麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物的體外抗氧化活性

王 鈺，周一萍，湯運(yùn)嘉，余莉莉，牛麗亞

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330000)

麻瘋樹為大戟科，屬半肉質(zhì)小喬木或大灌木，主要分布于廣東、廣西、云南、貴州等省區(qū)[1]。麻瘋樹種子主要含有脂肪、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，其中：籽仁中含油量約為50%，可作為理想的生物柴油原料[2]；籽殼中含有較高的多糖及黃酮類物質(zhì)[3]。此外，麻瘋樹種子中含有毒素，主要為毒蛋白和佛波酯[3]。研究發(fā)現(xiàn)，麻瘋樹種子不僅具有清熱解毒、消腫散淤等作用，還具有顯著的抗癌活性，在工業(yè)用油、新藥開發(fā)、生物病蟲害防治等方面的潛在應(yīng)用價(jià)值很大[4]。傳統(tǒng)應(yīng)用是將麻瘋樹種子的籽殼用作燃料、籽仁用來制油，此方法附加值低，經(jīng)濟(jì)效益差，不僅造成資源浪費(fèi)，還會污染環(huán)境。目前為止，有關(guān)麻瘋樹種子的生物活性研究仍較少。

本文通過測定麻瘋樹種子(籽仁、籽殼)乙醇提取物體外對自由基(DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基和超氧自由基)的清除能力，以及其還原能力和抑制亞油酸自氧化能力，分析麻瘋樹種子乙醇提取物的抗氧化效果，為麻瘋樹種子乙醇提取物的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供理論參考，同時(shí)為多途徑開發(fā)利用麻瘋樹種子提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

麻瘋樹種子，購自江蘇啟尚種業(yè)。

無水乙醇、硫酸亞鐵，西隴科學(xué)股份有限公司；水楊酸、鄰苯三酚、三氯化鐵、硫氰酸銨、氯化亞鐵、過氧化氫、磷酸鹽緩沖液，天津市大茂化學(xué)試劑廠；維生素E(VE)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.7%)、亞油酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris-HCl緩沖液、ABTS試劑、鐵氰化鉀、DPPH試劑，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；AR2440型電子天平，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；V-5600型可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；DD5型臺式大容量離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；HH - 4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；Thermo Vanquish UHPLC超高效液相色譜儀、Thermo Q Exactive Plus軌道離子阱高分辨質(zhì)譜儀，賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)，廣東固特超聲股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

取1.5 kg麻瘋樹種子，將其籽仁和籽殼進(jìn)行分離，并丟棄腐爛物及其他雜質(zhì)，然后用干凈的袋子將籽仁、籽殼分別打包，密封保存。

1.2.2 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物的制備

麻瘋樹籽仁/殼→浸提(料液比1∶5，75%乙醇，均質(zhì)轉(zhuǎn)速90 r/min，50℃提取48 h)→抽濾→旋蒸(70℃水浴，轉(zhuǎn)速90 r/min)→麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物→密封保存。

1.2.3 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物成分測定

采用液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分析。將10 g麻瘋樹籽仁乙醇提取物以20%甲醇溶液稀釋10倍后過0.22 μm 有機(jī)系濾膜后上機(jī)分析。取1.0 g麻瘋樹籽殼乙醇提取物，加入20%甲醇溶液30 mL，超聲萃取30 min后定容至50 mL，離心取上清液過0.22 μm有機(jī)系濾膜后上機(jī)分析。

液相色譜條件：Hypersil Gold Vanquish 色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.9 μm)；流速 0.30 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液。質(zhì)譜條件：HESI離子源，電離電壓3.8 kV(+)/3.5 kV(+)，鞘氣流量15 L/min，輔助氣流量5 L/min，離子傳輸管溫度300℃，汽化溫度 300℃，采集模式 FULL MASS/DD-MS2(TOPN)。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測定

參考李珊珊等[5]的方法加以改動(dòng)。將DPPH溶于無水乙醇配成0.004%溶液避光放置備用。取1 mL不同質(zhì)量濃度(1、2、3、4 mg/mL)的樣品溶液于試管中，分別加入4.0 mL 0.004% DPPH 無水乙醇溶液，混合搖勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，用無水乙醇調(diào)零，在517 nm下測吸光度(A1)。用無水乙醇替代DPPH無水乙醇溶液與1 mL樣品溶液混合均勻后，在517 nm處測吸光度(A2)。用無水乙醇溶液替代樣品溶液與4.0 mL DPPH無水乙醇溶液混合均勻后，在517 nm處測吸光度(A3)。每組平行測定3次，結(jié)果取平均值。VE作陽性對照。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率(Y1)。

Y1=[1-(A1-A2)/A3]×100%

(1)

