蜂王漿泡騰片的制備及王漿酸溶出的測定

沈 文，吳立新，劉樹興，延夢瑤

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021）

蜂王漿是一種純天然功能性食品和膳食補充劑[1]。其中10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）被認為是產(chǎn)生生物活性的重要成分之一[2]。10-HDA 作為蜂王漿特有的脂肪酸，具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抑菌抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性功能[3-7]。蜂王漿作為食品、保健食品，存在著巨大的發(fā)展前景。而10-HDA 難溶于水，造成體外溶出率低[8]，這極大地限制了蜂王漿的開發(fā)利用。

泡騰片遇水發(fā)生崩解時，酸堿反應(yīng)釋放的二氧化碳氣體促進了片劑崩解以及微粒多孔釋放系統(tǒng)的形成，促使有效成分的快速溶出[9-10]。例如，Nusrat Iqbal 開發(fā)一種印楝泡騰片可以提高印楝的釋放及其生物利用度[11]。然而，氣體的產(chǎn)生并不能改善難溶成分水溶性差、生物利用度差的問題[12]，泡騰組分在多孔體系的形成和誘導釋放效應(yīng)中僅僅起到了促進崩解與小分子擴散的基礎(chǔ)作用[13]。同時有研究指出，藥物的溶出會隨環(huán)境溫度的提高而增加[14-15]。另外，食品可添加的乳化劑降低了表面張力，從而促進固液兩相的界面潤濕性能，對難溶物質(zhì)是一種潛在的增溶介質(zhì)[16-17]。增加釋放環(huán)境溫度，添加乳化劑是提高難溶性物質(zhì)溶出率的有效途徑[18-19]。

因此，本研究采用單因素和正交試驗確定蜂王漿泡騰片的基本配方，其次，在泡騰片壓片糖配方中引入乳酸鈣、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）兩種可以溶解產(chǎn)熱的糖果用食品添加劑以及聚甘油脂肪酸酯（PGFEs）、雙乙酰酒石酸單雙甘油酯（DATEM）、蔗糖脂肪酸酯（SEs）三種乳化劑，利用其溶解放熱或表面活性來增加10-HDA 溶出度，旨在解決蜂王漿泡騰片中10-HDA 溶出率低的問題。同時，對蜂王漿泡騰片進行崩解時限、產(chǎn)氣量、XRD 及10-HDA 溶出率等質(zhì)量評價，以期改善了10-HDA 溶出度低的問題，開發(fā)出具備高10-HDA 溶出率的蜂王漿泡騰片。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10-HDA（純度≥98.0%） 上海源葉生物科技有限公司；蜂王漿凍干粉（含6%10-HDA） 西安普瑞斯生物工程有限公司；檸檬酸、NaHCO3食品級，天津市天力化學試劑公司；乳糖 食品級，北京生物科技有限公司；甘露醇 食品級，安徽山河藥用輔料股份有限公司；羅漢果甜苷 食品級，河北潤步生物科技有限公司；硬脂酸鎂 西安天正康源生物技術(shù)有限公司；乳酸鈣、CMC-Na 徐州豐瑞生物科技公司；PGFEs、DATEM、SEs 食品級，河南奧尼斯特食品有限公司；無水乙醇 分析純，天津市天力化學試劑公司。

DHG-9030 型電熱鼓風干燥箱 上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司；YD-1 單沖壓片機 北京國藥龍立科技有限公司；ZB-1 智能崩解儀 天津天大天發(fā)科技有限公司；Smart Lab 9kW X 射線衍射儀 日本理學Rigaku 公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 10-HDA 標準曲線的制作 準確稱取10-HDA 0.01 g 置于100 mL 容量瓶中，加1 mL 去離子水，以無水乙醇定容到100 mL，配制得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的儲備液。分別取儲備液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL 定容到50 mL，得到濃度分別為1、2、3、4、5、6 μg/mL 的標準溶液。在218 nm 吸收波長下，測定上述標準溶液的吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并通過最小二乘法擬合出線性回歸方程。本研究所得10-HDA 的標準曲線方程為：y=0.1915x+0.0007，R2=0.9996。其中x 表示10-HDA 溶液的濃度，y 表示10-HDA 溶液在218 nm 處的吸光度值。

