對人類健康的重大威脅。近幾年的藥理實驗證明,天然提取的糖蛋白可以通過作用于免疫調節(jié)機制增強巨噬細胞吞噬能力、凋亡蛋白等達到有效預防腫瘤和抗腫瘤的目的。
從甘薯中分離的糖蛋白SPG-8700能夠通過線粒體途徑誘導細胞,亡并且顯著抑制無胸腺裸鼠中HCT116腫瘤細胞的生長[56],減少腫瘤48%的體積,同時伴隨凋亡蛋白Bax的劑量依賴性上升和抗凋亡細胞Bcl-2的下降;ELENA等[57]分離純化擔子菌菌絲體中的糖蛋白能夠抑制人與動物癌細胞系如:A549S、HeLa、Hep-2、SPEV-2和C6,對其產(chǎn)生細胞毒性,而擔子菌菌絲體中高活性凝集素能顯著抑制細胞系的代謝活性。從油茶中分離純化的COG2a糖蛋白[58]能夠有效誘導HepG2細胞的凋亡,激活caspase-3和Bax的促凋亡基因,提高小鼠胸腺和胰腺指數(shù)、淋巴細胞數(shù)、白細胞數(shù)、CD4/CD8比值和干擾素-γ指數(shù),增強免疫功能。
糖蛋白還能夠起到調節(jié)免疫活性、降血糖和降血脂的作用等的潛力。而機體有良好的免疫功能是保持身體健康的重要前提條件,能夠抵御病原的危害。
甘薯糖蛋白具有加強巨噬細胞吞噬作用的功能,并且能夠顯著降低患有高血脂癥大鼠體內(nèi)血清膽固醇以及甘油三酯的含量,顯著提高高密度脂蛋白并且降低低密度脂蛋白的含量[59]。張琳等[60]采用水提醇沉法和硫酸銨分級沉淀法提取南瓜糖蛋白,建立嘧啶型糖尿病小鼠模型,通過監(jiān)測血糖值發(fā)現(xiàn),高劑量南瓜糖蛋白能夠達到33.75%的降糖率,對小白鼠體重和血糖有顯著影響。任國艷等[61]從海蜇中分離純化出1種新型糖蛋白(JGP-III2),通過建立免疫底下小鼠模型,進行免疫活性機理研究,結果表明JGP-III2能夠顯著提高免疫低下小鼠脾臟指數(shù)、巨噬細胞吞噬能力等指標,促進免疫低下小鼠淋巴細胞Th1類細胞因子mRNA表達,抑制Th2類細胞因子mRNA表達,整體提高細胞免疫活性。
近年來,人們對于健康問題愈發(fā)重視,諸如一些含有“抗氧化”“天然抗菌”等標簽的保健品頗受青睞,而人們同時看重這些保健品所含的成分是否“天然”。隨著科學研究的進一步深入,天然糖蛋白的各種生理功能也被不斷發(fā)掘,在食品科學、免疫學、醫(yī)藥學、生物化學和細胞生物學多領域能夠得到更多的應用。如前文所述,一些糖蛋白具有抗氧化、抗癌細胞增殖的活性作用。我國動植物資源豐富,能夠從中提取大量天然糖蛋白,甚至是從一些如大鯢黏液、貝殼內(nèi)臟等加工時所丟棄的材料中提取富含生物活性的糖蛋白,能夠提高產(chǎn)品加工過程中的附加價值。
對于糖蛋白的研究也存在著一些問題,例如糖蛋白的富集純化過程復雜,難以適應工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn),不同的糖蛋白其性質也略有差異,故需要優(yōu)化糖蛋白的提取工藝,以期能達到最高得率。如前文中提到,富集純化的過程需經(jīng)過層層提取、篩選,在這些過程中保證糖蛋白的生物活性同樣也是亟待解決的問題。目前對于糖蛋白的研究很大程度上停留在對于目標產(chǎn)物的提取純化方面,結構、功能甚至是一些臨床應用方面也較少,諸如抗氧化、抗癌和細胞實驗大部分停留在體外實驗的過程,對于建立人體模型還鮮有報道。
其次天然糖蛋白具有多種生物活性,其特殊的生物活性與糖蛋白的結構緊密相關,未來對于糖蛋白的研究可以從糖蛋白的生物活性與其構效關系方面進行研究,如:糖基化修飾位點、糖鏈結構、單糖與氨基酸組成排列、糖苷鍵等相關性分析。目前對于糖蛋白結構以及生理活性的研究存在不足,需要進一步深入。
雖然對于糖蛋白的研究還有諸多的困難和問題,但無疑對于糖蛋白的研究仍具有廣闊前景。通過研究不僅能夠探索更多具有生物活性的物質,還能夠提高一些“下腳料”的附加產(chǎn)值,為一些藥品和食品的開發(fā)提供新思路。