梅花草屬葉綠體基因組進(jìn)化分析

夏銘澤 張發(fā)起 遲曉峰 韓 霜 陳世龍*

（1. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

梅花草屬（）物種為多年生小草本植物，全球60 余種，多分布于北溫帶高山地區(qū)，其中喜馬拉雅及其毗鄰地區(qū)是該屬植物的分布和分化中心。梅花草屬系統(tǒng)位置長(zhǎng)期存在爭(zhēng)議，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為梅花草屬與虎耳草科（Saxifragaceae）親緣關(guān)系最近。然而，也有學(xué)者認(rèn)為梅花草屬與其他科的親緣關(guān)系較近，另有部分學(xué)者則支持梅花草屬應(yīng)處理為單獨(dú)的科或目。近年來，梅花草屬分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果認(rèn)為該屬和衛(wèi)矛科（Celas?traceae）親緣關(guān)系最近，APG（Angiosperm Phyloge?ny Group）Ⅳ綜合分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果后，將梅花草屬置于衛(wèi)矛科之下。然而，部分研究結(jié)果將梅花草屬作為衛(wèi)矛科的姊妹類群；相反，也有一些研究認(rèn)為梅花草屬是衛(wèi)矛科早期衍生的譜系而非姊妹類群。此外，梅花草屬、核子木屬（）、假衛(wèi)矛屬（）、砂紙木屬（）和衛(wèi)矛科的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。這些研究多基于序列數(shù)據(jù)（如-、-和ITS 序列）重建梅花草屬與近緣類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，而近年來一些質(zhì)體基因組結(jié)構(gòu)的研究為物種進(jìn)化適應(yīng)提供了新的見解，這為解決梅花草屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系問題提供了新的研究思路。

自1986年，煙草（）完整葉綠體基因組被測(cè)序并報(bào)道后，越來越多的植物葉綠體基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成。隨著二代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展及測(cè)序成本的不斷降低，葉綠體基因組序列變得更易獲得。目前，已有超過2 000 個(gè)葉綠體基因組發(fā)布在National Center for Biotech?nology Information（NCBI）上。先前研究表明，葉綠體基因組結(jié)構(gòu)較保守，一般由大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）、小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC）和2 個(gè)反向重復(fù)區(qū)（inverted repeat sequence，IR）4 個(gè)區(qū)域組成，但僅有少數(shù)植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)較特殊，如鷹嘴豆（）、牻牛兒苗屬（）和豌豆（）丟失1 個(gè)反向重復(fù)區(qū)；篦子三尖杉（）丟失2 個(gè)反向重復(fù)區(qū)；黑松（）僅有495 bp 的反向重復(fù)區(qū)，葉綠體基因組僅為119 kb。葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和序列變異研究，如反向重復(fù)區(qū)收縮和擴(kuò)張、基因丟失和假基因化、密碼子偏好性和核苷酸替換率等，有助于了解相關(guān)物種的進(jìn)化過程，同時(shí)為近緣類群系統(tǒng)學(xué)研究提供了新的研究思路。

本研究選取梅花草（）、雞肫梅花草（）、白耳菜（）、甘肅梅花草（）、三脈梅花草（）、德格梅花草（）和青銅錢（）共7個(gè)梅花草屬物種作為研究對(duì)象。同時(shí)，選取衛(wèi)矛科雙花假衛(wèi)矛（）、圓葉南蛇藤（）、白杜（）和永瓣藤（）4 個(gè)物種作為外類群，通過統(tǒng)計(jì)比對(duì)葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征和基因情況，分析密碼子使用模式，探討梅花草屬葉綠體基因組的進(jìn)化趨勢(shì)。

1 材料與方法

1.1材料

三脈梅花草（Chen2013132）采自四川爐霍（31°10′N，100°53′E），青銅錢（Chen2013134）采自四 川色 達(dá)（31°44′N，100°45′E），雙 花 假 衛(wèi) 矛（Zhang2019720）采自 廣 西 恭 城（24°53′N，111°0′E），圓葉南蛇藤（Zhang2019713）采自廣西金秀（24°10′N，110°22′E），白杜（Zhang2019763）采自青海西寧（36°37′N，101°45′E）。野外采集的新鮮幼嫩葉片，硅膠干燥后帶回中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存。憑證標(biāo)本存放于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（HNWP）內(nèi)。梅花草、雞肫梅花草、白耳菜、甘肅梅花草、德格梅花草和永瓣藤的葉綠體基因組數(shù)據(jù)下載于NCBI數(shù)據(jù)庫（見表1）。

