脂肪酶Rhizopus chinensis催化水解大豆粉末磷脂制備L-α-甘油磷脂酰乙醇胺

李 紅，李子怡，張麗霞，張康逸，申瑞玲，魏 濤

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450000; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，鄭州 450002)

L-α-甘油磷脂酰乙醇胺(L-α-GPE)是生物膜主要組分腦磷脂(PE)、磷脂酰膽堿等的前體物質(zhì)[1-2]，主要存在于豬、兔、牛等動(dòng)物的肝、脾、腎和腦中[3-4]，在磷脂的生物合成和乙醇胺的釋放中起重要作用。已有研究證明，L-α-GPE對(duì)治療老年性腦病變、退化性和腦瓣膜功能不全等病癥(如精神活動(dòng)減慢、記憶力減退、情緒低落等)具有一定療效[5-7]，這促使人們探索其作為醫(yī)藥和食品添加劑的可行性。

目前，L-α-GPE主要通過從生物組織器官中提取[8]、水解縮醛磷脂[9]、化學(xué)合成[10]和醇解蛋黃磷脂或大豆粉末磷脂[11]等方法制備。然而，使用這些方法制得的L-α-GPE在產(chǎn)品純度、比旋光度和環(huán)境污染等方面都存在一定問題。如：從生物組織器官中提取受原料的限制，難以工業(yè)化生產(chǎn)；縮醛磷脂在水解過程中由于使用一定配比的醋酸、鹽酸和氯化汞作為酸性催化劑會(huì)引起設(shè)備腐蝕和重金屬污染問題[9]；醇解蛋黃磷脂或大豆粉末磷脂的L-α-GPE得率、純度相對(duì)較低。脂肪酶催化水解磷脂制備L-α-GPE具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、設(shè)備要求不高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)，備受關(guān)注。本課題組曾以脂肪酶Thermo4S-3為催化劑，研究了水相體系中水解大豆粉末磷脂制備L-α-GPE，得率達(dá)93.6%[12]。脂肪酶Rhizopuschinensis(三酰甘油酰水解酶，E.C.3.1.1.3)作為催化劑，在結(jié)構(gòu)脂的制備中得到廣泛應(yīng)用[13]。然而，脂肪酶Rhizopuschinensis水解大豆粉末磷脂制備L-α-GPE的研究未見報(bào)道?；诖?，本文采用脂肪酶Rhizopuschinensis催化水解大豆粉末磷脂制備L-α-GPE，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了脂肪酶Rhizopuschinensis催化制備L-α-GPE的工藝條件，并對(duì)其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以期為工業(yè)制備L-α-GPE提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆粉末磷脂(食品級(jí)，磷脂含量96%，主要成分為15%磷脂酰膽堿、20%磷脂酰乙醇胺、20%磷脂酰肌醇、5%磷脂酸)，天津博帥工業(yè)貿(mào)易有限公司；PE和L-α-GPE標(biāo)準(zhǔn)品、色譜級(jí)氯仿和甲醇，Sigma公司；脂肪酶Rhizopuschinensis(酶活力9 000 U/g)，江南大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；離子交換樹脂，蘇青集團(tuán)；柱層析用硅膠〔0.075～0.150 mm(100～200目)，含水量3%〕，青島海陽化工有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，JJ-1B 強(qiáng)力恒速電力攪拌器，HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，AR2140 電子精密天平，Waters 1525 HPLC，Waters 2424 ELSD 檢測(cè)器，470 Nicolet ATR-FTIR傅里葉變換衰減全反射紅外光譜儀，Waters Synapt Q-TOF超高效液相色譜電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酶Rhizopuschinensis催化水解大豆粉末磷脂制備L-α-GPE

稱取一定量大豆粉末磷脂于50 mL 三頸圓底燒瓶，加入10 mL一定pH的磷酸鹽緩沖溶液，在一定溫度、450 r/min轉(zhuǎn)速下磁力攪拌20 min制成大豆粉末磷脂溶液，再添加一定量的無水CaCl2和脂肪酶Rhizopuschinensis進(jìn)行水解反應(yīng)15 h。反應(yīng)完成后，水解液于80℃下真空濃縮后得到濃縮液。將濃縮液溶于相同體積氯仿-甲醇(體積比2∶1)溶液中，10 000 r/min 離心5 min，取上清液測(cè)定L-α-GPE純度，并參照文獻(xiàn)[12]計(jì)算L-α-GPE得率。

