雙水相超聲法提取野蘑菇三萜類化合物的工藝優(yōu)化

王浩豪，王術(shù)榮 (.晉城市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西晉城 048000；.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 03080)

野蘑菇(Schaeff ex Fr.)，又名田蘑菇，屬擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)傘菌目(Agaricales)蘑菇科(Agaricaceae)蘑菇屬()，多分布于黑龍江、內(nèi)蒙古、新疆、青海、山西、西藏等地。野蘑菇的子實(shí)體中到大型，食用起來(lái)口感細(xì)嫩、味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。野蘑菇也可藥用，有驅(qū)除風(fēng)寒、舒經(jīng)活絡(luò)的奇效，是清代名藥“舒筋散”中的主要成分。近年來(lái)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)野蘑菇有抗炎、抗腫瘤、抗衰老、預(yù)防三高、保肝護(hù)肝及優(yōu)化血管神經(jīng)系統(tǒng)等作用。這與其中的三萜類化合物、多糖、多肽、多酚類等生物活性成分密切相關(guān)。

三萜類化合物(triterpenoids)大多是由30個(gè)碳原子組成的萜類化合物，少量含有27個(gè)碳原子。三萜類化合物又叫靈芝酸，廣泛存在于自然界中，有的以游離的形式存在，有的則與糖結(jié)合以苷的形式存在，又稱三萜皂苷(triterpenoid saponins)。游離的三萜可溶于有機(jī)溶劑，難溶于水。目前已從香菇、樺褐孔菌()、紫芝()、靈 芝()、茯苓()、樺褐孔菌()、粗毛纖孔菌()、紅緣擬層孔菌()等多種真菌中分離出三萜類物質(zhì)。三萜類化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等生物活性。目前常用的提取三萜類化合物的方法有回流浸提法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法和微波提取法等?；亓鹘岱ǜ鶕?jù)原料中各種成分在溶劑中的溶解程度不同進(jìn)行回流提取處理，提取程度劇烈，耗時(shí)稍長(zhǎng)。超臨界流體萃取得率較高，但成本也高，微波提取則難以規(guī)?；瘧?yīng)用。超聲波提取技術(shù)短時(shí)節(jié)能，在細(xì)胞破碎、藥用成分的分離抽提等方面有廣泛應(yīng)用。雙水相萃取技術(shù)則是通過不同成分在上下兩相溶劑中的選擇性分布來(lái)達(dá)到分離的目的，該方法可操作性強(qiáng)，可以最大程度地保持提取物質(zhì)的活性，在細(xì)胞、分子生物等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。筆者建立了一種雙水相超聲波提取并用UV法快速檢測(cè)野蘑菇菌絲體中三萜類化合物含量的簡(jiǎn)便方法，并通過單因素試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為野蘑菇的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

供試野蘑菇菌種(編號(hào)：817)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他試劑未特殊說(shuō)明均為國(guó)產(chǎn)分析純。

提取方法。將4 ℃保藏的野蘑菇菌種于25 ℃活化一段時(shí)間后，接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上。在25 ℃下培養(yǎng)10 d直至培養(yǎng)基上長(zhǎng)滿菌絲。再將菌種接種并擴(kuò)大培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，放入25 ℃恒溫?fù)u床中以120 r/min的速率培養(yǎng)11 d即得到野蘑菇菌絲體。取出菌絲體清洗過濾，置于55 ℃烘箱中干燥。烘干后的菌絲體于微型粉碎機(jī)中粉碎成粉末，備用。

取上述菌絲體粉末100 mg，加入5 mL雙水相溶劑浸提2 h，超聲一定時(shí)間，離心15 min，取上清液，即為三萜粗提液。

測(cè)定方法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 。稱取 2.0 mg白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品，用少量無(wú)水乙醇充分溶解，再加乙醇定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為40 μg/mL的白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品母液于2 mL離心管中，100 ℃沸水加熱蒸干乙醇，依次加入0.2 mL 5%香蘭素-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，充分搖晃，60 ℃金屬浴中保溫20 min后立即放入冰水中降至室溫，隨后再加入乙酸乙酯定容至5 mL，充分搖晃，靜置5～10 min，得到不同濃度的白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