表1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)信息和GenBank登錄號(hào)Table 1 Structure information and GenBank number of chloroplast genomes

1.2 DNA 提取和測(cè)序

采用改良的CTAB 法從約10 mg 干燥葉片中提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組小片段文庫構(gòu)建；利用Illumina HiSeq 2500（Illumina Inc.，San Diego，California，USA）測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行長(zhǎng)度為150 bp的雙端測(cè)序，獲得下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw reads）；使 用Trimmomatic v. 0.33（參 數(shù)：PE-phred33-trimlog seq.log-threads 4 SLIDINGWINDOW：5：20 LEADING：5 TRAILING：5 MINLEN：50）和FastQC v.0.11.8對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和篩選，獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)（Clean reads）供后續(xù)分析。

1.3葉綠體基因組組裝及注釋

使用GetOrganelle v. 1.7.5 組裝葉綠體基因組；使 用 在 線 工 具GeSeq（http：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）進(jìn)行葉綠體基因組注釋；BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）后，應(yīng)用軟件Sequin v. 15.50 手動(dòng)增刪和調(diào)整基因起始/終止密碼子及內(nèi)含子/外顯子位置。

1.4葉綠體基因組特征統(tǒng)計(jì)

注釋后的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行對(duì)比，統(tǒng)計(jì)各個(gè)物種基因和內(nèi)含子。以三脈梅花草為參考物種，利用mVISTA（https：//genome.lbl.gov/vista/index.shtml）（參數(shù)：LAGAN）軟件對(duì)梅花草屬及近緣屬11個(gè)種的葉綠體基因組相似度進(jìn)行可視化比對(duì)，結(jié)合DnaSP v.6.10.01 軟件對(duì)核苷酸多樣性進(jìn)行分析繪圖（參數(shù)：400 bp window length and 200 bp step size）；利用Scalable Vector Graphics v.2.8.6在Perl v.5.16.3（https：//dev.perl.org/）中繪制各物種IR/SC區(qū)域連接處基因分布對(duì)比圖。

1.5同源基因信息比對(duì)分析

篩選梅花草屬及近緣屬11個(gè)物種葉綠體基因組的共有基因，將其分為14 個(gè)數(shù)據(jù)集：（fatty acid synthesis）、（ATP synthase）、（carbon metabolism）、（proteolysis）、（translational initiation factor）、（RNA processing）、（NADPH dehydrogenase）、（cytochrome b/f com?plex）、（photosystem Ⅰ）、（photosystem Ⅱ）、（rubisco）、（large subunit of ribosome）、（DNA dependent RNA polymera）、（small subunit of ribosome）。采用密碼子比對(duì)策略，對(duì)所有數(shù)據(jù)集使 用MAFFT v.7.409（參 數(shù)：--thread 3--auto--inputorder）進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)后使用PAML v.4.9j軟件中的CodeML 選項(xiàng)（數(shù)據(jù)類型設(shè)為密碼子、平衡密碼子頻率設(shè)為F3×4、其他參數(shù)為默認(rèn)）計(jì)算各數(shù)據(jù)集的同義替代率（synonymous，dS）和非同義替代率（nonsynonymous，dN）；使用CodonW v.1.4.2（http：//codonw.sourceforge.net/）計(jì)算各物種及數(shù)據(jù)集密碼子偏好性相關(guān)指數(shù)：相對(duì)同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU），有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENc），密碼子第一、第二和第三位置堿基含量（GC1、GC2、GC3），同義密碼子第三位GC 含量（GC3s），密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon Adaptation Index，CAI）等。有效密碼子數(shù)是展示同義密碼子偏好程度的重要指標(biāo)，取值在20～61，數(shù)值低于35 則表明密碼子具有高偏好性。密碼子適應(yīng)指數(shù)指編碼蛋白的同義密碼子與最佳密碼子使用頻率的符合程度，該值越大表明符合度越高，范圍在0～1。根據(jù)RSCU、ENc和GC3s 值，在R v.4.0.1 中使用ggplot2 繪制密碼子使用偏好分析圖。

1.6系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探討梅花草屬和近緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以綠玉樹（）為外類群，使用共有基因數(shù)據(jù)集重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。利用IQTREE v.1.6.8（參數(shù)：-st CODON11-m TEST-alrt 1000-bb 5000-bcor 0.90-wbt-nt AUTO）中的ultra?fast bootstrap 功能構(gòu)建最大似然樹；使用FigTree v.1.4.3（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）對(duì)最終樹進(jìn)行可視化和編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