1.2.2 蜂王漿泡騰片的制備 濕法制粒，采用酸堿分開制粒的方法，將檸檬酸、NaHCO3分別與其他原輔料混合均勻，以80%乙醇作為粘合劑制粒，分別制成酸粒和堿粒。隨后將制好的濕顆粒放入65oC 的烘箱中干燥后取出，整粒，加入硬脂酸鎂混合均勻后壓片，調(diào)節(jié)片重400 mg，硬度3～4 kg[20]。

1.2.3 蜂王漿泡騰片單因素實驗

1.2.3.1 泡騰劑的添加量 選取泡騰劑添加量因素水平為30%、35%、40%、45%、50%，固定泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）=2:1，蜂王漿凍干粉添加量為10%（含6%10-HDA），甘露醇添加量為10%，羅漢果甜苷添加量0.8%，硬脂酸鎂添加量為0.8%，剩余為乳糖。以泡騰片的崩解時間及產(chǎn)氣量為指標確定泡騰劑的添加量。

1.2.3.2 泡騰劑比例 選取泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）因素水平為2.5:1、2:1、1.5:1、1:1.5、1:2，固定泡騰劑添加量為45%，蜂王漿凍干粉添加量為10%，甘露醇添加量為10%，羅漢果甜苷添加量0.8%，硬脂酸鎂添加量為0.8%，剩余為乳糖。以泡騰片的崩解時間及產(chǎn)氣量為指標確定泡騰劑最優(yōu)比例。

1.2.3.3 甜味劑的添加量 選取羅漢果甜苷添加量因素水平為0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%，固定泡騰劑添加量為45%，泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）=1.5:1，蜂王漿凍干粉添加量為10%，甘露醇添加量為10%，硬脂酸鎂添加量為0.8%，剩余為乳糖。以泡騰片的崩解時間及產(chǎn)氣量為指標確定泡騰劑的添加量。

1.2.4 蜂王漿泡騰片配方的正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以崩解時間、產(chǎn)氣量作為評定指標，以泡騰劑添加量（A）、泡騰劑比例（B）及甜味劑添加量（C）為考察因素，進行L9（34）正交試驗，因素水平見表1。

表1 泡騰片配方優(yōu)化正交試驗設(shè)計Table 1 Design of orthogonal tests for the formula optimization of effervescent

1.2.5 具有放熱性能的食品添加劑的考察

1.2.5.1 不同食品添加劑的選擇 固定蜂王漿凍干粉添加量為10%，泡騰劑添加量為45%，泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）=1.5:1，甘露醇添加量為10%，羅漢果甜苷添加量為1%，硬脂酸鎂添加量為0.8%，分別加入添加量為10%的乳酸鈣和添加量為10%的CMC-Na，剩余以乳糖填充。以泡騰片中10-HDA 的溶出率為指標進行考察篩選。

1.2.5.2 乳酸鈣的添加量 固定蜂王漿凍干粉添加量為10%，泡騰劑添加量為45%，泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）=1.5:1，甘露醇添加量為10%，羅漢果甜苷添加量為1%，硬脂酸鎂添加量為0.8%，選取乳酸鈣添加量因素水平為5%、8%、10%、12%、15%，剩余以乳糖填充。以泡騰片中10-HDA 的溶出率為指標進行考察篩選。

1.2.6 乳化劑的考察

1.2.6.1 不同乳化劑的選擇 固定蜂王漿凍干粉添加量為10%，泡騰劑添加量為45%，泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）=1.5:1，甘露醇添加量為10%，羅漢果甜苷添加量為1%，硬脂酸鎂添加量為0.8%，分別加入添加量為0.5%的PGFEs、1%的DATEM 和1%的的SEs，剩余以乳糖填充。以泡騰片中10-HDA的溶出率為指標進行考察篩選。

1.2.6.2 聚甘油脂肪酸酯的添加量 固定蜂王漿凍干粉添加量為10%，泡騰劑添加量為45%，泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）=1.5:1，甘露醇添加量為10%，羅漢果甜苷添加量為1%，硬脂酸鎂添加量為0.8%，PGFEs 添加量因素水平為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，剩余以乳糖填充。以泡騰片中10-HDA 的溶出率為指標進行考察篩選。