1.2.5 ABTS+自由基清除能力的測定

參考那吉等[6]的方法并略作修改。取0.8 mL ABTS+工作液于試管中，分別加入質(zhì)量濃度為1、2、3、4 mg/mL的樣品溶液各0.2 mL，振搖10 s以充分混勻。靜置反應(yīng)6 min，于734 nm處測定吸光度(A)。以0.2 mL 95%乙醇溶液代替樣品溶液測定吸光度(A0)。VE作陽性對照。每組平行測定3次，結(jié)果取平均值。按下式計(jì)算ABTS+自由基清除率(Y2)。

Y2= (A0-A)/A0×100%

(2)

1.2.6 羥自由基清除能力的測定

參考岳超穎等[7]的方法并略作修改。分別取2 mL 質(zhì)量濃度為1、2、3、4 mg/mL的樣品溶液于試管中，再分別依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液和6 mmol/L水楊酸溶液各2 mL，混勻，于37℃水浴中反應(yīng)30 min，以5 000 r/min下離心5 min，取上清液，用蒸餾水調(diào)零，在510 nm處測定吸光度(A)。同等條件用蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度(A0)，用蒸餾水代替H2O2溶液測定吸光度(A1)。VE作陽性對照。每組平行測定3次,結(jié)果取平均值。按下式計(jì)算羥自由基清除率(Y3)。

Y3=[1-(A-A1)/A0]×100%

(3)

1.2.7 超氧自由基清除能力的測定

參考曹菲菲等[8]的方法并略作修改。取4.5 mL50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液，加入2.0 mL蒸餾水，混合均勻后于37℃水浴加熱20 min，加入2.0 mL不同質(zhì)量濃度(1、2、3、4 mg/mL)的樣品溶液，再加入37℃已預(yù)熱好的0.5 mL 25 mmol/L鄰苯三酚，混合均勻后于37℃水浴6 min，立即滴加1 mL 10 mmol/L的鹽酸終止反應(yīng)，在325 nm下測定其吸光度(A)。用0.5 mL蒸餾水代替鄰苯三酚作為本底對照，測定吸光度(A1)；用2.0 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，測定吸光度(A0)。VE作陽性對照。每組平行測定3次,結(jié)果取平均值。按下式計(jì)算超氧自由基清除率(Y4)。

Y4=[1-(A-A1)/A0]×100%

(4)

1.2.8 還原能力的測定

參考陳英等[9]的方法。取2.0 mL不同質(zhì)量濃度(1、2、3、4 mg/mL)的樣品溶液，加入2.5 mL0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后于50℃水浴中反應(yīng)20 min，快速冷卻后加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混合均勻后以4 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液、2.5 mL蒸餾水，在常溫下反應(yīng)5 min，700 nm處測定其吸光度(A)。用蒸餾水調(diào)零，各組平行測定3次，取平均值。VE作陽性對照。

1.2.9 亞油酸自氧化抑制能力的測定

參考宋家樂等[10]的方法并略作修改。分別取2 mL質(zhì)量濃度為1、2、3、4 mg/mL的樣品溶液于試管中，加入2 mL 2.5%的亞油酸溶液、4 mL0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液和2 mL蒸餾水。將試管用硅膠塞密封，混合均勻后于40℃恒溫避光反應(yīng)1周。取0.5 mL反應(yīng)后的上清液于試管中，加入3.5 mL 75%乙醇、0.5 mL 30%的硫氰酸銨和0.5 mL 0.02 mol/L的FeCl2溶液，混合均勻并反應(yīng)3 min，在500 nm下測定吸光度(A)。同等條件下用2 mL蒸餾水替代樣品溶液，測定500 nm處的吸光度(A0)。VE作陽性對照。每組平行測定3次，結(jié)果取平均值。按下式計(jì)算亞油酸自氧化抑制率(Y5)。

Y5= (A0-A)/A0×100%

(5)

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并借助Origin 2018進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物主要成分(見表1)

表1 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物中主要成分及含量 %

續(xù)表1

由表1可知：麻瘋樹籽仁乙醇提取物中多糖類物質(zhì)總含量為47.67%，酮類物質(zhì)總含量為0.774%；麻瘋樹籽殼乙醇提取物中多糖類物質(zhì)總含量為52.21%，酮類物質(zhì)總含量為4.22%，多酚類物質(zhì)總含量為0.30%。兩種提取物中雖然多糖類物質(zhì)總含量相差不大，但是含量最高的多糖種類不同，在麻瘋樹籽仁乙醇提取物中α,α-海藻糖含量最高，而在麻瘋樹籽殼乙醇提取物中葡萄糖酸含量最高。此外，在麻瘋樹籽仁乙醇提取物的酮類物質(zhì)中屬于甾體的庚酸睪酮、麝香酮含量較高，而在麻瘋樹籽殼乙醇提取物的酮類物質(zhì)中苯乙酮、3-甲氧基-5,7,3′,4′-四羥基黃酮含量較高。尤為重要的是，籽殼乙醇提取物中抗氧化成分較為豐富，并含有幾種籽仁乙醇提取物中沒有的物質(zhì)，如黃酮類抗氧化物質(zhì)中的3-甲氧基-5,7,3′,4′-四羥基黃酮、3′,5′-二甲氧基-4′-羥基苯乙酮和多酚類抗氧化物質(zhì)5-[4-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-六氫呋喃[3,4-c]呋喃-1-基]-2-甲氧基苯酚和4-[3-(4-羥基-3-甲氧基苯甲酰基)-2,3-二甲基環(huán)氧乙烷-2-羰基]-2-甲氧基苯酚。

