慢性肝病患者中小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)的研究

黃夢(mèng)雪，陳 剛，王 鵬，曹世國(guó)，許建明，梅 俏，洪汝濤，張衛(wèi)平

肝硬化是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，它是各種慢性肝病發(fā)展的終末階段，以肝臟彌漫性纖維化、假小葉形成為特征[1]。近年來研究[2-3]表明肝纖維化的發(fā)生以及肝硬化發(fā)病與腸道菌群失調(diào)有著密切關(guān)系。腸道菌群是指在小腸內(nèi)各種細(xì)菌的統(tǒng)稱，它在宿主的消化、代謝、免疫等功能中發(fā)揮重要作用。小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)(small intestinal bacterial overgrowth，SIBO)是指小腸菌群的密度增加和組成類型的改變[4]。該研究旨在通過乳果糖氫呼氣試驗(yàn)(lactulose hydrogen breath test，LHBT)的方法初步檢測(cè)SIBO在慢性肝炎肝硬化(chronic hepatitis fibrosis，CHF)以及肝硬化患者中的發(fā)生率，并通過檢測(cè)炎癥因子及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平及其與LHBT集值的相關(guān)分析來揭示可能參與的SIBO發(fā)生的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018年9月—2019年9月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的CHF患者和肝硬化患者，其診斷基于病史、臨床癥狀和體征、生化病理學(xué)檢查和影像學(xué)檢查。

排除標(biāo)準(zhǔn)包括：① 入院前4周內(nèi)使用抗生素或益生菌； ② 入院前2周內(nèi)服用促動(dòng)力藥； ③ 2周內(nèi)急性上消化道出血； ④ 4周內(nèi)結(jié)腸鏡檢查和灌腸；⑤ 患有嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病或其他可能影響胃腸動(dòng)力疾??； ⑥ 胃腸切除術(shù)既往史(不包括闌尾切除術(shù))。經(jīng)過篩查，共有38例CHF患者和60例肝硬化患者符合入組標(biāo)準(zhǔn)。另選擇31例健康對(duì)照組：年齡與以上兩組相近；無明確的消化道疾病既往史；無呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病等；無長(zhǎng)期服用藥物史；近1年內(nèi)無大量吸煙史、飲酒史。

1.2 主要試劑與儀器乳果糖口服溶液(商品名杜密克)購(gòu)自美國(guó)雅培制藥有限公司，LPS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，IL-6、TNF-α、IL-10、DAO、CAT、SOD、GSH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，Sunvou-P200型納庫(kù)侖呼氣分析儀購(gòu)自無錫尚沃醫(yī)療公司。

1.3 LHBT實(shí)驗(yàn)LHBT按照羅馬會(huì)議共識(shí)建議的標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行。要求受試者實(shí)驗(yàn)前24 h內(nèi)避免食用高產(chǎn)氫的食物，并注意避免過飽；空腹至少12 h；測(cè)試開始前避免劇烈運(yùn)動(dòng)，以減少對(duì)腸蠕動(dòng)和肺通氣的影響。研究選用無錫尚沃醫(yī)療公司研發(fā)的Sunvou-P200型納庫(kù)侖呼氣分析儀，該儀器可同時(shí)檢測(cè)呼氣中的氫氣和甲烷的濃度。呼氣樣本中的氫氣、甲烷濃度以 ppm(百萬分之一)表示。首先使用標(biāo)準(zhǔn)氣體進(jìn)行校準(zhǔn)，測(cè)試基礎(chǔ)呼氣中氫氣、甲烷濃度后囑患者快速服下乳果糖溶液10 g，30 min后測(cè)量1次,持續(xù)3 h，記錄各時(shí)間點(diǎn)氫氣和甲烷的濃度數(shù)值，并將測(cè)得的氫氣濃度相加計(jì)作LHBT集值[6]。