1.2.7 蜂王漿泡騰片的表征

1.2.7.1 崩解時間的測定 按照《中國藥典》片劑的崩解時限檢查法。測定時，取6 個片劑置于吊籃玻璃管中，于37±1 ℃的恒溫水，按每分鐘30～32次作上下移動，觀察崩解情況，片劑完全通過篩網(wǎng)，篩網(wǎng)上不應(yīng)有殘留顆粒，記錄崩解時間[21]。

1.2.7.2 產(chǎn)氣量的測定 取25 mL 具塞刻度試管，精密加入10 mL 水后，25 ℃恒溫水浴5 min 后，投入一片泡騰片，閉塞10 min，觀察并記錄最大產(chǎn)氣體積[22]。

1.2.8 10-HDA 累積溶出率的測定 取6 片蜂王漿泡騰片于崩解儀中，按照溶出度測定方法，以200 mL水為介質(zhì)，分別在1、3、5、10、15、20 min 取樣0.1 mL，并補充水0.1 mL，將取出的樣品用無水乙醇稀釋至10 mL，混勻后靜置5 min，然后5000 r/min，離心15 min。取上清液，于吸收波長處測定樣品的吸光度，計算10-HDA 含量及溶出度[23-24]。

1.2.9 XRD 表征 將樣品碾碎成粉末放入XRD 薄膜池，以CuKα（λ=0.154 nm）作激發(fā)射線，以30°/min的掃描速度將樣品在5°～60°（2θ掃描角度范圍）內(nèi)掃描，得到X 射線衍射圖譜[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均為3次重復實驗結(jié)果的平均值，結(jié)果表示為平均值及標準差。采用Origin 9.1 軟件作圖，正交設(shè)計助手v3.1 進行正交試驗數(shù)據(jù)處理，采用MDI Jade 6.5 軟件計算結(jié)晶度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂王漿泡騰片單因素實驗

2.1.1 泡騰劑的添加量對泡騰片崩解時間及產(chǎn)氣量的影響 如圖1所示，隨著泡騰劑添加量的增加，產(chǎn)氣量逐漸增加，蜂王漿泡騰片的崩解時間先減小后增大。與泡騰劑添加量為40%和50%相比，當泡騰劑添加量為45%時，顯著縮短了崩解時間（P＜0.05），而當泡騰劑添加量為30%、35%、40%時，其產(chǎn)氣量顯著低于泡騰劑添加量為45%的產(chǎn)氣量（P＜0.05）。增加泡騰片中泡騰劑的量可以縮短崩解時間，這是可以預見的，因為檸檬酸和NaHCO3之間的反應(yīng)將通過產(chǎn)生二氧化碳氣泡形式的泡騰，幫助泡騰片快速崩解[12]。但是當泡騰劑添加量大于45%時，泡騰片崩解時間反而延長。王文寶等[22]在研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，當猴頭菇泡騰片泡騰劑總量超過45%時，泡騰片的崩解時間并沒有縮短反而會延長。因此，本實驗確定泡騰劑的添加量為45%。

圖1 泡騰劑添加量對泡騰片的影響Fig.1 Effect of effervescent agent on effervescent tablets

2.1.2 泡騰劑比例對泡騰片崩解時間及產(chǎn)氣量的影響 從圖2 可以看到隨著檸檬酸添加比例的減少，泡騰片崩解時間逐漸變大，產(chǎn)氣量也越來越少。泡騰劑比例處于1:1.5 時的崩解時間顯著低于泡騰劑比例為1:2 的崩解時間（P＜0.05）；與泡騰劑比例為1:1.5 相比，泡騰比例為1.5:1 也顯著縮短了崩解時間（P＜0.05）；同時，當泡騰劑比例為1:1.5 時，產(chǎn)氣量也顯著低于泡騰劑比例為2.5:1、2:1、1.5:1 的產(chǎn)氣量（P＜0.05）。但是檸檬酸容易吸濕，使用量過多時，泡騰片在制備過程中容易黏沖，不易成型，成型后的泡騰片表面色澤不均一[26]。當泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）達到1.5:1 時，泡騰片產(chǎn)氣效果好，崩解時間較短。故綜合考慮后，本實驗確定泡騰劑比例（檸檬酸:NaHCO3）為1.5:1。