三脈梅花草、青銅錢、雙花假衛(wèi)矛、圓葉南蛇藤和白杜的葉綠體基因組均為四分體結(jié)構(gòu)，由大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）、小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC）和2 個(gè)反向重復(fù)區(qū)（invert?ed repeats，IR）構(gòu)成。所研究的物種葉綠體基因組總長(zhǎng)相差較大，介于148 700 bp（梅花草）到159 208 bp（永瓣藤）之間；但不同物種間各分區(qū)長(zhǎng)度差異較小，僅梅花草SSC 區(qū)較其他物種相對(duì)較短（見表1）。本研究中獲得的5 個(gè)物種葉綠體基因組序列已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫。

除梅花草（105 種基因）外，梅花草屬6 個(gè)物種的基因種類均為115 個(gè)；所有物種tRNA 基因均為30 種，rRNA 基因?yàn)? 種（見表1）。與其他物種相比，梅花草基因家族的、、、、、、、和基因全部缺失，僅含和基因；而基因在永瓣藤、白杜、南蛇藤和雙花假衛(wèi)矛的葉綠體基因組中缺失。對(duì)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)共18個(gè)基因具內(nèi)含子（見表2），包括12 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（和）和6 個(gè)tRNA 基因（----和-）。除了和基因外，其余具內(nèi)含子基因?yàn)楸狙芯恐兴形锓N共有。永瓣藤葉綠體基因組具內(nèi)含子基因最多，有18個(gè)。此外，與本研究的其他物種相比，梅花草屬物種的基因均無內(nèi)含子。

表2 葉綠體基因組基因外顯子和內(nèi)含子長(zhǎng)度Table 2 Exon and intron length（bp）of chloroplast genes

2.2葉綠體基因組變異分析

為了比較梅花草屬與其近緣屬葉綠體基因組的整體相似度，以三脈梅花草葉綠體基因組為參考，利用mVISTA程序進(jìn)行多序列相似度可視化展示。如圖1 所示，物種間編碼區(qū)序列高度保守，非編碼區(qū)序列差異較大。此外，核苷酸多樣性折線圖（見圖2）顯示，梅花草屬與近緣屬物種葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)序列較單拷貝區(qū)序列更為保守。

圖1 梅花草屬與其近緣屬葉綠體基因組比對(duì)Fig.1 Comparison of chloroplast genome between Parnassia and allied genera

圖2 梅花草屬與其近緣屬葉綠體基因組核苷酸多樣性Fig.2 Nucleotide diversity of chloroplast genome of Parnassia and allied genera

梅花草屬與其近緣屬葉綠體基因組IR/SC 連接區(qū)比對(duì)結(jié)果顯示，所有物種葉綠體基因組均為四分體結(jié)構(gòu)，物種間各個(gè)分區(qū)長(zhǎng)度接近（見圖3）。梅花草屬所有物種LSC 與IRb 邊界左右兩端基因分別為基因和基因，與南蛇藤屬和永瓣藤屬保持一致，而衛(wèi)矛屬和假衛(wèi)矛屬物種基因相對(duì)向LSC 區(qū)移動(dòng)，使LSC 與IRb邊界兩端基因變?yōu)榛蚝突?。IRb、SSC 和IRa 邊界兩端均為和基因，在所有物種中保持一致（梅花草除外，該物種和基因丟失）。值得注意的是，梅花草的SSC 區(qū)最短，僅有14 741 bp，這也導(dǎo)致該物種SSC 區(qū)兩端基因?yàn)楹突?。此外，所有物種的基因跨過SSC 和IRa 的邊界處，僅青銅錢的基因整體位于SSC 區(qū)，且與SSC 邊界相距439 bp。南蛇藤屬和梅花草屬LSC 與IRa 邊界左右兩端的基因均為和基因，且除南蛇藤屬和假衛(wèi)矛屬外，所有物種的基因跨過IRa與LSC邊界處（見圖3）。

圖3 梅花草屬與近緣屬葉綠體基因組分區(qū)連接處比較JLB指LSC區(qū)與IRb區(qū)連接處；JSB指SSC區(qū)與IRb區(qū)連接處；JSA指SSC區(qū)與IRa區(qū)連接處；JLA指LSC區(qū)與IRa區(qū)連接處Fig.3 Comparison of boundaries among SC and IR regions of chloroplast genomes of Parnassia and allied generaJLB refers to the connection between LSC region and IRb region；JSB refers to the connection between SSC region and IRb region；JSA refers to the connection between SSC region and IRa region；JLA refers to the connection between LSC region and IRa region