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考北美共識(shí)會(huì)議[7]結(jié)論現(xiàn)擬定以下診斷標(biāo)準(zhǔn)： ① 基礎(chǔ)呼氣中氫氣濃度≥20 ppm或甲烷≥10 ppm，且每隔 30 min復(fù)測(cè)，氫氣濃度均≥20 ppm或甲烷濃度≥10 ppm; ② 服用乳果糖后，出現(xiàn)典型的氫氣雙峰圖形(小腸峰和結(jié)腸峰)，第1個(gè)峰起始點(diǎn)在 90 min 之前出現(xiàn)，較空腹值至少升高12 ppm。符合上述二者之一的即為SIBO陽(yáng)性，反之則為SIBO陰性。

1. 5 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)采集受試者空腹靜脈血2 ml，靜置 30 min 后分離出血清(4 ℃、1 200 r/min，5 min)，置于-80 ℃冰箱保存。血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書執(zhí)行。

2 結(jié)果

2.1 一般資料共納入對(duì)照組共31例，CHF組38例，肝硬化患者60例。3組受試者性別、年齡以及BMI間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 對(duì)照組、CHF組和肝硬化組資料的比較

2.2 對(duì)照組、CHF組和肝硬化組SIBO發(fā)病率的比較肝硬化組SIBO率高于CHF組，兩組均高于對(duì)照組的SIBO陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.785，P<0.01)。受試者SIBO陽(yáng)性者和陰性者在性別、年齡、BMI、門靜脈血栓、白蛋白上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而SIBO陽(yáng)性組的腹水發(fā)生率高于SIBO陰性組，CTP分級(jí)中B/C級(jí)SIBO的發(fā)生率高于A級(jí)中SIBO的發(fā)生率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、3。

表2 對(duì)照組、CHF組和肝硬化組SIBO陽(yáng)性率

表3 SIBO陽(yáng)性組和陰性組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

2.3 血清炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較對(duì)肝硬化SIBO陽(yáng)性組和陰性組受試者血清中內(nèi)毒素(LPS)和IL-6、IL-10、TNF-α進(jìn)行比較，結(jié)果顯示SIBO陽(yáng)性組血清中TNF-α和IL-10的水平與陰性組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LPS和IL-6水平前者高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

在所檢測(cè)的氧化應(yīng)激指標(biāo)方面，SIBO陽(yáng)性組血清中的GSH濃度與陰性組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而血清中DAO、SOD、CAT濃度則高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 血清炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

2.4 LHBT集值與炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性分析將患者的LHBT集值與LPS、TNF-α、IL-6及IL-10作相關(guān)分析，結(jié)果表明患者LHBT集值與LPS和IL-6呈正相關(guān)(P<0.05)，與TNF-α及IL-10無明顯相關(guān)(P>0.05)。將患者的LHBT集值與氧化應(yīng)激指標(biāo)DAO、SOD、GSH及CAT作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示LHBT集值與DAO、SOD、CAT呈正相關(guān)(P<0.05)，與GSH無明顯相關(guān)(P>0.05)。見表5。

表5 LHBT集值與炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

目前全球約有20億人感染HBV，預(yù)計(jì)其中10%～20%終將轉(zhuǎn)化為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康[8]。當(dāng)肝臟病變乃至肝硬化時(shí)，患者腸道蠕動(dòng)減慢、胃內(nèi)pH升高、膽汁酸分泌減少等會(huì)導(dǎo)致SIBO及菌群易位。LHBT是一種無創(chuàng)的診斷 SIBO 的方法，通過檢測(cè)結(jié)腸內(nèi)菌群對(duì)碳水化合物酵解產(chǎn)生并隨呼吸排出(腸道內(nèi)產(chǎn)生的氫氣約14%～20%由肺排出)的氫氣濃度初步判斷腸道內(nèi)菌群的狀態(tài)(此外約有30%成人腸道內(nèi)含有產(chǎn)甲烷菌，可消耗氫氣生成甲烷，因此同時(shí)檢測(cè)呼氣中的氫氣和甲烷能提高SIBO的檢出率[9])。國(guó)外文獻(xiàn)[10]報(bào)道基于以小腸抽吸液菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果為參照，LHBT的敏感性可達(dá)86%，特異性可達(dá)78%～100%，說明其檢測(cè)結(jié)果與既往的“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測(cè)結(jié)果基本一致。正常情況下，乳果糖后被結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌分解產(chǎn)生氫氣，若此時(shí)進(jìn)行LHBT會(huì)出現(xiàn)氫呼氣單峰；而存在SIBO時(shí)呼氣中氫濃度提前升高或出現(xiàn)雙峰圖形(表明底物在小腸內(nèi)被提前酵解)。