以空白溶液(不加樣品加檢測(cè)試劑的空白檢測(cè)液)為參比，將白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在紫外分光光度計(jì)中550 nm處測(cè)定吸光值。平行試驗(yàn)3次。以白樺脂醇的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

三萜含量的測(cè)定。取三萜粗提液用30%乙醇定容，100 ℃水浴蒸發(fā)干粗提液中的有機(jī)溶劑，依次加入0.2 mL 5%香蘭素-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，充分搖晃均勻，在60 ℃金屬浴中保溫20 min后，放入冰水中降至室溫。再加乙酸乙酯定容至5 mL，充分搖晃，靜置5～10 min后，4 800 r/min 4 ℃離心10 min，以空白溶液作為參比，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度。按照白樺脂醇質(zhì)量與吸光值關(guān)系公式計(jì)算三萜含量，并計(jì)算三萜提取率：

三萜提取率(%)=××100

式中：為提取液中三萜的質(zhì)量濃度，mg/mL；為提取液的定容體積，mL；為菌絲體粉末的克數(shù)，mg。

單因素試驗(yàn)。

異丙醇體積濃度的確定。分別稱取100 mg菌絲體粉末樣品于離心管中，加入5 mL異丙醇(體積分?jǐn)?shù)分別為25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%)-硫酸銨(質(zhì)量濃度為0.225 g/mL)雙水相溶劑中浸泡2 h，超聲(320 W 4 ℃)提取15 min，4 800 r/min離心10 min。取上清液用30%乙醇定容，通過紫外分光光度法測(cè)定三萜含量并計(jì)算提取率，以確定最佳異丙醇體積濃度。

硫酸銨質(zhì)量濃度的確定。分別稱取100 mg菌絲體粉末樣品于離心管中，加入5 mL異丙醇(體積分?jǐn)?shù)為40%)-硫酸銨(質(zhì)量濃度分別為 0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275、0.300 g/mL)雙水相溶劑中浸泡2 h，超聲(320 W 4 ℃)提取 15 min，4 800 r/min離心10 min。取上清液用30%乙醇定容，測(cè)定三萜含量并計(jì)算提取率，以確定最佳硫酸銨質(zhì)量濃度。

超聲時(shí)間的確定。分別稱取100 mg菌絲體粉末樣品于離心管中，加入5 mL 40%異丙醇-0.225 g/mL硫酸銨雙水相溶劑中浸泡2 h，分別超聲(320 W 4 ℃)提取 10、15、20、25、30、35、40 min，4 800 r/min離心10 min，取上清液用乙醇定容，測(cè)定三萜含量并計(jì)算提取率，以確定最佳超聲時(shí)間。

提取工藝優(yōu)化。通過上述單因素試驗(yàn)，選取異丙醇體積濃度、硫酸銨質(zhì)量濃度和超聲時(shí)間3個(gè)因素3個(gè)適宜水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Minitab軟件程序進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，從而對(duì)三萜提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

以白樺脂醇的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)?；貧w方程為=0008 6-0011 9，式中，為白樺脂醇質(zhì)量(μg)，為吸光值。該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，適用于后續(xù)試驗(yàn)野蘑菇菌絲體中三萜含量的測(cè)定。

圖1 白樺脂醇吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Absorbance standard curve of betulin

異丙醇體積濃度的確定。從圖2可以看出，異丙醇體積分?jǐn)?shù)與三萜類化合物提取率的數(shù)據(jù)關(guān)系中存在一個(gè)峰值，當(dāng)異丙醇濃度在40%時(shí)，三萜提取率最高，為2.1%。由相似相溶原理可知，雙水相體系中上相40%異丙醇的極性作用與野蘑菇中三萜的極性電性相似，因此三萜提取率較高，可作為進(jìn)一步優(yōu)化三萜提取率的體積分?jǐn)?shù)。

圖2 異丙醇體積濃度對(duì)野蘑菇三萜提取率的影響Fig.2 Effect of isopropyl alcohol concentration on extraction rate of triterpenoids

硫酸銨濃度的確定。從圖3可知，選擇40%異丙醇作為有機(jī)相，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.100～0.225 g/mL時(shí)，三萜的提取率隨硫酸銨濃度的升高而增大。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度為0.225 g/mL時(shí)，三萜提取率最高；隨著硫酸銨的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，三萜的提取率又出現(xiàn)一個(gè)小的波動(dòng)，說(shuō)明上相異丙醇的極性受到非極性鹽硫酸銨濃度的影響，從而改變了三萜類化合物在其中的含量分配。