2.3核苷酸替代率

為了檢測(cè)蛋白質(zhì)水平上受到的選擇壓力，首先將梅花草屬和近緣屬葉綠體基因組共有的65蛋白編碼按照基因家族分為14 個(gè)數(shù)據(jù)集：、（、、、、和）、、、、（和）、（、、、和）、（、、、和）、（、、、、、、、、、、、、和）、、（、、、、、、、和）、（、、、）和（、、、、、、、、、、和），然后對(duì)這14 個(gè)數(shù)據(jù)集的同義替代率（dS）、非同義替代率（dN）以及dN/dS值進(jìn)行估計(jì)。結(jié)果顯示，所有基因均有較低的非同義替換率，僅基因的非同義替換率稍高（見圖4）。所有基因dN/dS 值均小于0.4，其中、、和的dN/dS 值較大，為0.25～0.40，其余基因的dN/dS值均小于0.25。

圖4 蛋白質(zhì)編碼基因的非同義替代率（dN）（A）和同義替代率（dS）（B）及其比率（dN/dS）（C）Fig.4 Comparison of nonsynonymous（dN）（A）and synonymous substitution rates（dS）（B）and their ratios of protein-coding genes（dN/dS）（C）

2.4密碼子使用偏好性分析

對(duì)葉綠體蛋白編碼基因的密碼子偏好性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（見表3），結(jié)果顯示，物種間總的GC 含量、第一密碼子GC 含量和第二密碼子GC 含量相差不大，差值未超過0.5%。第三密碼子GC含量相對(duì)而言差別較大，雙花假衛(wèi)矛含量最低（28.97%），白杜含量最高（29.95%）。所有物種第三位密碼子GC含量不超過30%，說明該位點(diǎn)A/T 堿基使用較多。密碼子適應(yīng)指數(shù)在0.170～0.175，有效密碼子數(shù)在49.02～49.74（見表3）。

表3 葉綠體蛋白編碼基因的密碼子偏好性Table 3 Codon usage of chloroplast protein-coding genes

繪制所有個(gè)體14個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)據(jù)集的ENc-GC3s 散點(diǎn)圖（見圖5），結(jié)果顯示，大部分基因的點(diǎn)在曲線上或者接近曲線，、、和基因的點(diǎn)離曲線較遠(yuǎn)。和基因的點(diǎn)在曲線附近較為分散，其中雙花假衛(wèi)矛和三脈梅花草的基因以及雙花假衛(wèi)矛和南蛇藤的基因離曲線較遠(yuǎn)。

圖5 蛋白質(zhì)編碼基因的有效密碼子數(shù)（ENc）與同義第三密碼子GC含量（GC3s）散點(diǎn)圖Fig.5 ENc plotted against GC3s of protein-coding genes

對(duì)葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因的64個(gè)同義密碼子進(jìn)行分析（見圖6），有29個(gè)同義密碼子的RSCU 值大于1，且均以堿基A 和U 結(jié)尾（UUG 除外）。編碼亮氨酸的UUA的RSCU值最高（1.93～2），其次是編碼丙氨酸的GCU（1.81～1.88）。RSCU 值最低的同義密碼子為編碼亮氨酸的CUC（0.35～0.39）和CUG（0.35～0.44），以及編碼酪氨酸UAC（0.36～0.42）。物種間的相對(duì)同義密碼子使用情況略有差異，聚類結(jié)果顯示，梅花草屬的個(gè)體聚在一起，然后和（（衛(wèi)矛屬，南蛇藤屬），永瓣藤屬）形成一個(gè)分支，最后假衛(wèi)矛屬與其余屬聚在一起。

圖6 葉綠體基因相對(duì)同義密碼子使用度熱圖Fig.6 Heat map of relative synonymous codon usage（RSCU）values of chloroplast genes

2.5梅花草屬及其近緣屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于葉綠體基因組蛋白編碼序列的梅花草屬及其近緣屬系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，所有分支都有較高的支持率。其中，梅花草屬物種單獨(dú)聚為一支，衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬、南蛇藤屬和永瓣藤屬聚為一支，這兩個(gè)分支互為姊妹類群，與假衛(wèi)矛屬形成一個(gè)大的分支（見圖7）。