圖2 泡騰劑比例對泡騰片的影響Fig.2 Effect of effervescent agent ratio on effervescent tablets

2.1.3 甜味劑的添加量對泡騰片崩解時間及產(chǎn)氣量的影響 從圖3 可以明顯看到，甜味劑的改變對于蜂王漿泡騰片的崩解時間、產(chǎn)氣量并沒有較明顯的影響，其中崩解時間及產(chǎn)氣量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但是當羅漢果甜苷加入較少時，泡騰片過酸，無法掩蓋蜂王漿酸澀口感，加入較多泡騰片過于甜膩，在其添加量為1%時，可獲得最適宜的口感。因此，本實驗確定甜味劑羅漢果甜苷的添加量為1%。

圖3 甜味劑添加量對泡騰片的影響Fig.3 Effect of sweetener addition on effervescent tablets

2.2 泡騰片配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果

2.2.1 正交試驗結(jié)果與分析 結(jié)果見表2～表4。分析結(jié)果可知，各因素對泡騰片崩解時間及產(chǎn)氣量影響的主次順序為B＞A＞C。其中，泡騰劑添加量（A）和泡騰劑比例（B）對泡騰片崩解時間及產(chǎn)氣量的影響顯著，結(jié)合直觀分析結(jié)果選取A2、B2水平，甜味劑添加量（C）水平任選。為了保證泡騰片口感較好，選定C2水平。最終確定蜂王漿泡騰片的最佳配方為A2B2C2，即泡騰劑添加量45%，泡騰劑比例為1.5:1，甜味劑添加量為1%。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表4 產(chǎn)氣量分析結(jié)果Table 4 Gas production analysis results

2.2.2 驗證試驗 按照最佳配方進行驗證試驗，平行3次，并測定其崩解時間、產(chǎn)氣量。結(jié)果見表5。該結(jié)果表明采用最佳配方制備的泡騰片，崩解時間快，且產(chǎn)氣量較高，條件穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

表3 崩解時間分析結(jié)果Table 3 Disintegration time analysis results

表5 驗證試驗結(jié)果Table 5 Verify the results of the experiment

2.3 食品添加劑的考察

2.3.1 不同食品添加劑對10-HDA 溶出的影響 如圖4所示，明顯看出蜂王漿泡騰片中10-HDA 的累積溶出率高于普通蜂王漿片，加入這兩種食品添加劑后，10-HDA 的溶出度有了一定的改善。這是因為，在溶解釋放系統(tǒng)中，主要是通過擴散來控制10-HDA 的釋放，最初是從泡騰片的表面突然釋放，隨后是源于泡騰片內(nèi)部更深處的釋放，所以不同蜂王漿片前期10-HDA 的溶出率并沒有較大差異，主要取決于后期的溶出。這對于普通泡騰片來說，溶出速率會大大降低。而加入這兩種食品添加劑后，促使更多10-HDA 小分子溶解。也有研究表明，溫度的升高加劇了各分子運動的速度和程度，對難溶物的溶解度有促進作用[27-28]。但是，可以看出乳酸鈣要比CMCNa 的增溶效果更好，這是因為CMC-Na 在溶解過程中會產(chǎn)生局部凝膠[29]，凝膠的存在會將10-HDA 分子包裹，反而降低了其溶出率。因此，本實驗確定通過加入一定量的乳酸鈣來改善蜂王漿泡騰片中10-HDA 的溶出率。

圖4 不同食品添加劑對蜂王漿泡騰片10-HDA 溶出率的影響Fig.4 Effects of different food additives on the dissolution rate of 10-HDA in royal jelly effervescent tablets

2.3.2 乳酸鈣的添加量對10-HDA 溶出的影響 在水中加入不同量的乳酸鈣，水的溫差變化見表6，乳酸鈣在水中溶解的過程中會發(fā)生水合作用[30]，在這一過程會釋放大量的熱量[31]。由圖5可知，在所有乳酸鈣的添加范圍內(nèi)，明顯增強了蜂王漿泡騰片中10-HDA 的累積溶出率，且隨乳酸鈣添加量的增加10-HDA 溶出率越大。乳酸鈣用量越大，溫度的升高就越多，其增溶效果越明顯。但在食品中，乳酸鈣常用作一種補鈣劑，在水中溶解度較小，用量過多的話，不利于泡騰片的口感以及溶解效果，不適合大量使用。因此，將乳酸鈣的添加量控制在10%～15%左右。