圖3 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)野蘑菇三萜提取率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate concentration on extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

超聲波時(shí)間的確定。由圖4可知，超聲波時(shí)長(zhǎng)為10～35 min 時(shí)，三萜提取率增大，說(shuō)明次生代謝產(chǎn)物溶出量隨細(xì)胞破碎而緩慢增高。到35 min，提取率達(dá)到峰值；超聲時(shí)間超過35 min，提取率反而下降，說(shuō)明超聲過長(zhǎng)可能會(huì)破壞產(chǎn)物。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)野蘑菇三萜提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnkenz中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，用Minitab軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面法各因素及水平見表1。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

回歸模型方差分析結(jié)果。以異丙醇體積濃度()、硫酸銨質(zhì)量濃度()、超聲時(shí)間()為響應(yīng)變量，以三萜提取率()為響應(yīng)值，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到多元二次回歸方程：=-4810 0+0202 5+10500 0+0073 0-0002 7-25000 0-0002 5+0002 5-0060 0，回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0999 2，擬合狀況良好，表明回歸模型方案可行。由表3可知，模型值小于0.001，說(shuō)明二次回歸模型顯著，能夠較好地反映值的變化。各因素對(duì)值的影響順序是>>>>>>>。超聲時(shí)間與超聲時(shí)間的二次項(xiàng)()、異丙醇體積濃度與超聲時(shí)間的交互項(xiàng)()對(duì)三萜提取率的影響達(dá)到極顯著水平(<0.01)，異丙醇體積濃度、硫酸銨質(zhì)量濃度、異丙醇體積濃度二次項(xiàng)、硫酸銨質(zhì)量濃度二次項(xiàng)對(duì)三萜提取率的影響達(dá)到顯著水平(<0.05)。各交互因素作用對(duì)三萜提取率的影響見圖5。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Response surface test design factor level

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Test design and results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

圖5 各因素交互作用對(duì)野蘑菇三萜提取率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface analysis of the interaction of various factors on the extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

響應(yīng)面模型條件優(yōu)化及驗(yàn)證。利用Minitab軟件對(duì)回歸方程求解，得到三萜提取最佳條件：異丙醇體積濃度45%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.175 g/mL，超聲時(shí)間35 min，該條件下的提取率為2.94%。為驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性，取異丙醇體積濃度45%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.175 g/mL，超聲時(shí)間35 min(320 W，4 ℃)，在該條件下做3次平行試驗(yàn)，3次結(jié)果的三萜提取率分別為2.83%、2.85%、2.87%，平均提取率為2.84%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為3.52%，說(shuō)明回歸方程能較真實(shí)地反映各選取因素對(duì)三萜提取率的影響，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法確定的回歸模型可靠。

3 結(jié)果與討論

該研究選用超聲輔助異丙醇-硫酸銨雙水相系統(tǒng)萃取野蘑菇中的三萜類物質(zhì)，異丙醇溶于水，硫酸銨作雙水相的下相，存在穩(wěn)定且受溫度影響程度小。在使用該方法的提取過程中，三萜在異丙醇-硫酸銨體系中處于異丙醇上相，而除此外的親水性的淀粉、蛋白質(zhì)、水溶性糖類、果膠等處于鹽水的下相中，既提取了三萜類物質(zhì)又分離純化了產(chǎn)品的成分。雙水相超聲波萃取與常規(guī)超聲提取法相比，減少了提取時(shí)長(zhǎng)，更好地保留了產(chǎn)物的完整性。該研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了二次回歸模型，同時(shí)確定雙水相超聲法提取野蘑菇三萜類化合物的最佳工藝條件為異丙醇濃度45%、硫酸銨濃度0.175 g/mL、超聲時(shí)間35 min。在該優(yōu)化條件下，野蘑菇三萜的提取率可達(dá)2.84%。經(jīng)驗(yàn)證，模型合理，能夠較好地預(yù)測(cè)雙水相超聲法提取野蘑菇三萜類的提取率，為進(jìn)一步研究野蘑菇的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值提供參考。