RASA1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

熱米拉·艾海提 逯宋梅 陳思婷 張瑞麗

腎透明細(xì)胞癌是泌尿生殖系統(tǒng)較為常見的惡性腫瘤之一。腎癌約占成人全身惡性腫瘤的3%[1]，其發(fā)病率及死亡率逐年上升[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，免疫原性強(qiáng)是腎癌的一大特性，常用的放、化療手段對(duì)其治療效果并不顯著[3]。手術(shù)切除是應(yīng)對(duì)腎癌相對(duì)更為有效的方式，尤其是對(duì)于早期腎癌。但仍有30%～35%的患者術(shù)后仍會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4-5]。目前晚期腎癌患者的一線治療手段是分子靶向治療及免疫治療[6]，盡管其延長了患者的生存時(shí)間，但因其不同程度的不良反應(yīng)仍存在較大的應(yīng)用局限性。由此可知，現(xiàn)有治療手段對(duì)于腎癌的治療效果仍有待提升。積極尋找能夠有助于腎癌診斷以及改善其生存的新靶點(diǎn)有至關(guān)重要的意義。本文深入探究腎透明細(xì)胞癌組織中RASA1的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系，為今后在臨床上對(duì)于診斷和治療腎癌提供新的思路及方向。

材料與方法

一、標(biāo)本和資料的收集

本研究以新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院為樣本來源，選取2010年1月1日至2018年12月31日于本院進(jìn)行手術(shù)切除的腎透明細(xì)胞癌患者，共91例，并收集其癌組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者必須為首次就診；②患者未接受任何形式的抗腫瘤治療；③通過病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查明確診斷為腎透明細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者確診為腎癌，但不屬于腎透明細(xì)胞癌，其中包括嫌色細(xì)胞癌、乳頭狀癌、未分化癌及集合管癌等；②患者的隨訪資料缺失，無法核實(shí)其病史等情況；③具有抗腫瘤治療史；④通過醫(yī)院檢查及病史調(diào)查，發(fā)現(xiàn)患者有其他部位的原發(fā)惡性腫瘤史。通過住院、門診及電話隨訪等方式，獲得91例腎透明細(xì)胞癌患者的初診記錄，以該時(shí)間節(jié)點(diǎn)為生存時(shí)間計(jì)算起點(diǎn)，以月為單位，隨訪終點(diǎn)計(jì)為患者死于腎癌或仍然存活，失訪患者以截尾數(shù)據(jù)處理。隨訪截止于2021年2月28日。本研究采集的所有腎癌組織標(biāo)本，均由2名病理醫(yī)師進(jìn)行確診，且所有患者均自愿并簽署相關(guān)知情同意書。

二、材料與主要試劑

小鼠抗人RAS p21蛋白激活因子1(RAS p21 protein activator 1， RASA1)單克隆抗體(貨號(hào)ab40677)，材料來源于美國abcam公司；DAB顯色試劑盒(貨號(hào)DAB-1031)、兔抗小鼠二抗(貨號(hào)KIT-5005)均購自福州邁新生物科技有限公司。RASA1陽性對(duì)照為已知染色陽性的腎透明細(xì)胞癌組織切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