表6 加入不同量乳酸鈣的水溶液溫差變化Table 6 Changes in temperature difference of aqueous solutions with different amounts of calcium lactate

圖5 不同乳酸鈣添加量對蜂王漿泡騰片10-HDA溶出率的影響Fig.5 Effects of different calcium lactate addition on the dissolution rate of 10-HDA in royal jelly effervescent tablets

2.4 乳化劑的考察

2.4.1 不同乳化劑對10-HDA 溶出的影響 如圖6，在蜂王漿泡騰片中加入乳化劑后明顯提高了10-HDA 的溶出度。這是因為，乳化劑是一種兩親性的物質(zhì)，對油或水具有親和力。乳化劑的結(jié)構(gòu)中含有羥基等親水性自由基，這類自由基與水相互作用后，會降低泡騰片與水接觸表面的張力，幫助更多的水保留在泡騰片內(nèi)部[32]。同時，也有研究表明，在乳化過程中，乳化劑通過膠束增溶作用直接與難溶性物質(zhì)相互作用，從而提高了難溶成分溶解性[33]。另外，圖6中可以明顯看出，三種乳化劑中PGFEs 相比與于DATEM 和SEs 的增溶效果更好一些，這可能是因為PGFEs 具有更多的親水性羥基，所以表現(xiàn)出更好的乳化作用[34]。因此，本實驗確定以添加PGFEs 的方式來改善蜂王漿泡騰片中10-HDA 的溶出率。

圖6 不同乳化劑對蜂王漿泡騰片10-HDA 溶出率的影響Fig.6 Effects of different emulsifiers on the dissolution rate of 10-HDA in royal jelly effervescent tablets

2.4.2 PGFEs 的添加量對10-HDA 溶出的影響 由圖7可知，蜂王漿泡騰片中10-HDA 累積溶出率的大小依賴于PGFEs 的使用量。PGFEs 具有優(yōu)異的乳化效果，在所有PGFEs 添加量下，都增強了蜂王漿泡騰片中10-HDA 的溶出率。在PGFEs 添加量為0.5%時，蜂王漿泡騰片表現(xiàn)出最佳10-HDA 的溶出效果。

圖7 PGFEs 添加量對蜂王漿泡騰片10-HDA 溶出率的影響Fig.7 Effect of PGFEs addition on 10-HDA dissolution rate of royal jelly effervescent tablets

2.5 XRD 表征

通常，結(jié)晶度高的樣品顯示出一系列尖且窄的衍射峰，而那些沒有明顯衍射峰的樣品則認為是無定形產(chǎn)物。從圖8 中明顯看出，蜂王漿泡騰片衍射圖譜中有很多的特征峰，并且峰面窄。三種蜂王漿泡騰片的結(jié)晶度都比較高，尤其是蜂王漿泡騰片的結(jié)晶度高達53.38%。而加入PGFEs 的蜂王漿泡騰片結(jié)晶度略低，可能是因為PGFEs 具有優(yōu)異的乳化效果和結(jié)晶調(diào)節(jié)能力[34]。但是，通過測定不同配方蜂王漿泡騰片中10-HDA 的溶出率，結(jié)果表明在泡騰片中高結(jié)晶度對10-HDA 的溶出率影響并不大。

圖8 不同蜂王漿片的XRD 圖Fig.8 XRD patterns of different royal jelly tablets

3 結(jié)論

本文通過單因素和正交試驗得到高10-HDA 溶出率的蜂王漿泡騰片最佳配方，在此配方中泡騰劑質(zhì)量比（檸檬酸:NaHCO3）為1.5:1 時，泡騰片崩解時間最短。在此基礎(chǔ)上以添加乳酸鈣溶解放熱和乳化劑增加表面活性為策略，促進10-HDA 的溶出。結(jié)果表明在配方中分別加入15%的乳酸鈣或0.5%的PGFEs，得到的蜂王漿泡騰片中10-HDA 的累計溶出率在15 min 左右均可以達到85%以上。相對于空白組普通蜂王漿泡騰片中10-HDA 69%的溶出率來說，采用本研究策略制備的蜂王漿泡騰片表現(xiàn)出更高的10-HDA 溶出程度。這為如何提高蜂王漿相關(guān)產(chǎn)品中10-HDA 溶出率提供了數(shù)據(jù)參考。