1.2.2L-α-GPE純度的測(cè)定

采用HPLC-ELSD測(cè)定L-α-GPE的純度。HPLC-ELSD 條件：Lichrospher Si column硅膠柱(25 cm×0.46 cm, 5 μm) ，柱溫 35℃；進(jìn)樣量5 μL；流速 0.97 mL /min；采用二元梯度洗脫，流動(dòng)相 A為甲醇，流動(dòng)相 B 為甲醇-水(體積比8∶1);梯度洗脫程序?yàn)?～10 min 40%B增加到60%B，10～15 min 60%B，15～18 min 60%B降低到40%B。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.3.1 紅外光譜分析

參照文獻(xiàn)[14]方法對(duì)按1.2.1方法得到的濃縮液進(jìn)行分離純化后，采用傅里葉變換紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

傅里葉變換紅外光譜分析條件:樣品經(jīng)KBr壓片，波數(shù)范圍250～4 000 cm-1。

1.2.3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

將1.2.3.1得到的純化的L-α-GPE用色譜純甲醇溶解后進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析。

UPLC條件：ACQUITY UPLC BEH HILIC分析柱(2.1 mm×100 mm，填料粒徑1.7 μm)，柱溫35℃；流動(dòng)相A為100%乙腈，流動(dòng)相B為20 mmol/L醋酸氨，流速0.3 mL/min，等度洗脫。

MS條件：Waters Synapt Q-TOF系統(tǒng)，電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式，離子源溫度120℃，毛細(xì)管電壓3 000 V，錐孔電壓30 V，錐孔氣流量50 L/h，霧化器溫度420℃，霧化氣流量500 L/h，質(zhì)量掃描范圍(m/z) 50～1 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 pH 對(duì)L-α-GPE得率的影響

酶的穩(wěn)定性是決定反應(yīng)得率的重要因素，而pH顯著影響酶的穩(wěn)定性，因此不同pH會(huì)對(duì)酶催化水解反應(yīng)產(chǎn)生較大影響。在大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度10 mg/mL、反應(yīng)溫度55℃、CaCl2質(zhì)量濃度3.33 mg/mL(在體系中的終質(zhì)量濃度，下同)和Rhizopuschinensis濃度63.3 U/mL(在體系中的終濃度，下同)條件下，反應(yīng)15 h，測(cè)定不同pH下L-α-GPE得率，結(jié)果見圖1。

圖1 pH對(duì)L-α-GPE得率的影響

由圖1 可看出：隨著pH的升高，L-α-GPE得率逐漸升高；在pH為7時(shí)，L-α-GPE得率最高，這可能與脂肪酶Rhizopuschinensis在此pH下活性最高，其活性部位易與PE結(jié)合[15]，易于L-α-GPE的生成有關(guān)；繼續(xù)升高pH，L-α-GPE得率降低。因此，選擇最適pH為7。

2.1.2 大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度對(duì)L-α-GPE得率的影響

在pH 為7，大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度分別為2.5、3.75、5、7.5、10、15、30 mg/mL，反應(yīng)溫度為55℃，CaCl2質(zhì)量濃度為3.33 mg/mL和Rhizopuschinensis濃度為63.3 U/mL條件下，反應(yīng)15 h，測(cè)定不同大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度下L-α-GPE得率，結(jié)果見圖2。

圖2 大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度對(duì)L-α-GPE得率的影響

由圖2 可看出，在大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度低于5 mg/mL時(shí)，L-α-GPE得率較高，在大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度高于5 mg/mL時(shí)，L-α-GPE得率隨大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度增大顯著降低。磷脂結(jié)構(gòu)中的親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)使其在水中的溶解度很低，只能以膠束形式存在；濃度較低時(shí)，磷脂以單分子或小聚集體的形式分散于緩沖溶液中，磷脂液滴的界面面積較大，易與酶結(jié)合而被水解；然而，當(dāng)磷脂濃度超過臨界膠束濃度時(shí)，磷脂分子逐漸聚集，界面面積減小，磷脂的水解速率降低[16]。圖2顯示大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度超過5 mg/mL時(shí)，L-α-GPE得率出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)折，推測(cè)該濃度可能接近磷脂的臨界濃度，因此選擇大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)L-α-GPE得率的影響

在pH為7、大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度為5 mg/mL、CaCl2質(zhì)量濃度為3.33 mg/mL和Rhizopuschinensis濃度為63.3 U/mL條件下，反應(yīng)15 h，測(cè)定不同反應(yīng)溫度下L-α-GPE得率，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)L-α-GPE得率的影響