三、免疫組織化學(xué)法檢測RASA1的表達(dá)水平及其結(jié)果判定

本研究采用SP免疫組織化學(xué)染色法用以檢測RASA1的表達(dá)水平。其結(jié)果判讀：RASA1定位于細(xì)胞質(zhì)中，依據(jù)文獻(xiàn)[7]對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判讀。陽性細(xì)胞、染色強(qiáng)度的判讀標(biāo)準(zhǔn)：①保證染色背景、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；②確保定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；③如果切取的組織為出血組織或壞死組織等情形，均視為無效。RASA1定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽性染色反應(yīng)為三種情形，分別是黃色、棕黃色和黃褐色。陽性細(xì)胞數(shù)：陽性細(xì)胞數(shù)0為0分，數(shù)量≤25%為1分，26%～50%為2分，51%以上為3分。染色強(qiáng)度：若未著色或著色不明顯為0分，若顏色為黃色、棕黃色和黃褐色，則分別對(duì)應(yīng)為1分、2分和3分。將陽性細(xì)胞數(shù)、染色強(qiáng)度兩項(xiàng)的計(jì)分相乘，結(jié)果>3分則視作高表達(dá)，≤3分則視作低表達(dá)。由兩位病理醫(yī)師判讀，通常以雙盲法為評(píng)判依據(jù)，如果二人在陰、陽性判斷時(shí)出現(xiàn)分歧，則再請(qǐng)一名同等級(jí)病理科醫(yī)師進(jìn)行判讀，并以其判讀結(jié)果為準(zhǔn)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將所有臨床資料錄入統(tǒng)一格式的Excel表格，利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料若滿足正態(tài)性檢驗(yàn)應(yīng)用t檢驗(yàn)，若不滿足則用非參數(shù)檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料則應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，不滿足χ2檢驗(yàn)則用Fisher精確檢驗(yàn)；對(duì)研究隊(duì)列隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier分析，多因素分析采用Cox回歸模型，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腎透明細(xì)胞癌組織中RASA1蛋白的表達(dá)水平

通過免疫組化的方法檢測RASA1在91例腎透明細(xì)胞癌患者組織標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果顯示RASA1均表達(dá)于實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿中，且90%以上細(xì)胞可見染色(評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見前述方法)，見圖1。91例腎透明細(xì)胞癌患者中，有51例為T1～2期患者，高表達(dá)率為90.2%(46/51)；40例為T3～4期患者，高表達(dá)率為72.5%(29/40)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：RASA1高表達(dá);B：RASA1低表達(dá)圖1 腎癌組織中RASA1的表達(dá)情況(HE染色，×400)

二、RASA1表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

為了明確RASA1表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系，本研究分析了91例患者的臨床資料，并采用免疫組化法對(duì)RASA1表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，RASA1表達(dá)水平與患者的T分期、M分期具有相關(guān)性(P<0.05)；與患者的性別、年齡、民族、淋巴脈管是否受侵、腫瘤大小、N分期及病理分級(jí)無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 RASA1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

三、RASA1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

將91例患者按RASA1的表達(dá)水平分為高表達(dá)和低表達(dá)組，并結(jié)合患者的實(shí)際預(yù)后情況，以Kaplan-Meier法為依據(jù)，繪制出患者的生存曲線(圖2)，分析結(jié)果表明，RASA1高表達(dá)組患者的生存期顯著優(yōu)于低表達(dá)組。高表達(dá)組和低表達(dá)組的中位生存時(shí)間分別為47.4個(gè)月和39.5個(gè)月。隨后對(duì)91例腎透明細(xì)胞癌患者進(jìn)行預(yù)后影響因素分析，Cox多因素分析顯示，T分期、M分期、腫瘤大小、淋巴脈管是否受侵、病理分級(jí)以及RASA1表達(dá)水平與患者的預(yù)后均無明顯相關(guān)性(P>0.05，表2)。

圖2 RASA1表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

表2 影響腎透明細(xì)胞癌患者總生存期的多因素分析

討 論

根治性腎切除術(shù)仍然是目前治療腎癌最主要的手段，但對(duì)中晚期的腎癌患者來說即便是將原發(fā)病灶切除，術(shù)后也容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，有些患者術(shù)后雖然無局部復(fù)發(fā)，卻出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。因此，找尋可用于臨床、并與腎癌發(fā)生、診斷以及惡性程度相關(guān)的靶基因有非常重要的意義。

