內(nèi)部沸騰法提取骨碎補多糖及其抗氧化活性研究

梁家燦，文慧香，梁云貞 (.昆明學院農(nóng)學與生命科學學院，云南昆明 65000；.南華大學化學化工學院，湖南衡陽 4000；3.廣西民族師范學院化學與生物工程學院，廣西崇左 53500)

骨碎補(Moore ex Bak.)是一種比較常用的中藥，具有補腎、強骨、止痛等功效，用于治療耳鳴耳聾、牙齒松動、筋骨傷折、腎虛腰痛、跌撲閃挫等癥狀。市場上比較常見的主流產(chǎn)品是水龍骨科的植物槲蕨((Kunez)J.sm.)的干燥根莖。骨碎補研究較多的活性成分是黃酮類化合物和多糖等。多糖類物質(zhì)作為植物中主要的活性成分之一，在促進動物生長發(fā)育以及作為抗氧化劑等方面扮演著十分重要的角色。

內(nèi)部沸騰法具有省時、高效、反應條件易達成等特點，因此相對于傳統(tǒng)水提法等，在植物有機成分的提取方面具有十分明顯的優(yōu)勢。該研究以中藥骨碎補作為原料，采用內(nèi)部沸騰法對其體內(nèi)多糖進行提取，通過單因素試驗和正交試驗確定最佳的內(nèi)部沸騰提取方案并在后續(xù)試驗中測定骨碎補多糖的抗羥基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的氧化活性。

1 材料與方法

骨碎補樣品，廣西崇左市龍州縣；98%硫酸、苯酚、無水乙醇，均為分析純，購于廣東光華科技股份有限公司；三氯乙酸、正丁醇、過氧化氫，均為分析純，購于成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)；水楊酸(≥99.5%)、FeSO·7HO(99.0%～101.0%)，購于天津市光復精細化工研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(≥97%)，購于上海藍季科技發(fā)展有限公司。

DSY-9002高速萬能粉碎機(永康市九順瑩商貿(mào)有限公司)；V-1100D可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司)；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；AUW220D電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；HZ-2A恒溫水浴鍋(南京南大萬和科技有限公司)；80-2離心沉淀機(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

骨碎補樣品處理。將采回的槲蕨根莖洗凈后于電熱鼓風干燥箱中烘干至恒重，粉碎，過80目篩。將過篩后的槲蕨根莖粉末用石油醚脫色風干后即為所需的骨碎補樣品。

葡萄糖標準曲線的繪制。參考郭燕菲等的方法繪制標準曲線，準確配制濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。取6支試管依次準確量入0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的上述葡萄糖標準品溶液，補水至2 mL。用苯酚-濃硫酸法在490 nm處測定其吸光度，以葡萄糖含量(mg)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，得到回歸方程為=738+0026(=0.999 1)。

多糖提取。準確稱量0.250 g骨碎補樣品，加入2.5 mL乙醇，室溫下解吸，加入熱蒸餾水10 mL等溫水浴提取后放入離心機中3 000 r/min離心30 min，取上清液測其多糖含量，根據(jù)公式(1)計算骨碎補多糖提取率。

提取率=××(××1 000)×100%

(1)

式中，為骨碎補樣品質(zhì)量(g)；為骨碎補樣品提取液定容體積(mL)；為稀釋倍數(shù)；為骨碎補多糖提取液測得吸光度代入葡萄糖標準曲線線性回歸方程計算得出的骨碎補多糖質(zhì)量(mg)；為用于測定吸光度所移取的骨碎補多糖提取液(mL)。

單因素試驗。以乙醇解吸液體積分數(shù)為40%、解吸時間為15 min、水浴提取時間為4 min、水浴提取溫度為50 ℃分別作為基礎，分別固定其他3個影響因素，按照“..”方法對骨碎補多糖進行內(nèi)部沸騰提取并計算比較多糖的提取率，研究不同乙醇解吸液體積分數(shù)、解吸時間、水浴提取溫度、水浴提取時間對多糖提取率的影響。

正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將影響提取率的4個影響因子設計成4因素3水平的正交表，再根據(jù)其排列組合進行驗證試驗。通過比較提取率和正交方差確定最佳的內(nèi)部沸騰提取骨碎補多糖的方案。

抗氧化活性試驗。

DPPH自由基清除能力的測定。取5支試管，分別加入2 mL“..”提取得到的不同濃度的骨碎補多糖溶液，在每支試管中各加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL，搖勻后置于室溫下避光靜置30 min，以無水乙醇作為空白對照，在517 nm下測定反應體系的吸光度，記為；取2 mL不同濃度骨碎補多糖溶液和2 mL無水乙醇空白對照溶液的混合液測定其吸光度，記為；測定2 mL無水乙醇空白對照溶液和0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL的混合液的吸光度，記為。以相同濃度的溶液作為陽性對照，其清除率計算公式如下：

清除率=[1-(-)/y]×100%

(2)

羥基自由基清除能力的測定。取5支試管，分別加入2 mL“..”提取得到的不同濃度的骨碎補多糖溶液，再加入2 mL的6 mmol/L的FeSO溶液和6 mmol/L的 HO溶液2 mL，使其充分混勻，靜置反應10 min，再加入2 mL 的6 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液，使其充分混勻再次靜置反應30 min，以蒸餾水作為空白對照溶液，在510 nm下測定吸光度，記為；然后以蒸餾水代替骨碎補多糖溶液重復上述步驟，在510 nm下可見分光光度計測定其吸光度，記為；以2 mL 蒸餾水代替HO溶液再次重復上述步驟，在510 nm下測定其吸光度，記為；以相同濃度的V溶液作為陽性對照，羥基自由基清除率的計算公式如下：