由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，L-α-GPE得率增加，45℃時(shí)L-α-GPE得率達(dá)到最大值，繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，L-α-GPE得率反而下降，這可能與溫度升高會(huì)引起酶構(gòu)象和穩(wěn)定性發(fā)生變化有關(guān)[17]。因此，選擇最適反應(yīng)溫度為45℃。

2.1.4 CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)L-α-GPE得率的影響

在pH為7、大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度為5 mg/mL、反應(yīng)溫度為45℃、Rhizopuschinensis濃度為63.3 U/mL條件下，反應(yīng)15 h，測(cè)定不同CaCl2質(zhì)量濃度(0.33、0.67、2.00、3.33、5.33、6.67 mg/mL)下L-α-GPE得率，結(jié)果見圖4。

圖4 CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)L-α-GPE得率的影響

脂肪酶Rhizopuschinensis的活性部位通常被包裹在螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部，Ca2+能與酶發(fā)生配位作用，使酶的C端螺旋結(jié)構(gòu)伸展[18]，從而可以提高脂肪酶Rhizopuschinensis的催化活性，因此CaCl2濃度會(huì)對(duì)L-α-GPE得率產(chǎn)生一定的影響。

由圖4可看出，CaCl2質(zhì)量濃度由0.33 mg/mL增大到2 mg/mL時(shí)，L-α-GPE得率顯著增加，繼續(xù)增加CaCl2的質(zhì)量濃度，L-α-GPE得率趨于平穩(wěn)，可能因?yàn)镃aCl2質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)即與酶完全配位，因此選擇CaCl2質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

2.1.5 酶濃度對(duì)L-α-GPE得率的影響

在pH 為7、大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度為5 mg/mL、反應(yīng)溫度為45℃、CaCl2質(zhì)量濃度為2 mg/mL條件下，反應(yīng)15 h，測(cè)定不同Rhizopuschinensis濃度下L-α-GPE得率，結(jié)果見圖5。

圖5 酶濃度對(duì)L-α-GPE得率的影響

由圖5可看出，脂肪酶Rhizopuschinensis在0～30 U/mL濃度范圍內(nèi)，L-α-GPE得率增加，繼續(xù)增加酶濃度，L-α-GPE得率基本保持不變。酶濃度升高，酶的活性中心增加，底物與活性中心結(jié)合的概率增大，酶反應(yīng)速度越快；但酶的活性中心相對(duì)于底物接近飽和時(shí)，繼續(xù)增加酶濃度，產(chǎn)物得率基本不變。因此，選擇最適酶濃度為30 U/mL。

2.1.6 最優(yōu)條件驗(yàn)證

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了脂肪酶Rhizopuschinensis催化水解大豆粉末磷脂制備L-α-GPE的最佳工藝條件為pH 7、大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度5 mg/mL、反應(yīng)溫度45℃、CaCl2質(zhì)量濃度2 mg/mL、酶濃度30 U/mL，在此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，L-α-GPE得率分別為94.5%、93.3%和93.7%，平均為93.8%。與脂肪酶Thermo4S-3催化水解大豆粉末磷脂相比[12]，脂肪酶Rhizopuschinensis需要反應(yīng)更長(zhǎng)時(shí)間(反應(yīng)15 h)才能達(dá)到與Thermo4S-3(反應(yīng)6 h)相當(dāng)?shù)腖-α-GPE得率，說明在大豆粉末磷脂水解反應(yīng)中，脂肪酶Rhizopuschinensis催化活性不如Thermo4S-3高。

2.2 L-α-GPE的純度

經(jīng)分離純化后的L-α-GPE為淺黃色黏稠狀液體，經(jīng)HPLC-ELSD分析，其純度為99.2%。

2.3 L-α-GPE的結(jié)構(gòu)表征

脂肪酶Rhizopuschinensis催化制備的L-α-GPE的紅外光譜及質(zhì)譜圖分別見圖6、圖7。

圖6 L-α-GPE的紅外光譜圖

圖7 L-α-GPE的質(zhì)譜圖

由圖7可看出，m/z216和431分別為L(zhǎng)-α-GPE的[MH]+和[2m+H]+分子離子峰。

綜上，說明產(chǎn)品為L(zhǎng)-α-GPE。

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了脂肪酶Rhizopuschinensis催化大豆粉末磷脂水解制備L-α-GPE的最佳反應(yīng)條件為：pH 7，大豆粉末磷脂質(zhì)量濃度5 mg/mL，CaCl2質(zhì)量濃度2 mg/mL，酶濃度30 U/mL，反應(yīng)溫度45℃。在最佳條件下反應(yīng)15 h，制備的L-α-GPE得率為93.8%，經(jīng)分離純化產(chǎn)品純度為99.2%。