RAS蛋白作為ras基因表達(dá)產(chǎn)物，具有重要作用，其在腫瘤細(xì)胞生長和增殖過程中起促進(jìn)作用。RASA1也被稱為p120-RASGAP，是一種RASGAP蛋白，其作為信號(hào)支架蛋白，調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號(hào)級(jí)聯(lián)，具有讓RAS蛋白失活從而抑制RAS信號(hào)通路的功能。RAS蛋白位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)，屬于膜結(jié)合蛋白。這類蛋白常常充當(dāng)傳感器的角色，用以連接膜表面的感受器和細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)器。由此可以看出，RAS蛋白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著“分子開關(guān)”的關(guān)鍵作用。研究證實(shí)RAS蛋白的活化過程有賴于與三磷酸鳥苷的結(jié)合，活化完成后，RAS蛋白經(jīng)由級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活RAS/RAF/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化過程；但礙于RASGAP的作用，這些RAS蛋白會(huì)加速失活，以保證細(xì)胞的穩(wěn)定增殖狀態(tài)[8]。另有研究稱，RASA1可通過N端的SH2-SH3-SH4結(jié)構(gòu)域激活RAS-GT-Pase，水解三磷酸鳥苷，使活化的RAS蛋白轉(zhuǎn)為非活化狀態(tài)，阻止下游信號(hào)通路的激活[9]。目前越來越多的研究表明，RASA1表達(dá)水平的變化與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，且與患者的預(yù)后及某些臨床病理特征有相關(guān)性。ras基因在不同癌癥中的平均突變率達(dá)到30%[10]，然而在腎癌中ras基因的突變率并不高[11]。但同時(shí)有研究指出，ras基因介導(dǎo)的RAF/MEK/ERK通路的異常激活，對(duì)于腎癌發(fā)生有重要作用，因此抑制RAS通路可以有效抑制腎癌細(xì)胞生長[11-13]。而RASA1在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平與患者的預(yù)后有無相關(guān)性尚不明確。因此我們推測，RASA1的異常表達(dá)可能與腎透明細(xì)胞癌患者的RAS信號(hào)通路異常激活有關(guān)，對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者的預(yù)后有一定影響。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌[12]、結(jié)腸癌[13]、胰腺癌[14]中，RASA1均對(duì)RAS信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，并且RASA1的表達(dá)水平密切影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，mir-31不僅可以抑制RASA1蛋白的表達(dá)，且在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，其高表達(dá)與患者結(jié)直腸癌患者的TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后顯著相關(guān)[15]。有相關(guān)研究通過對(duì)肝細(xì)胞癌組織基因測序，檢測RASA1和RASGAP家族其他成員，發(fā)現(xiàn)RASA1表達(dá)下調(diào)[16]。進(jìn)一步預(yù)后分析顯示，肝細(xì)胞癌組織中RASA1的表達(dá)與腫瘤大小和分化程度密切相關(guān)，RASA1高表達(dá)與更大的腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，與RASA1高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者相比，RASA1低表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者與較差的生存率相關(guān)，因此，RASA1可以作為肝細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物[17]。Kent等[18]報(bào)道，RASA1表達(dá)水平降低顯著促進(jìn)Capan-1和MiaPaCa2細(xì)胞株胰腺癌的進(jìn)展；秦玉璇等[14]發(fā)現(xiàn)RASA1在癌組織中的表達(dá)水平明顯低于胰腺良性病變組織，說明RASA1在胰腺癌發(fā)生中可能起到抑癌蛋白的作用，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與浸潤程度和臨床分期有關(guān)，說明RASA1的表達(dá)水平降低可能是發(fā)生在胰腺癌早期的分子事件，而與腫瘤最大直徑和術(shù)后生存時(shí)間均無顯著差異，其有待進(jìn)一步深入研究。另有研究報(bào)道，RASA1低表達(dá)與braf基因突變的黑色素瘤患者總生存期下降有關(guān)[8]。Liu等[19]提到乳腺癌中有7種基因突變，其中包括RASA1突變，RASA1表達(dá)水平越低，乳腺癌患者的無進(jìn)展生存期和總生存期越短。鑒于此，RASA1的低表達(dá)水平可以作為評(píng)估指標(biāo)，有效預(yù)測乳腺癌患者的預(yù)后情況。對(duì)接蛋白2 (Dok2)和RASA1都具有腫瘤抑制因子的功能，且已經(jīng)在幾種類型的實(shí)體腫瘤中檢測到，已有研究表明，Dok2/RASA1低表達(dá)與低分化乳腺癌相關(guān)，Dok2和RASA1表達(dá)的降低與更大的腫瘤大小和轉(zhuǎn)移到腋窩淋巴結(jié)的機(jī)會(huì)增加有關(guān)[20]。亦有文獻(xiàn)提出，在食管鱗癌細(xì)胞中，如果mir-21的表達(dá)水平過高，會(huì)導(dǎo)致RASA1的表達(dá)降低，進(jìn)而抑制腫瘤生長，由此可以推斷RASA1可能是一種抑癌樣蛋白[21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在腎透明細(xì)胞癌中，QKI-5穩(wěn)定的RASA1 mRNA直接與RASA1 QKI活性元素區(qū)結(jié)合，并阻止RAS-MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[22]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，RASA1通過降低miR-223-3p以激發(fā)FBXW7的表達(dá)，從而抑制腎細(xì)胞癌的發(fā)展進(jìn)程[23]。對(duì)于RASA1的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者的臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系則少有報(bào)道。