清除率=[1-(-)/l ]×100%

(3)

2 結(jié)果與分析

乙醇解吸液體積分數(shù)對多糖提取率的影響。從圖1可以看出，當乙醇解吸液體積分數(shù)為40%時提取率達到了峰值(5.44%)。因為內(nèi)部沸騰法的特性，浸潤骨碎補樣品的乙醇體積分數(shù)較低時，骨碎補將吸收乙醇后在后續(xù)加入熱蒸餾水并水浴提取時內(nèi)部不能形成有效的沸騰，不利于多糖的提取。而乙醇解吸液體積分數(shù)過高可能會導致某些糖類物質(zhì)不易溶解，故提取率反而下降。

圖1 不同乙醇解吸液體積分數(shù)對骨碎補多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different ethanol desorption liquid fractions on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

水浴提取時間對多糖提取率的影響。從圖2可以看出，當水浴提取時間為4 min時提取率達到了峰值(6.61%)。隨著提取時間的延長會使得其他非糖物質(zhì)也大量溶解于乙醇解吸液中，使得隨著水浴提取時間的延長骨碎補多糖的提取率反而下降。

圖2 不同水浴提取時間對骨碎補多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different water-bath extraction time on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

解吸時間對多糖提取率的影響。從圖3可以看出，解吸時間為15 min時提取率達到了峰值(9.32%)。乙醇解吸液與骨碎補樣品之間的作用時間短會導致乙醇解吸液未能完全滲透細胞壁，將骨碎補樣品內(nèi)部多糖成分充分解吸,從而使骨碎補多糖提取率未能達到峰值，解吸時間過長非糖物質(zhì)也得到了充分的解吸，影響多糖的提取率。

圖3 不同解吸時間對骨碎補多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different desorption time on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

水浴提取溫度對多糖提取率的影響。從圖4可以看出，水浴提取溫度在80 ℃時骨碎補多糖提取率達到了峰值(10.35%)。水浴溫度過高時雖然反應足夠劇烈，但是高溫會加速乙醇解吸液的揮發(fā)，并且過高的溫度會破壞骨碎補內(nèi)部的活性成分，故水浴提取溫度過高骨碎補多糖的提取率反而降低。

圖4 不同水浴提取溫度對骨碎補多糖提取率的影響Fig.4 Effect of different water-bath extraction temperatures on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

從正交試驗結(jié)果的極差(表1)可以看出，各因素對骨碎補多糖提取的影響從大到小依次為水浴提取溫度(C)>水浴提取時間(D)>解吸時間(B)>乙醇解吸液體積分數(shù)(A)。細胞內(nèi)外溫度差是內(nèi)部沸騰法提取骨碎補多糖的關鍵，溫度過低則產(chǎn)生壓力不足，溫度過高則會加速乙醇的揮發(fā)影響多糖提取率。內(nèi)部沸騰法提取骨碎補多糖的最佳提取條件為ABCD，即乙醇解吸液體積分數(shù)為50%，解吸時間為15 min，水浴提取溫度為80 ℃，水浴提取時間為4 min。

表1 內(nèi)部沸騰法提取骨碎補多糖的正交試驗結(jié)果Table 1 Orthogonal test results of extraction of Rhizoma Drynariae polysaccharide by internal boiling method

根據(jù)得出的最佳提取條件進行3次重復試驗，通過計算得出骨碎補多糖平均提取率為10.90%，相對標準偏差(RSD)為1.04%。據(jù)此可以驗證正交試驗得出的最佳提取條件的穩(wěn)定性和可重復性。所以可以確定內(nèi)部沸騰法提取骨碎補多糖的最佳提取條件為ABCD。

DPPH自由基清除能力的測定。從圖5可以看出，骨碎補多糖具有一定的DPPH自由基清除能力，其對DPPH自由基的清除率與多糖濃度相關。在多糖濃度為0.5%時，骨碎補多糖對DPPH自由基的清除率達到74.8%，而作為陽性對照的V溶液對DPPH自由基的清除率達到了82.1%，僅相差7.3百分點。

圖5 骨碎補多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of Rhizoma Drynariae polysaccharide on DPPH free radicals

羥基自由基清除能力的測定。從圖6可以看出，相比V，骨碎補多糖對羥基自由基有良好的清除能力，當多糖濃度為0.5%時，骨碎補多糖對羥基自由基的清除率達到78.3%，而作為參照標準的V對羥基自由基的清除率為84.1%，僅相差5.8百分點。表明骨碎補多糖濃度與清除率之間有較好的量效關系。

圖6 骨碎補多糖對羥基自由基的清除能力Fig.6 The scavenging ability of Drynaria polysaccharide on hydroxyl radicals

3 結(jié)論與討論

該研究通過單因素試驗和正交試驗確定了內(nèi)部沸騰提取骨碎補多糖的最佳提取方案為乙醇解吸液體積分數(shù)50%、解吸時間15 min、水浴提取溫度80 ℃、水浴提取時間4 min。并對其抗羥基自由基和DPPH自由基能力進行研究，結(jié)果顯示骨碎補多糖對羥基自由基和DPPH自由基的清除率分別達到了78.3%和74.8%，表明骨碎補多糖有良好的抗氧化能力。骨碎補作為一種傳統(tǒng)中藥材，在人體免疫疾病上有不同程度的作用。該試驗的結(jié)果顯示，骨碎補中多糖成分含量較高是其發(fā)揮藥用價值的基礎。通過多骨碎補多糖提取方法和含量的研究可以更科學地對中藥進行使用。