圖7 基于葉綠體基因組蛋白編碼序列構(gòu)建的梅花草屬與其近緣屬的系統(tǒng)發(fā)育樹系統(tǒng)發(fā)育樹分支上的數(shù)字代表自展支持率Fig.7 Phylogenetic tree of Parnassia and allied genera based on protein-coding sequences of chloroplast genomesThe numbers on the branches of the phylogenetic tree represent bootstrap support rate

3 討論

自Shinozaki 等發(fā)布第一個(gè)葉綠體基因組后，越來越多的植物葉綠體基因組相關(guān)研究相繼被發(fā)表，這些研究提高了我們對(duì)植物葉綠體基因組的認(rèn)識(shí)。近年來，多個(gè)研究利用葉綠體基因組序列數(shù)據(jù)解決了系統(tǒng)學(xué)疑難問題，展現(xiàn)了其在系統(tǒng)學(xué)研究上的巨大價(jià)值。而植物葉綠體基因、核苷酸替換率和密碼子偏好性等特征，可能預(yù)示著質(zhì)體進(jìn)化的動(dòng)力和方向，從另一角度揭示物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。我們將討論梅花草屬葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和密碼子偏好性等特征，期望利用比較基因組學(xué)的研究結(jié)果，為該屬的系統(tǒng)發(fā)育研究提供新的思路。

本研究所涉及11個(gè)物種的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)高度保守，均為四分體結(jié)構(gòu)。梅花草屬7個(gè)物種的葉綠體基因組總長(zhǎng)度在148 700～153 590 bp，其中梅花草葉綠體基因組長(zhǎng)度最短，并且該物種葉綠體基因數(shù)目也最少。梅花草tRNA 基因和rRNA 基因與同屬物種保持一致，蛋白質(zhì)編碼基因缺少11個(gè)，其中9 個(gè)是家族基因（，，，，，，，和）?；蚺c葉綠體的呼吸過程相關(guān)，而最近對(duì)質(zhì)體基因丟失和進(jìn)化的多個(gè)研究結(jié)果顯示，是最易丟失的基因之一，推測(cè)該基因在當(dāng)前環(huán)境中的生物學(xué)意義可能有限。丟失的基因可能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核或線粒體中，缺失的功能可由核編碼蛋白替代。本研究中梅花草屬僅梅花草丟失基因，后續(xù)仍需增加該屬的采樣覆蓋度，確認(rèn)基因的缺失是否代表梅花草屬某一分支物種的共同特征。而梅花草屬的近緣屬，假衛(wèi)矛屬、南蛇藤屬、衛(wèi)矛屬和永瓣藤屬的物種葉綠體基因組中，均缺少基因。物種在自然選擇的過程中會(huì)發(fā)生基因丟失和獲得，這會(huì)極大地促進(jìn)性狀進(jìn)化。結(jié)合此前研究中所證實(shí)的本屬的單系性，我們認(rèn)為，梅花草屬物種中均擁有基因是共同祖先遺傳的結(jié)果。此外，較本研究中的其他物種而言，僅假衛(wèi)矛屬的雙花假衛(wèi)矛丟失了基因。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，我們認(rèn)為，這可能預(yù)示著梅花草屬與南蛇藤屬、衛(wèi)矛屬和永瓣藤屬的親緣關(guān)系更近。內(nèi)含子基因分析結(jié)果與該觀點(diǎn)相一致，本研究中僅雙花假衛(wèi)矛的基因具有一個(gè)內(nèi)含子，其余物種的基因均無內(nèi)含子。梅花草屬所有物種基因的內(nèi)含子消失，代表梅花草屬這一分支物種的共有特征。需注意的是，本研究中來源自NCBI 數(shù)據(jù)庫的永瓣藤葉綠體基因組序列或存在問題，表現(xiàn)在兩個(gè)IR 區(qū)長(zhǎng)度的不一致、序列中出現(xiàn)大片段的重復(fù)（直接導(dǎo)致-基因在LSC 區(qū)中出現(xiàn)了一個(gè)重復(fù)）等。由于原始文獻(xiàn)中并未發(fā)布該物種的測(cè)序原始數(shù)據(jù)，不能確認(rèn)該情況是物種葉綠體基因組中真實(shí)存在，還是序列組裝過程中的人為操作失誤所致。