本研究基于不同病理特征的腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色法，分別檢測其RASA1的表達(dá)水平，并通過比較分析，深入探究RASA1表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。最終得出結(jié)論：RASA1的表達(dá)水平與患者的T、M分期相關(guān)(P<0.05)。此結(jié)果與羅云春等[15]對(duì)于結(jié)腸癌中RASA1的表達(dá)水平研究結(jié)果相一致。但與Liu等[19]關(guān)于乳腺癌的研究結(jié)果不符，與N分期無關(guān)，分析原因可能與本研究樣本中N分期陽性病例數(shù)較少或本研究的檢測手段較局限有關(guān)，仍需要更多研究進(jìn)一步證實(shí)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)RASA1表達(dá)水平與患者的預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，RASA1低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為39.5個(gè)月，而RASA1高表達(dá)組為47.4個(gè)月，Kaplan-Meier生存分析顯示RASA1低表達(dá)的腎透明細(xì)胞癌患者生存情況較差，這也更加證實(shí)了RASA1表達(dá)水平可能與患者的生存情況具有相關(guān)性。進(jìn)一步的Cox多因素分析則顯示T分期、M分期、腫瘤大小、淋巴脈管是否受侵、病理分級(jí)以及RASA1表達(dá)水平與患者的預(yù)后均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，RASA1的表達(dá)水平并不是腎透明細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，考慮此結(jié)果可能與本研究中總病例數(shù)較少有關(guān)。

綜上所述，RASA1在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生中可能起著抑癌基因的作用，也可認(rèn)為RASA1的表達(dá)水平可能是發(fā)生在腎透明細(xì)胞癌早期的分子事件，早期檢測或干涉腎透明細(xì)胞癌中RASA1的表達(dá)水平有可能對(duì)腎透明細(xì)胞癌的早期診斷或防治有一定價(jià)值，同時(shí)也提示RASA1可以作為腎透明細(xì)胞癌相關(guān)藥物治療研究的潛在靶點(diǎn)，但有待進(jìn)一步深入研究。此外，本研究結(jié)果還表明，RASA1的表達(dá)水平與患者的預(yù)后顯著相關(guān)，RASA1高表達(dá)組患者的生存期顯著優(yōu)于RASA1低表達(dá)組。由此可以推測，RASA1的表達(dá)水平可以作為評(píng)估腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)，也進(jìn)一步反映出RASA1對(duì)于腎透明細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程具有較大影響。