該研究結(jié)果顯示肝硬化組SIBO的發(fā)生率高于CHF組，均高于對(duì)照組。另外肝硬化SIBO陽(yáng)性組肝硬化病變嚴(yán)重程度及腹水的發(fā)生率高于陰性組(P<0.05)，這與Pande et al[11]的研究結(jié)果相似。此外，Pande et al[11]的研究表明血清膽紅素水平≥2 mg/dl且合并腹水的肝硬化患者患SIBO的概率達(dá)82%，而此兩者均不存在的肝硬化患者發(fā)生SIBO的概率僅為10%。這表明此兩項(xiàng)指標(biāo)在氫呼氣試驗(yàn)以及不能進(jìn)行空腸抽吸的情況下對(duì)于預(yù)測(cè)SIBO的存在有一定的幫助。

該研究結(jié)果顯示SIBO陽(yáng)性組患者血漿中的內(nèi)毒素、IL-6水平高于SIBO陰性組，而IL-10、TNF-α在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清中內(nèi)毒素升高可導(dǎo)致肝細(xì)胞對(duì)K+的通透性增高 , 使線粒體腫脹進(jìn)而導(dǎo)致ATP生成受阻，引起肝細(xì)胞腫脹壞死。Toll 樣受體(TLR)是一種重要的模式識(shí)別受體，通過識(shí)別多種細(xì)菌、病毒等的相關(guān)結(jié)構(gòu)成分來激活免疫反應(yīng)。其中TLR4作為L(zhǎng)PS的天然配體，當(dāng)血清中LPS升高時(shí)結(jié)合CD14作用于固有免疫細(xì)胞表面的TLR4，經(jīng) MyD88依賴性信號(hào)途徑和 MyD88非依賴性信號(hào)途徑，刺激引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成各種促炎癥介質(zhì)如 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等增多[12]，對(duì)肝臟造成進(jìn)一步的損害。此外細(xì)菌DNA介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化會(huì)導(dǎo)致TNF-α、IL-6和IL-12的合成，后兩種細(xì)胞因子能激活B細(xì)胞以及T細(xì)胞并通過自然殺傷細(xì)胞的激活來調(diào)節(jié)IFN-γ的產(chǎn)生。由于IFN-γ受體也在巨噬細(xì)胞表面表達(dá)，IFN-γ水平的增加進(jìn)一步促進(jìn)了TNF-α的產(chǎn)生，并上調(diào)了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞一氧化氮(NO)合成能力的增加[13]。NO的增高使胃腸道及血管平滑肌膜電位超極化，致使胃腸平滑肌的松弛及局部淤血的發(fā)生，從而導(dǎo)致腸蠕動(dòng)的減慢，增加腸道細(xì)菌及毒素的吸收，進(jìn)一步加重肝硬化患者肝功能的損害從而形成惡性循環(huán)[14]。

DAO是廣泛存在于小腸黏膜上層絨毛細(xì)胞中高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶。生理?xiàng)l件下,血液中 DAO含量很低，腸道被損傷后腸道絨毛上皮細(xì)胞將其釋放并進(jìn)入血液循環(huán),血液中DAO含量與腸黏膜損傷程度呈正相關(guān)[15]。因此，SIBO陽(yáng)性患者體內(nèi)DAO濃度升高佐證了腸道菌群的增加損傷腸黏膜使其通透性增加。CAT、SOD等是體內(nèi)主要的抗氧化酶，在消除ROS的過程中起重要作用。CAT活性的增加可以抵御氧化應(yīng)激對(duì)紅細(xì)胞膜的有害影響，而SOD和CAT活性的增高可能是抑制脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致自由基擴(kuò)增的一種保護(hù)機(jī)制。