綜上，可以預(yù)測麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物中抗氧化物質(zhì)種類和含量的不同，可能導(dǎo)致兩種提取物的抗氧化性有顯著差異。

2.2 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除DPPH自由基的能力(見圖1)

由圖1可知，VE對DPPH自由基的清除能力較為顯著，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其DPPH自由基清除率均在90%左右。麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，籽仁/殼乙醇提取物對DPPH自由基的清除率分別為74.60%、75.59%，其IC50分別為1.70 mg/mL和1.68 mg/mL。這可能與籽殼乙醇提取物中存在多酚類化合物，籽仁/殼乙醇提取物中含有黃酮類化合物有關(guān)[11-12]。

圖1 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除DPPH自由基的能力

2.3 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除ABTS+自由基的能力(見圖2)

圖2 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除ABTS+自由基的能力

由圖2可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除ABTS+自由基的能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而顯著增高，這可能是由于隨其質(zhì)量濃度的增加，抗氧化成分的含量越高，清除ABTS+自由基的能力越強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，VE對ABTS+自由基的清除率為81.49%，其IC50為1.2 mg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物對ABTS+自由基的清除率分別達(dá)到52.01%、73.40%，其IC50分別為3.49 mg/mL和1.64 mg/mL?？梢?，麻瘋樹籽殼乙醇提取物清除ABTS+自由基的能力高于籽仁乙醇提取物的，這與其含有較為豐富的抗氧化物質(zhì)有關(guān)。

2.4 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除羥自由基的能力(見圖3)

由圖3可知，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除羥自由基的能力隨其質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，VE對羥自由基的清除率為77.45%，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物對羥自由基的清除率分別為60.90%、69.31%?？梢姡榀倶渥褮ひ掖继崛∥锞哂休^強(qiáng)的清除羥自由基能力。

圖3 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除羥自由基的能力

2.5 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除超氧自由基的能力(見圖4)

圖4 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物清除超氧自由基的能力

由圖4可知，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物對超氧自由基的清除能力在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨其質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物對超氧自由基的清除率分別為58.10%、80.93%，此時(shí)VE對超氧自由基的清除率(80.32%)遠(yuǎn)大于籽仁乙醇提取物的，而與籽殼乙醇提取物的相近。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，麻瘋樹籽殼乙醇提取物對超氧自由基的清除率一直高于麻瘋樹籽仁乙醇提取物的。這可能與麻瘋樹籽殼乙醇提取物相比麻瘋樹籽仁乙醇提取物含有更多黃酮類活性物質(zhì)和多酚類物質(zhì)有關(guān)[13-14]。

2.6 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物的還原能力(見圖5)

由圖5可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，3種物質(zhì)還原能力由大到小依次為VE>麻瘋樹籽殼乙醇提取物>麻瘋樹籽仁乙醇提取物。麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物的還原能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。麻瘋樹籽殼乙醇提取物還原能力遠(yuǎn)超過籽仁乙醇提取物，這可能與其黃酮和多酚含量較多有關(guān)[15]。

圖5 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物的還原能力

2.7 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物抑制亞油酸自氧化能力(見圖6)

圖6 麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物抑制亞油酸自氧化能力

由圖6可知，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物抑制亞油酸自氧化能力在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈上升趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物對亞油酸自氧化的抑制率分別為44.84%、50.80%，VE對亞油酸的自氧化抑制率為72.62%。產(chǎn)生差異的原因可能是麻瘋樹籽殼乙醇提取物相較于籽仁乙醇提取物含有的黃酮類成分較多，并且含有一定量的多酚類化合物，使其具有較強(qiáng)的抑制亞油酸自氧化能力[16]。

3 結(jié) 論

麻瘋樹籽殼乙醇提取物中的抗氧化物質(zhì)種類較多、含量較高，尤其是含有一定量的多酚類物質(zhì)，導(dǎo)致在測試范圍內(nèi)麻瘋樹籽殼乙醇提取物的抗氧化能力均強(qiáng)于麻瘋樹籽仁乙醇提取物。其中麻瘋樹籽殼乙醇提取物在DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基和超氧自由基清除率方面表現(xiàn)較為優(yōu)異。但在所測指標(biāo)中，麻瘋樹籽仁/殼乙醇提取物的還原能力和對亞油酸自氧化的抑制能力相對較弱。