梅花草屬及其近緣屬的葉綠體基因組的整體相似度和核苷酸多樣性比對(duì)，結(jié)果顯示，所有物種IR 區(qū)比SC 區(qū)遺傳多態(tài)性更低，編碼區(qū)序列比非編碼區(qū)序列更為保守。這與大多數(shù)被子植物此前的研究結(jié)果相類似，變異率高的區(qū)域被認(rèn)為是系統(tǒng)發(fā)育分析的潛在分子標(biāo)記材料。此外，蛋白質(zhì)編碼基因的非同義/同義替代比率已經(jīng)廣泛用于物種進(jìn)化動(dòng)力推斷等研究。某基因非同義替代率和同義突變替代率值相等，表明自然選擇對(duì)該基因的適合度沒有影響。而dNdS 意味著非同義突變占優(yōu)勢(shì)且被自然選擇固定下來。通常來說，大多數(shù)基因由于純化選擇的作用，非同義核苷酸替換的頻率低于同義核苷酸替換的頻率。本研究發(fā)現(xiàn)，梅花草屬和近緣屬的所有基因dN/dS 值均較低，表明這些物種的葉綠體基因可能經(jīng)歷了純化選擇的作用。

作為一個(gè)重要的進(jìn)化特征，密碼子偏好性在不同物種之間、同物種不同基因之間存在顯著差異。葉綠體基因組蛋白編碼基因的堿基含量分析結(jié)果顯示，物種間基因的GC 含量相差不大，且不同密碼子位置的GC 含量具有相同趨勢(shì)（GC1>GC2>GC>GC3），而在蘭科植物核基因密碼子的GC 含量分析中也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢(shì)。梅花草屬及近緣屬葉綠體基因的ENc 值均大于35，表明其密碼子偏好性不強(qiáng)。ENc-GC3s 散點(diǎn)圖（見圖5）可以更好地展示葉綠體基因組的密碼子使用偏好性，當(dāng)基因僅受突變壓力作用時(shí)，ENc 值應(yīng)在圖中所示的曲線上，ENc 值偏離該曲線則表明基因受到選擇壓力的作用。根據(jù)ENc-GC3s 散點(diǎn)圖的結(jié)果，大部分基因的點(diǎn)在曲線上或者接近曲線，表明這些基因主要受突變的影響。而偏離該曲線的基因（、、和基因）主要受選擇的影響，類似結(jié)果在白刺科研究中也有發(fā)現(xiàn)。

葉綠體基因組蛋白編碼基因的RSCU值比對(duì)和聚類分析結(jié)果顯示，衛(wèi)矛屬、南蛇藤屬和永瓣藤屬聚在一起，和梅花草屬聚成一個(gè)分支，最終與假衛(wèi)矛屬聚成一個(gè)大支。盡管過去部分研究表明，密碼子偏好性的聚類結(jié)果與物種的親緣關(guān)系之間存在較大差異。然而在本研究中，該密碼子偏好性的聚類結(jié)果與蛋白編碼序列重建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系結(jié)果相一致，說明在本研究涉及的類群中，密碼子偏好性的部分特征或可反應(yīng)真實(shí)的物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

梅花草屬及其近緣屬的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，梅花草屬為單系類群，與過去的研究結(jié)果一致。而梅花草屬與衛(wèi)矛屬、南蛇藤屬和永瓣藤屬聚為一支，然后該分支與假衛(wèi)矛屬聚在一起，支持梅花草屬或?yàn)樾l(wèi)矛科早期的衍生譜系而非姊妹類群。而假衛(wèi)矛屬的系統(tǒng)學(xué)位置目前仍處于爭(zhēng)論之中，相關(guān)研究展現(xiàn)的結(jié)果并不相同。仍需增加衛(wèi)矛科物種采樣覆蓋度，解決梅花草屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系問題。

本研究測(cè)序并組裝了三脈梅花草、青銅錢、雙花假衛(wèi)矛、圓葉南蛇藤和白杜5種植物的葉綠體基因組。結(jié)合近緣物種相關(guān)信息，揭示了本屬的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和密碼子偏好性等特征，探討了本屬葉綠體基因組的進(jìn)化趨勢(shì)。該屬葉綠體基因可能經(jīng)歷純化選擇作用，選擇壓力在葉綠體基因組蛋白編碼基因進(jìn)化過程中或發(fā)揮作用。后續(xù)仍需增加該屬物種取樣覆蓋度，以進(jìn)一步支持和完善梅花草屬葉綠體基因組的特征和進(jìn)化趨勢(shì)研究。